单体化合物CiliatosideA在制备乙型肝炎治疗药物中的用途

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及单体化合物ciliatosidea在制备乙型肝炎治疗药物中的用途。

背景技术：

病毒性肝炎在我国被列为乙类传染病，在引起肝炎的病毒中，乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)是最常见的一种。hbv属于嗜肝dna病毒科，是目前已知感染人类最小的dna病毒。尽管人们已经可以获取安全有效的疫苗超过30年，hbv感染仍然是主要的世界卫生负担。乙型肝炎定义为乙型肝炎病毒持续感染超过6个月以上，乙型肝炎呈世界性流行，据世界卫生组织统计，全球有约2.57亿乙型肝炎感染者，每年因hbv感染而死亡的人数约887,000人。目前用于治疗乙肝的药物主要为核苷类似物和干扰素，核苷类似物可以显著地降低病毒血症，但长期服药后易导致耐药。而干扰素因其反应性低、耐受性差不能广泛用于临床。而且这两类药物很难实现乙肝“功能性治愈”，即在有限的疗程内清除乙肝表面抗原。因此发展乙肝治愈性药物，仍就是目前亟待解决的问题。

在人类长期同疾病作斗争的过程中，中药发挥着举足轻重的作用，其在治疗各种疾病中均有报道。而中药的成分十分复杂，利用现代成熟的分离技术实现有效成分的分离，将为人类发掘中药宝库开拓更广阔的视野。利用超高效液相色谱及电喷射离子化飞行质谱分析，以及核磁共振鉴定等方法，发明人从中药粗提物中分离出了高纯度的单体化合物ciliatosidea(简称c6,c36h40o19)。目前有研究报道，ciliatosidea分离于一种爵床科植物，在体外具有抗炎作用。但关于ciliatosidea的抗病毒作用目前尚未见有报道。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供单体化合物ciliatosidea在制备乙型肝炎治疗药物中的用途，本发明首次发现并验证了单体化合物ciliatosidea(简称c6,c36h40o19)具有显著的抗hbv作用，有望发展为乙肝治愈性药物。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供单体化合物ciliatosidea作为有效成分用于制备乙型肝炎治疗药物中的用途。

ciliatosidea的化学分子式为c36h40o19，化学结构式为：

进一步，所述乙型肝炎治疗药物至少具有以下功用之一：抑制肝癌细胞内hbsag水平，抑制肝癌细胞内hbvrnas水平，抑制肝癌细胞内hbvdna水平。

进一步，所述肝癌细胞选自hepg2.2.15、hepg2-ntcp细胞中的至少一种。

进一步，所述乙型肝炎治疗药物必然包括单体化合物ciliatosidea，并以单体化合物ciliatosidea作为前述功用的有效成分。

进一步，所述乙型肝炎治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为单体化合物ciliatosidea，亦可包含其他可起到类似功用的分子。

进一步，所述单体化合物ciliatosidea为所述乙型肝炎治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

进一步，所述乙型肝炎治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

进一步，所述乙型肝炎治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

进一步，所述乙型肝炎治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

本发明第二方面提供一种乙型肝炎治疗药物，包括安全有效剂量的单体化合物ciliatosidea。

进一步，所述单体化合物ciliatosidea为所述乙型肝炎治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

进一步，所述治疗乙型肝炎的药物制剂还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

进一步，所述治疗乙型肝炎的药物制剂中，必然包括单体化合物ciliatosidea，并以单体化合物ciliatosidea作为前述功用的有效成分。

进一步，所述治疗乙型肝炎的药物制剂中，发挥前述功用的有效成分可仅为单体化合物ciliatosidea，亦可包含其他可起到类似功用的分子。

进一步，所述单体化合物ciliatosidea作为所述治疗乙型肝炎的药物制剂的有效成分之一或唯一有效成分。

进一步，所述治疗乙型肝炎的药物制剂可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

进一步，所述治疗乙型肝炎的药物制剂的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

进一步，所述治疗乙型肝炎的药物制剂主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

本发明第三方面提供一种治疗乙型肝炎的方法，为向对象施用单体化合物ciliatosidea。

进一步，所述对象可以为哺乳动物或哺乳动物的乙型肝炎细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。所述乙型肝炎细胞可以为离体乙型肝炎细胞。

进一步，所述对象可以是罹患乙型肝炎的患者或者期待治疗的乙型肝炎的个体。或者，所述对象为乙型肝炎患者或者期待治疗乙型肝炎的个体的乙型肝炎细胞。

进一步，所述单体化合物ciliatosidea可以在接受乙型肝炎治疗前、中、后向对象施用。

本发明第四方面提供一种乙型肝炎治疗药物组合，包括安全有效剂量的单体化合物ciliatosidea和至少一种其他乙型肝炎治疗药物，余量为药学上可接受的载体和/或辅料。

进一步，所述乙型肝炎治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

(一)将单体化合物ciliatosidea和其他乙型肝炎治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。

当其他乙型肝炎治疗药物为抗体时，一般采用胃肠外给药型。当其他乙型肝炎治疗药物为化学药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。

(二)将单体化合物ciliatosidea和其他乙型肝炎治疗药物配置成复方制剂，在将单体化合物ciliatosidea和其他乙型肝炎治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。

本发明第五方面提供一种治疗乙型肝炎的方法，为向对象施用有效量的单体化合物ciliatosidea以及向对象施用有效量的其他乙型肝炎治疗药物和/或向对象实施其他乙型肝炎治疗手段。

进一步，可以同步地或顺序地给予有效剂量的单体化合物ciliatosidea和至少一种有效剂量的其他乙型肝炎治疗药物。

基于单体化合物ciliatosidea为本发明首次发现的乙型肝炎治疗药物，在与单体化合物ciliatosidea以外的其他乙型肝炎治疗药物联合用药中，至少可以起到疗效相加的效果，进一步增强对于乙型肝炎的治疗作用。

进一步，其他的乙型肝炎治疗药物包括但不限制于：抗体药物、化学药物或靶向型药物等。

进一步，所述单体化合物ciliatosidea可以是胃肠道给药或者胃肠外给药，所述其他乙型肝炎治疗药物可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。对于抗体药物，一般采用胃肠外给药。

本发明第六方面提供单体化合物ciliatosidea在制备具有以下任一项或多项作用的物质中的用途：

用于制备抑制肝癌细胞内hbsag水平的物质的用途，用于制备抑制肝癌细胞内hbvrnas水平的物质的用途，用于制备抑制肝癌细胞内hbvdna水平的物质的用途。

如上所述，本发明的单体化合物ciliatosidea在制备乙型肝炎治疗药物中的用途，具有以下有益效果：

本发明首次发现并验证了单体化合物ciliatosidea的抗hbv作用，体外实验证实单体化合物ciliatosidea能够显著抑制hepg2.2.15，hepg2-ntcp等肝癌细胞内hbsag，hbvrnas及hbvdna水平；进一步进行体内实验发现，单体化合物ciliatosidea可以显著抑制小鼠血清及肝组织hbvdna等指标。因此，本发明首次发现单体化合物ciliatosidea具有显著的抗hbv的作用，有望发展为乙肝治愈性药物，在乙肝治疗方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1显示为本发明的单体化合物ciliatosidea(简称为c6)的分子结构式。

图2显示为本发明实施例中mtt实验检测c6细胞毒性的实验结果图。

图3显示为本发明实施例中c6抑制上清hbsag分泌ec50值。

图4显示为本发明实施例中elisa检测hepg2.2.15细胞中hbsag、hbeag分泌水平。

图5显示为本发明实施例中westernblotting检测细胞内hbsag水平。

图6显示为本发明实施例中real-timepcr检测c6对hbvrna的影响结果图。

图7显示为本发明实施例中northernblotting验证c6对hbvrna的影响结果图。

图8显示为本发明实施例中定量pcr检测hepg2.2.15细胞中c6对hbvdna的影响结果图。

图9显示为本发明实施例中hepg2-ntcp细胞中检测c6对hbsag,hbeag分泌水平的影响结果图。

图10显示为本发明实施例中real-timepcr检测c6处理后hbvrna的水平。

图11显示为本发明实施例中c6处理10d后检测hepg2-ntcp细胞中hbvrna及hbvdna水平。

图12显示为本发明实施例中小鼠处理流程图。

图13显示为本发明实施例中检测c6对血清中hbsag、hbvdna水平的影响结果图。

图14显示为本发明实施例中检测c6对肝组织中hbvrna水平的影响结果图。

图15显示为本发明实施例中检测c6对肝组织hbvdna水平的影响结果图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

利用超高效液相色谱及电喷射离子化飞行质谱分析，以及核磁共振鉴定等方法，本发明的发明人从中药(一种爵床科植物)粗提物中分离出了高纯度的单体化合物ciliatosidea(简称c6,c36h40o19)，其分子结构式如图1所示。经检索对比发现，本发明提取到的单体化合物ciliatosidea与现有的研究报道中的化合物ciliatosidea化学结构式相同，因此，其提取方法就不在此过多赘述。目前的研究报道发现，ciliatosidea可从爵床科植物中分离得到，其在体外具有抗炎作用；但关于ciliatosidea的抗病毒作用目前尚未见有报道。

本发明首次经体外实验和体内实验发现并验证了单体化合物ciliatosidea的抗hbv作用，因此，本发明提出可将单体化合物ciliatosidea用于在乙型肝炎治疗，为乙肝的治疗提供新的选择。

基于此，本发明提供了以单体化合物ciliatosidea作为有效成分用于制备乙型肝炎治疗药物。通常，所述乙型肝炎治疗药物除了包括安全有效剂量的单体化合物ciliatosidea外，根据不同药物剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。

“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

“药学上可接受的载体或辅料”应当与单体化合物ciliatosidea相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。

另外，本发明还提供一种乙型肝炎治疗药物组合和施用方法，所述乙型肝炎治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

(一)将单体化合物ciliatosidea和其他慢性乙肝型肝炎治疗药物分别独立的制剂，制剂的剂型可相同或者不同，给药途径亦可相同或不同。使用时，可几种药同时使用，也可几种药先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对机体有效的期间内向机体施加其他药物。

当其他乙型肝炎治疗药物为抗体时，一般采用胃肠外给药型，如静脉注射、静脉滴注或动脉灌注。其用法用量可参考现有技术。

当其他乙型肝炎治疗药物为化学药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药，亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。

(二)将单体化合物ciliatosidea和其他慢性乙肝型肝炎治疗药物配制成复方制剂，将单体化合物ciliatosidea和和其他慢性乙肝型肝炎治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配制成复方制剂的形式。

需要注意的是，本发明中的联合用药是指合理的联合用药，应以提高疗效和(或)降低不良反应为基本原则。联合用药时，药物的相互作用，应包括影响药动学的相互作用，应包括影响药效学的相互作用。联合用药时，应尽量减少用药种类，减少药物相互作用引起的药物不良反应，避免影响药物疗效或增加毒性，避免产生相反的结果。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。

以下实施例中，单体化合物ciliatosidea简称为c6。

本发明的具体实验过程如下：

1、药物处理

1.1、药物毒性检测(mtt实验)

将1.5×10⁴hepg2.2.15细胞接种于96孔板中，24小时后，将c6(储存浓度20mm)进行倍比稀释(200、100、50、25、12.5、6.25、3.1、1.6μm)，以无药处理组为对照，纯培养基为空白，每个浓度3个复孔。系列药物浓度处理细胞72小时后，每孔加入10μl5mg/mlmtt试剂，避光孵育4小时。弃上清后，每孔加入100μldmso，振荡混匀后于490nm波长检测od值，计算cc50值。

1.2、稳定复制模型hepg2.2.15细胞中检测c6对hbsag分泌的影响

1.2.1、将12×10⁴hepg2.2.15细胞接种于二十四孔板，24小时后，配制50、25、12.5、6.25、3.1、1.6、0.78、0.39、0μmc6溶液，每孔分别加500μl上述溶液。72小时后，收集细胞上清，用elisa的方法检测hbsag，选择能有效抑制hbsag水平的c6浓度(2.5μm、5μm)用于后续实验。

1.2.2、将24×10⁴hepg2.2.15细胞接种于十二孔板，24h后，配制0、2.5、5μmc6溶液，以25nm恩替卡韦(etv)作为对照，每孔分别加1ml上述溶液，分别于药物处理3d、6d、9d后收集细胞上清，用elisa的方法检测hbsag及hbeag。

1.3、稳定复制模型hepg2.2.15细胞中检测c6对细胞内hbsag，hbvrna的影响

将24×10⁴hepg2.2.15细胞接种于十二孔板，24小时后，配制0、2.5、5μmc6溶液，以25nmetv作为对照，每孔分别加1ml上述溶液，分别于药物处理3d、6d、9d后提取细胞蛋白及细胞内rna，采用westernblotting检测细胞内hbsag水平，并通过real-timepcr和northernblotting检测3.5-kbrna，totalhbvrnas水平。

1.4、hbv感染细胞模型hepg2-ntcp中检测c6的抗病毒效能

将22×10⁴hepg2-ntcp细胞接种于十二孔板,24小时后更换感染培养基(10％fbs,1％p/s，2％dmso，1％l-谷氨酰胺)，感染培养基中孵育24小时后感染病毒。配制1×10³geq/cell病毒悬液(含5％peg8000)，24小时后以pbs洗涤3次后，配制不同浓度的c6溶液处理细胞10d。

1.5、构建的重组cccdna小鼠模型中检测c6的抗病毒效能

1.5.1、重组cccdna小鼠模型的构建

选取体重接近(20±2.0g)的雄性c57bl/6小鼠若干只，每只小鼠采用高压水动力尾静脉注射质粒cre和prcccdna各4μg。一周后眼眶取血检测血清hbvdna水平。

1.5.2、重组cccdna小鼠模型药物处理及指标检测

将构建成功的小鼠随机分为对照组(vehicle)、处理组(c6)及联合用药组(c6+etv)。腹腔注射0.5mg/kgc6及生理盐水，恩替卡韦灌胃，每两天给药一次，每四天眼眶采血，分离血清后检测血清hbvdna及hbsag水平。药物处理20天后处死小鼠，取肝制作组织切片检测hbsag水平，研磨肝组织检测hbvrnas、hbvdna水平。

2、hbv病毒学指标检测

2.1、药物毒性检测(mtt实验)

将1.5×10⁴hepg2.2.15细胞和1.5×10⁴hepg2-ntcp细胞分别接种于96孔板中，以系列药物浓度处理72小时，每孔加入10μl5mg/mlmtt试剂，避光孵育4小时后弃上清，每孔加入100μldmso。振荡混匀后，于490nm波长处检测吸光度值，并计算cc50值。

2.2、elisa实验

hepg2.2.15及hepg2-ntcp细胞中检测c6对hbv抗原分泌的影响：收集c6处理后的细胞上清，2,000g×3min离心去除细胞碎片，按照酶联免疫吸附试验试剂盒(上海科华)操作说明，于450nm检测细胞培养上清中hbsag和hbeag的od值。

2.3、westernblotting实验

pbs洗涤细胞后，加入ripa(含pi)裂解液裂解细胞，采用bca法测定蛋白浓度，取30μg蛋白用于sds-page凝胶电泳。膜用5％脱脂牛奶封闭后，4℃孵育抗-hbs抗体(novus，1：2000)过夜。室温孵育相应二抗后，在膜上滴加ecl化学发光试剂，于暗室进行曝光。

2.4、细胞hbvrna提取

pbs清洗细胞2次，加入1mltrnzol裂解液，混匀后，加入200μl氯仿，vortex后，13,000rpm×10min4℃离心，吸取上清，加入等体积异丙醇后13,000rpm×10min4℃离心进行沉淀，去除上清后，加入75％乙醇洗涤沉淀，13,000rpm×10min4℃离心后，去除上清并干燥rna沉淀，加水溶解，测浓度后使用tiangen公司fastkingrtkit逆转录rna合成cdna。

2.5、小鼠血清hbvdna提取

使用病毒基因组dna提取试剂盒(tiangen)，取一无酶的ep管，加入20μl的蛋白酶k，每管加入10μl血清，以生理盐水补齐至总体积200μl。最后加入200μlcarrierrna工作液，涡旋混匀，置于56℃水浴15min。经过一系列离心吸附柱洗涤后，加入20μl无酶水。将提取的dna放置于-40℃或用于pcr测定。

2.6、小鼠肝组织hbvdna，hbvrna提取

分离小鼠肝脏，并于液化氮中将组织块碾磨粉碎，称取约20mg组织于1.5ml离心管中，分别用于dna和rna的提取。

2.6.1、肝组织hbvdna提取

向离心管中加入0.5ml裂解液(10mmtris-hclph8.0，1mmedta，1％np-40，2％sucrose)，组织匀浆后，37℃孵育15min后，15000g离心5min。转移上清，并加入40u/mldnasei和10mmmgcl2，37℃孵育4h后加入200μl35％peg8000(含1.5mol/lnacl)，冰浴1h后11,000g×10min4℃离心，弃上清，加入0.5ml蛋白酶k消化液(0.5％sds，150mmnacl，25mmtris-hclph8.0，10mmedta)和0.5mg/ml蛋白酶k(promega)，45℃水浴过夜。次日等体积酚氯仿抽提，70％乙醇沉淀，te缓冲液溶解hbvdna。

2.6.2、肝组织hbvrna提取

取约20mg碾磨后的组织，加入1mltrnzol裂解液，使用小型分散机(t10basic)辅助裂解，混匀后，加入200μl氯仿，vortex后，13,000rpm×10min4℃离心，吸取上清，加入等体积异丙醇13,000rpm×10min4℃离心进行沉淀，去除上清后，加入75％乙醇洗涤沉淀，13,000rpm×10min4℃离心后，去除上清并干燥rna沉淀，加水溶解，测浓度后使用tiangen公司fastkingrtkit逆转录rna合成cdna。

2.7、real-timepcr

检测hbvdna：提取hbvdna后，按照sybrgreen(roche,germany)说明书配制反应体系和设置反应条件，hbvdna引物，f：cctagtagtcagttatgtcaac，r:tctataagctggaggagtgcga。每个样品均设3个复孔，每组实验重复3次。

检测hbvrna:逆转录rna合成的cdna，按照sybrgreen(bio-rad)说明书配制反应体系和设置反应条件，hbv3.5-kbrna引物为f:ctcttccagccttccttcct，r:agcactgtgttggcgtacag，totalhbvrnas引物为f:accgaccttgaggcatactt，r:gcctacagcctcctagtaca。每个样品均设3个复孔，每组实验重复3次。

3、统计学方法

采用spss19.0软件进行统计，两组间比较采用配对t检验和多组间比较采用单因素方差分析，以p<0.05为差异具有统计学意义。

4、研究结果

4.1、细胞毒性检测

如图2所示，mtt实验显示c6在hepg2.2.15及hepg2-ntcp细胞中的cc50值大于200μm，这表明c6在这两种细胞系中无明显细胞毒性。

4.2、hepg2.2.15细胞中检测c6对抗原分泌的影响

以系列浓度c6处理hepg2.2.15细胞，检测hbsag分泌水平，计算其ec50值为3.36μm，结果如图3所示。由图3可知，在药物处理3d、6d、9d后，收集细胞上清采用elisa检测hbsag和hbeag水平，实验结果表明(图4)，与对照相比，c6呈时间、浓度依赖性降低上清hbsag及hbeag水平。

4.3、hepg2.2.15细胞内检测c6对细胞内hbsag及hbvrna的影响

裂解细胞后提取蛋白，westernblotting检测hbsag表达水平。结果表明(图5)c6呈时间、浓度依赖性降低细胞内hbsag水平。real-pcr检测细胞内hbvrna，c6呈时间、浓度依赖性降低细胞内totalhbvrna，3.5-kbrna水平(图6)，northernblotting验证了pcr结果(图7)。

4.4、检测c6对hepg2.2.15细胞内hbvdna水平的影响

提取细胞内hbvdna进行定量pcr检测，结果表明c6可显著抑制hbvdna水平(图8)。

4.5、hbv感染细胞模型hepg2-ntcp中检测c6的抗病毒效能

c6处理hepg2-ntcp细胞10d后，收集细胞上清检测hbsag及hbeag，收集细胞检测hbvrna，hbvdna。结果显示c6可以显著抑制上清hbsag，hbeag水平(图9)以及细胞内hbvrna，hbvdna水平(图10-11)。

4.6、重组cccdna小鼠模型中验证c6的抗hbv作用

小鼠的处理流程如图12，分离小鼠血清检测hbsag、hbvdna。结果表明(图13)，与对照组相比，c6处理组及联合用药组(c6+etv)可显著抑制血清hbsag及hbvdna水平，其中联合用药组的抑制作用强于c6单药组。进一步检测肝组织hbvrnas及hbvdna水平，实验结果表明c6处理组及联合用药组(c6+etv)可显著抑制肝组织hbvrnas(图14)及hbvdna(图15)水平。而联合etv后，抑制作用明显增强。

综上所述，本发明首次在体内外验证了单体化合物ciliatosidea的抗hbv作用，体外实验证实c6能够显著抑制hepg2.2.15，hepg2-ntcp等肝癌细胞内hbsag，hbvrnas及hbvdna水平；进一步进行体内实验发现，c6可以显著抑制小鼠血清及肝组织hbvdna等指标。这些结果表明c6具有显著的抗hbv的作用，有望发展为乙肝治愈性药物。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

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<110>重庆医科大学

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