一种源自酵母细胞外囊泡和溶解物的化妆品组合物的制作方法

1.本发明涉及一种化妆品组合物，其含有从源自酿酒酵母的细胞外囊泡及其溶 解物的一种以上物质中分离出来的有效成分。


背景技术：

2.众所周知，由于衰老或紫外线等原因，随着细胞中生成炎性细胞因子的酵素 cox
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2增加，前列腺素e2(prostaglandin e2)的合成会增加，炎症诱发因子等生成会增加。 由于各种炎症反应mmp的生成及合成增加，由此引发胶原蛋白分解，进而降低皮肤弹性，形 成皮肤皱纹。尤其，当太阳光及紫外线照射到皮肤时，产生大量自由基，由于这种自由基， 皮肤的抗氧化防御作用遭到破坏，引起皱纹增加，皮肤松弛等，加速皮肤老化。因此，为了 减少皮肤皱纹，保持皮肤弹性，应抑制活性氧类及自由基的生成，抑制炎性反应，促进伤口 的皮肤再生，从而保护皮肤。
3.众所周知，有效改善皮肤皱纹的物质，有腺苷、维甲酸(retinoicacid)等， 但是腺苷在临床上效果不太明显，维甲酸不能用于育龄女性，有出红斑等副作用，因此，利 用植物或天然物质有效成分的抗衰老功能性化妆品目前受到广泛的关注。然而，植物提取物 为有效成分的功能性化妆品，涂抹到皮肤后，溶液的蒸发过程中，有可能产生异物感，存在 持续时间短的问题。
4.细胞向细胞外环境排放多种膜(membrane)类囊泡，通常把这些囊泡叫做细胞外 囊泡(extracellularvesicles,ev)，细胞外囊泡(extracellularvesicles)，根据不同来 源、大小、生成过程，可分成外泌体(exosome)、微型囊泡(microvesicles)、外膜囊泡(outermembranevesicles)等，但外观上的区别不大，都具有向细胞外分泌的囊泡的共性，因此目 前统称为“细胞外囊泡”。
5.外泌体是由与细胞膜结构相同的双重脂质膜构成的数十至数百纳米大小的囊 泡，其内部包括一种叫做外泌体物质的蛋白质，核酸(mrna,mirna等)等。外泌体物质还 包括广泛的信号传递因子(signalingfactors)，这些信号传递因子对细胞类型具有专属性， 根据不同分泌细胞的环境，可进行不同的调节。
6.外泌体是细胞分泌的细胞间信号传递媒介，由它传递的多种细胞信号，可以调 节目标细胞的激活、生长、移动、分化、脱分化、凋亡(apoptosis)、坏死(necrosis)等 细胞行动。根据不同来源细胞的性质及状态，外泌体中包含不同的特殊遗传物质和生物活性 因子。若是源自增殖的干细胞外泌体，其可以调节细胞的移动、增殖及分化，其反映着组织 再生相关的干细胞特性(nature review immunology 2002(2)569
‑
579)。由于这种特性， 便出现了试图把细胞外囊泡用于诊断治疗疾病等目的的研究(专利文献2)。
7.外泌体又称细胞化身，它不仅从干细胞及癌细胞中排出，还可以从植物、细菌 (bacteria)、菌类(fungi)、藻类(algae)等多种生物细胞中排出。例如，外泌体可从间 质干细胞培养液、成纤维细胞培养液中分离出来，此外还可从酵母培养液中分离出来。
8.近年来，与之相关的发酵化妆品颇受大家的青睐，用于化妆品的酵母种类也与 日
俱增。用于化妆品的酵母种类大约有数百种之多，发酵化妆品原料中，消费者反响最好的 就是半乳糖酶发酵过滤物(galactomycesfermentfiltrate)。半乳糖酶是从酿酒师的手的皮 肤与之年龄相比富有弹性并且干净的事实中得到启发，在对多种酵母的研究过程中发现的酵 母。
9.半乳糖酶发酵过滤物，富含维生素、矿物质、氨基酸、有机酸、酵素、酵母肽 等。然而，半乳糖酶发酵过滤物对发酵成分敏感的人群有可能引起皮肤过敏、皮肤变红，或 皮炎等副作用(专利文献1)。
10.目前，对上述发酵物发酵的成分变化及对皮肤效果的研究比较多，但是缺乏单 纯酵母培养液直接对皮肤产生的影响方面的研究。现有技术文献专利文献
11.(专利文献0001)韩国特许公开号：第10
‑
2020
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0028290号。(专利文献0002)韩国特许公开号：第10
‑
2019
‑
0050286号。


技术实现要素：

12.本发明的目的在于，提供一种化妆品组合物，其以源自酿酒酵母的外泌体及其 溶解物为有效成分，具有抗老化、皮肤再生、改善皮肤弹性或改善皮肤皱纹功能。
13.如上所述，培养液中含有增殖所需成分和细胞排出的代谢产物等多种成分，其 既含有对皮肤有益的成分，还含有对皮肤有害的成分，因此，本发明的目的在于，从酵母培 养液中只提取对皮肤实际有用的成分，提供一种具有优异效果的化妆原料组合物。
14.根据本发明的化妆品组合物，包括从源自酿酒酵母的细胞外囊泡及其溶解物中 一种以上物质中分离出来的有效成分。
15.优选地，所述酵母为saccharomyces cerevisiae rd
‑
03ri sc(c)(寄存 号：kctc sd1359)。该菌株由瑞帝安公司附属研究所于2021年2月11日保藏于位于韩国全 罗北道井邑市立新街181的韩国典型菌种保藏中心(kctc)，保藏编号为sd 1359，分类为 酿酒酵母，saccharomyces cerevisiae rd
‑
03。
16.优选地，所述化妆品组合物，用于抗老化、皮肤再生、改善皮肤弹性或改善皮 肤皱纹用途。
17.优选地，所述细胞外囊泡或其溶解物，是用超速离心法分离或超滤膜进行分离 的。
18.更优选地，所述细胞外囊泡或其溶解物，可用超滤膜来进行分离的。
19.优选地，所述细胞外囊泡的尺寸为30～200nm。
20.优选地，所述化妆品组合物，还包括选自丁二醇、己二醇、乙基己基甘油及苯 氧乙醇中的一种以上添加剂。
21.优选地，所述化妆品组合物，选自化妆水、营养霜、按摩霜、精华素、面膜、 凝胶、护肤液、软膏、药贴及喷雾剂等组成的剂型。
22.优选地，作为本发明的另一种具体实施例，为把所述细胞外囊泡或其溶解物的 有效成分，传递至皮肤或细胞或细胞外囊泡内的传递物，可使用所述细胞外囊泡。
23.优选地，作为本发明的另一种具体实施例，在培养酵母时，利用所述细胞外囊 泡
传递物，把所述有效成分投入至细胞外囊泡内，自然把有效成分胶囊化，或在培养酵母时， 把所述有效成分投入至细胞外膜囊泡内，然后通过超声波处理，人为地在细胞外囊泡内进行 胶囊化。
24.利用本发明的从含有源自酿酒酵母的细胞外囊泡及其溶解物中的一种以上物质 中分离出来的有效成分的化妆品组合物，除了治疗用途之外，可用于改善哺乳动物皮肤状态 的美容方法。
25.优选地，所述美容方法包括以下步骤：步骤a)：将所述化妆品组合物直接涂敷于哺乳动物的皮肤上；步骤b)：把涂有或浸有所述化妆品组合物的药贴、面膜或面膜纸接触或贴至哺乳动物 的皮肤上，或依次进行上述步骤(a)及步骤(b)。
26.另外，还包括步骤(c)：步骤(b)之后，将上述药贴、面膜或面膜纸，从哺乳 动物的皮肤上去除，将上述化妆品组合物涂到哺乳动物的皮肤上。
27.本发明另一方面，还提供上述化妆品组合物在改善哺乳动物皮肤状态中的应用。本发明再一方面，还提供上述化妆品组合物在制备皮肤再生或改善皮肤弹性或改善皮肤 皱纹的药物中的应用。
28.本发明提供一种化妆品组合物，其从源自酿酒酵母的细胞外囊泡及其溶解物， 只提取实际有用的有效成分，具有抗老化、皮肤再生、改善皮肤弹性或改善皮肤皱纹等功效。
附图说明
29.图1显示本发明实施例2中，透射电子显微的影像。图2粗略显示试验例2的结果。图3a及图3b粗略显示试验例3的结果。图4粗略显示试验例4的结果。图5粗略显示试验例5的结果。图6a及图6b粗略显示试验例6的结果。图7a及图7b粗略显示试验例7的结果。
具体实施方式
30.下面我们结合具体实施例，对本发明做进一步详细说明，以便在本发明所述领 域普通技术人员顺利实施本发明。本发明实施方式是为了对本行业具备通常知识的人更加完 整地说明本发明而提供的。因此，本发明的实施方式，可以有多种变形，本发明的保护范围 并不仅限于以下实施方式。
31.在整个本发明说明书中，说有些部分“包括”某些组成要素，其意味着在没有 特殊排他性意义的记载时，不排除其他组成要素，还包括其他组成要素。
32.在整个本发明说明书中，说某个步骤处于某个步骤“之上”或“之前”时，其 不仅包括某个步骤与其他某个步骤存在直接时序关系的情形，还包括与各步骤后续混合的步 骤一样，两个步骤的顺序上时序顺序可互换的存在间接时序关系的情形，其具有同等权利。
33.在整个本发明说明书中所使用的术语“约”和“实际上”等，当所述意义上提 供固有制造及物质的允许误差时，其数值或接近其数值的意思来使用，其目的是为了有助于 理
解本发明，也为了防止不怀好意的侵权人，非法利用准确或公开有准确数值的内容。在整 个本说明书中，所使用的术语
“…
步骤”或
“…
的步骤”，并不代表“为了
…
的步骤”。
34.本发明提供一种化妆原料组合物，其含有从源自酿酒酵母的细胞外囊泡及其溶 解物中一种以上物质中分离出来的有效成分。
35.优选地，所述化妆原料中组合物，具有抗老化、皮肤再生、改善皮肤弹性或改 善皮肤皱纹功能。
36.本发明中，用两种不同的方式分离酵母培养液，确保源自酵母的细胞外囊泡和 其溶解物。用人成纤维细胞来处理细胞外囊泡和其溶解物，得到具有最优秀胶原蛋白合成能 力的培养条件和细胞外囊泡分离方法。
37.细胞外囊泡的制造方法采用了超速离心分离法，但考虑到大批量生产，本发明 所采用的超滤膜更好，如果建立起分段设定超滤膜的截流分子量的工艺，可得到各种不同粒 径的细胞外囊泡，可实现产品的细化。
38.本发明分离出来的细胞外囊泡的尺寸相当于30～200nm，源自酵母的细胞外囊 泡可视做源自天然的纳米结构体。源自酵母的细胞外囊泡其本身被认定为具有预防及改善皮 肤皱纹的效果，从而可应用到产品上。
39.另外，纳米尺寸结构体，具有与除皱、抗老化功能生理活性物质很容易结合的 特点。把这些纳米结构体作为传递物质用于化妆品中，开发出纳米化妆品，由于其大小远比 皮肤细胞间隔，因此很容易被皮肤吸收。话句话说，纳米结构体可起到把化妆品的成分，容 易传递到皮肤内部或细胞外囊泡内的传递物作用。
40.利用这些纳米结构体作为传递物，把有效成分加入至源自酵母的细胞外囊泡内， 从而可派生出更多产品。例如，培养酵母时，可采用通过传递物添加有效成分，以自然方式 把有效成分进行胶囊化的方法，或通过超声波处理瞬间引发细胞外囊泡的结构变化，人为地 把有效成分进行胶囊化的方法。
42.下面，通过实施例或试验例，举例对本发明的内容做更加详细的说明。
43.比较例1～8：酵母培养过滤液
44.把酵母(saccharomycescerevisiaerd
‑
03ri
‑
sc(c)(kctcsd1359))接种至 ymbroth上，在27℃及37℃下，搅拌培养(shakingincubation)8、16、24、48小时后，在 4℃、4000rpm、20min条件下进行离心分离，用0.22μm pes过滤上层液，制造出比较例1～8。
46.比较例9～16：利用分离试剂的源自酵母的细胞外囊泡溶液
47.比较例1～8的酵母培养过滤液和总外泌体分离试剂(totalexosomeisolationreagent)进行反应后，在4℃、10,000rpm,1hr条件下，经离心分离除去上层液， 确保了细胞外囊泡颗粒。用磷酸盐缓冲液进行再悬浮，制造出比较例9～16。
49.比较例17～24：利用分离试剂的源自酵母的细胞外囊泡溶解物
50.比较例1～8的酵母培养过滤液和总外泌体分离试剂进行反应后，在4℃、 10,000rpm,1hr条件下，经离心分离除去上层液，确保了细胞外囊泡颗粒。用蒸馏水进行再 悬浮，间隔5分钟进行3次超声波(sonication)处理，制造出比较例17～24。
52.上述比较例1～24的培养条件，如下面的表1所述。
53.表1
55.实施例1：利用超滤膜的源自酵母的细胞外囊泡溶液
56.把酵母(saccharomycescerevisiaerd
‑
03ri
‑
sc(c)(kctcsd1359))接种至 ymbroth上，在27℃下搅拌48小时进行培养后，在4℃、4000rpm、20min条件下，进行离 心分离，用0.22μm pes过滤上层液，制造出酵母培养过滤液。用40nm超滤膜装置进行过 滤，除去残留液。相对于酵母培养过滤液，使用1/10的蒸馏水，回收被40nm超滤膜装置过 滤的ev，并用0.22μm pes进行过滤制造出实施例1。
58.实施例2:利用超滤膜的源自酵母的细胞外囊泡溶解物
59.将上述实施例1中所得细胞外囊泡溶液，按5分钟的间隔进行3次超声波处理， 制造出实施例2。这些细胞外囊泡溶解物的电子透射显微镜影像图，如图1所示。
61.试验例1：蛋白质含量的评价(比较例1～24)
62.为了比较不同酵母培养条件下的总蛋白质含量，以比较例1～24做为试剂，进 行bca assay检测。
63.如下面的表2所示，酵母培养过滤液形态的比较例1～8的蛋白质含量最高，培 养时间越长蛋白质含量减少的倾向越明显，可见这是培养基成分的影响。比较例9～24的蛋 白质含量小于100μg/ml，这说明分离细胞外囊泡时，含培养基成分的大部分蛋白质已经被 除去。
64.表2 比较例总蛋白质含量(μg/ml)
12170.5621995.6531840.2841795.1152143.3561794.3171786.4581789.47944.741039.841187.891295.301365.111499.521572.5416117.741732.161857.561952.992068.752149.032233.002343.042461.30
66.试验例2：成纤维细胞增殖能力评价(比较例9～24)
67.随着老化的进程，负责胶原蛋白和弹性蛋白表达的成纤维细胞数量和功能降低。 将成纤维细胞(humandermalfibroblast)，在培养板上培养24小时之后，用试剂处理比较 例9～24，培养24小时。经mtt reagent处理，计算出相对于无菌处理组的经试剂处理成纤 维细胞的增殖能力。
68.如图2所示，在27℃、48小时酵母培养液中分离出来的细胞外囊泡，即比较 例20处理组的细胞增殖能力最强，在0.01～0.5％处理组上，浓度显示依存式的结果。
70.试验例3：胶原蛋白合成能力评价(比较例12及20，实施例1及2)
71.随着老化的进程，负责胶原蛋白和弹性蛋白表达的成纤维细胞的数量和功能降 低。大分子量胶原蛋白的皮层吸收几乎不可能，在皮肤细胞中生物合成最为有效。胶原蛋白 在细胞内部合成为前胶原(procollagen)之后，向细胞外分泌并中和成为胶原纤维。用 elisa(enzyme
‑
linkedimmuosorbentassay)确认分泌到细胞外的 pip(procollagentypeic
‑
terminalpeptide)，在人纤维亚细胞中评价经试剂处理胶原蛋白的 合成能力。
72.如图3a及图3b所示，比较例12和比较例20的合成能力强，高于实施例2。
74.试验例4：ergosterol确认试验(tlc)
75.ergosterol又称前维生素d，它是酵母、蘑菇类等菌类中的成分之一，可视 0087作evmembranemarker。用薄层色谱法(thinlayerchromatograph)来确认是否存在 ergosterol。将实施例2冷冻干燥，除去溶剂后，在甲醇中悬浮，经离心分离后分别滴定 100μl上层液。为了比较用甲醇溶解ergosterol标准品进行点样，展开溶液展开后，在 uv254nm照射下，确认是否形成与标准品具有相同rf值的斑点。
76.如图4的tlc(薄层色谱)结果所示，实施例2形成与ergosterol标准品的 rf相同的rf值的斑点，从而证明了ergosterol的存在。
78.试验例5：蛋白质图谱分析(sds
‑
page/gel staining)
79.为了确认组成细胞外囊泡的蛋白质图谱，进行sds
‑
page及brilliant blue gelstaining。冻干实施例2后，在蒸馏水中悬浮，加载于凝胶(gel)上，采用10～180kda及 40～300kda两种蛋白标志物(protein marker)，分析蛋白质图谱。
80.如图5所示，实施例2为由60～75kda及100～180kda的蛋白质组成。
82.试验例6：颗粒分布及浓度分析(nanotracking analysis)
83.为了确认存在于实施例1及2中的细胞外囊泡的颗粒分布和浓度，利用纳米 颗粒追踪分析仪(ns300)进行分析。
84.如图6a及6b所示，实施例1和2的平均颗粒直径为150～220nm,颗粒浓度 约为1x108～1x10
10
particles/ml。
86.试验例7：zeta电位分析(zetapotential analysis)
87.为了确认存在于实施例1及2中的细胞外囊泡颗粒的分散稳定性，利用zeta 电位分析仪进行分析。
88.如图7a及图7b所示，实施例1和2的zeta电位为
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19.7mv～
‑
21mv，认为分 散度稳定。
90.上述化妆原料组合物，还可以包括丁二醇、已二醇、乙基己基甘油及苯氧乙 醇中的一种以上添加剂。上述添加剂是为了形成后续的剂型所必需的，但是并不限于此。
91.上述化妆品组合物，选自柔肤水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精华素、 面膜、凝胶、护肤液、软膏、药贴及喷雾剂等组成的剂型，但是并不限于此。
92.另外，利用含有从本发明的源自酿酒酵母的细胞外囊泡及其溶解物中的一种 以上物质中分离的有效成分的化妆原料组合物，除了治疗用之外，可用于改善哺乳动物皮 肤状态的美容方法。
93.优选地，上述美容方法，包括以下步骤：步骤a)：将所述化妆品组合物直接涂敷于哺乳动物的皮肤上；步骤b)：把涂有或浸有所述化妆品组合物的药贴、面膜或面膜纸接触或贴至哺乳动物 的皮肤上，或依次进行上述步骤(a)及步骤(b)。
94.另外，还包括步骤(c)：步骤(b)之后，将上述药贴、面膜或面膜纸，从哺 乳动物的皮肤上去除，将上述化妆品组合物涂到哺乳动物的皮肤上。
95.以上我们对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明的保护范围并不限于 此，本领域具备通常知识的技术人员应该理解，在不脱离本发明权利要求技术精神的情况 下，有可能对本发明做各种修订及变形。