氟桂利嗪靶向ZDHHC5在制备治疗神经胶质瘤药物的应用的制作方法

本发明属于临床医学，具体涉及氟桂利嗪在制备与zdhhc5靶向相关的治疗神经胶质瘤的药物中的应用。

背景技术：

1、神经胶质瘤(glioma)是神经组织内各种类型的胶质细胞(如星形胶质细胞、少突胶质细胞等)发生异常突变所形成的肿瘤，是一类与正常神经组织边界不清的肿瘤。由于胶质细胞仅存在中枢神经系统(即脑和脊髓)内，因此胶质瘤只发生于中枢神经系统的脑和脊髓内，脊髓内的胶质瘤多为星形细胞瘤，在脑内的胶质瘤包括星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤和星形-少突胶质细胞瘤等类型。

2、对神经胶质瘤的治疗以手术治疗为主，但由于肿瘤浸润性生长，与脑组织间无明显边界，除早期肿瘤小且位于适当部位者外，难以作到全部切除，一般都主张综合治疗，即术后配合以放射治疗、化学治疗等，可延缓复发及延长生存期。化学治疗选择的药物仍以脂溶性者为主，可选择的药物相对有限。神经胶质瘤(glioma)与胶质母细胞瘤(glioblastoma)不同，胶质母细胞瘤是星形细胞肿瘤中恶性程度最高的胶质瘤，大约占颅内肿瘤的15％左右；而神经胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占所有颅内原发肿瘤的一半，相比之下，神经胶质瘤发病率高，目前没有研发出任何靶向药物可供临床使用。

3、氟桂利嗪(flunarizine)，化学名称为(e)-1-〔双-(4-氟苯基)甲基〕-4-(2-丙烯基-3-苯基)哌嗪，化学结构式为：

4、

5、其为桂利嗪的二氟化衍生物，同样为选择性ca2+拮抗剂，可阻止过量ca2+进入血管平滑肌细胞，引起血管扩张，对脑血管的选择性较好，而对心肌血管作用较差，因此对血压、心率的影响小。对血管收缩物质引起的血管收缩有持久的抑制作用，对基底动脉和颈内动脉作用更明显。可抑制脑组织缺血缺氧引起的钙超载，保护脑组织。对血管内皮细胞因缺氧引起的钙超载有防治作用，保护血管内皮细胞的完整性。可增加耳蜗内辐射小动脉血流量，改善前庭器官微循环，对眼球震颤和眩晕起到抑制作用。主要用于脑动脉缺血性疾病、由前庭刺激或脑缺血引起的头晕、耳鸣、眩晕以及血管性偏头痛、癫痫等疾病的防治。

6、本申请人发现，氟桂利嗪可以通过显著抑制zdhhc5与sstr5相互作用来抑制神经胶质瘤细胞的增殖，进而应用在制备治疗神经胶质瘤的药物中。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种氟桂利嗪在制备与zdhhc5靶向相关的治疗神经胶质瘤的药物中的应用，通过显著抑制zdhhc5与sstr5相互作用来抑制神经胶质瘤细胞的增殖，为神经胶质瘤治疗的药物靶点设计和药物选择提供理论指导，具有重要的临床应用价值。

2、为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

3、氟桂利嗪在制备与zdhhc5(棕榈酰基转移酶5)靶向相关的治疗神经胶质瘤的药物中的应用，所述氟桂利嗪结构如下：

4、

5、优选地，所述应用中，氟桂利嗪通过抑制zdhhc5(棕榈酰基转移酶5)与sstr5(生长抑素受体5)相互作用来抑制神经胶质瘤细胞的增殖。

6、进一步优选地，所述应用中，氟桂利嗪通过抑制sstr5胞内区c端与zdhhc5蛋白底物结合区的相互作用来抑制神经胶质瘤细胞的增殖。

7、优选地，所述应用中，所述氟桂利嗪能有效结合于zdhhc5底物结合区。

8、优选地，所述应用中，所述神经胶质瘤细胞选自u373细胞、swo38细胞、u251细胞、u87细胞、u52细胞、a172细胞、u118mgt-98g细胞进一步优选为u373细胞和swo38细胞。

9、优选地，所述应用中，神经胶质瘤为高zdhhc5表达神经胶质瘤。

10、优选地，所述应用中，通过微量热泳动实验(mst)测定对氟桂利嗪zdhhc5与sstr5相互作用的抑制作用。

11、进一步优选地，所述微量热泳动实验包括以下步骤：

12、用bl21(de3)(大肠杆菌表达菌株bl21(de3))表达目的蛋白，通过的his tag镍柱(购自ge公司)纯化蛋白，然后nt-647-nhs dye染料(购自nanotemper技术有限公司)标记目的蛋白，经过b重力柱分离纯化染料标记的zdhhc5蛋白，flunarizine和标记蛋白孵育后上机测试，initial fluorescence analysis程序分析，测定sstr5胞内区c端与zdhhc5底物结合区的kd值(解离常数)。

13、优选地，所述应用中，通过克隆形成实验测定氟桂利嗪对神经胶质瘤细胞的增殖作用。

14、进一步优选地，所述克隆形成实验包括以下步骤：

15、将细胞培养至对数生长期，弃上清，冲洗一遍，加入酶消化后，吹打下细胞，离心弃上清，重悬后加入血细胞计数板中，拿至显微镜下计数；计数后取细胞均匀点到六孔板中，再每孔加入培养基培养，待观察到孔中大多数的单克隆中细胞数大于50个时中止。

16、(2)用pbs冲洗细胞1次，加入多聚甲醛，常温固定，弃固定液，染色，染色完成后用水缓慢轻柔冲洗细胞数次，直至多余染料被清除，晾干，使用相机对准各孔板底拍照，上传后使用imagej软件进行克隆计数。

17、本发明的有益效果为：

18、本发明公开了flunarizine靶向抑制zdhhc5与其底物蛋白sstr5胞内区c端的相互作用，通过阻止zdhhc5与其底物蛋白sstr5胞内区c端的相互作用治疗神经胶质瘤。

19、本申请将flunarizine与zdhhc5蛋白进行微量热泳动(microscalethermophoresis,mst)实验测定kd值，发现flunarizine与zdhhc5的kd值为843nm。将sstr5胞内区c端与zdhhc5蛋白进行微量热泳动(microscale thermophoresis,mst)实验测定kd值，在flunarizine存在时kd值出现显著差异。同时克隆形成实验表明flunarizine(10μm)能有效抑制神经胶质瘤细胞增殖(u373和swo38)，抑制效果与zdhhc5的sirna转染结果相似。

20、综上，本申请提供了flunarizine在靶向高zdhhc5表达神经胶质瘤中的新用途，为神经胶质瘤治疗的药物靶点设计和药物选择提供理论指导，具有重要的临床应用价值。

技术特征：

1.氟桂利嗪在制备与zdhhc5靶向相关的治疗神经胶质瘤的药物中的应用，所述氟桂利嗪结构如下：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用中，氟桂利嗪通过抑制zdhhc5与sstr5相互作用来抑制神经胶质瘤细胞的增殖。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用中，氟桂利嗪通过抑制sstr5胞内区c端与zdhhc5蛋白底物结合区的相互作用来抑制神经胶质瘤细胞的增殖。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用中，所述氟桂利嗪能有效结合于zdhhc5底物结合区。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用中，所述神经胶质瘤细胞选自u373细胞、swo38细胞、u251细胞、u87细胞、u52细胞、a172细胞、u118mgt-98g细胞；优选为u373细胞和swo38细胞。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用中，神经胶质瘤为高zdhhc5表达神经胶质瘤。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用中，通过微量热泳动实验测定对氟桂利嗪zdhhc5与sstr5相互作用的抑制作用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述微量热泳动实验包括以下步骤：

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用中，通过克隆形成实验测定氟桂利嗪对神经胶质瘤细胞的增殖作用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述克隆形成实验包括以下步骤：

技术总结
本发明公开了一种氟桂利嗪靶向ZDHHC5在制备治疗神经胶质瘤药物的应用，属于临床医学技术领域。本发明公开了氟桂利嗪在制备与ZDHHC5靶向相关的治疗神经胶质瘤的药物中的应用，通过阻止ZDHHC5与其底物蛋白SSTR5胞内区C端的相互作用治疗神经胶质瘤。本申请提供了Flunarizine在靶向高ZDHHC5表达神经胶质瘤中的新用途，为神经胶质瘤治疗的药物靶点设计和药物选择提供理论指导，具有重要的临床应用价值。

技术研发人员：江经纬,孙媛媛,宋世东
受保护的技术使用者：双运生物医药科技（苏州）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12