用于HPV阳性癌症的治疗性RNA的制作方法

用于hpv阳性癌症的治疗性rna
1.本公开内容涉及用于治疗hpv阳性癌症的治疗性rna的领域，所述癌症特别地是肛门生殖器(anogenital)癌、宫颈癌和阴茎癌以及头颈区域中的癌症，例如生殖器区域中的癌症和头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，hnscc)。
2.本文中公开了用于治疗hpv阳性癌症的组合物、用途和方法。本文中公开的向患有hpv阳性癌症的患者施用治疗性rna可降低肿瘤尺寸、延长进行性疾病的时间、和/或防止肿瘤的转移和/或复发并且最终延长存活时间。
3.在过去的十年中，感染致癌性人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)类型已被确定为是导致多种癌症的原因，所述癌症包括头颈鳞状细胞癌(hnscc)、宫颈癌和肛门生殖器癌(iarc working group.human papillomaviruses.iarc monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans.90，(2007))。
4.hpv阳性hnscc中最普遍的hpv亚型是hpv16。与hpv阴性hnscc相比，hpv阳性hnscc在临床、组织病理学和分子学上有所不同(lawrence，m.s.m.s.et al.，nature 517，576-582(2015))，其发病率提高并且预后显著更好，而与治疗方式无关(ang，k.k.et al.，n.engl.j.med.363，24-35(2010)；dayyani，f.et al.，head neck oncol.2，(2010))。在hnscc中，护理标准包括手术、放射治疗和化学治疗，并且与长期的身体、功能和社会心理障碍相关，严重影响患者的生活品质。尽管进行了积极治疗，但约50％的患者死于他们的疾病(argiris，a.，karamouzis，m.v，raben，d.&ferris，r.l.seminar：head and neck cancer.lancet(2008).doi：10.1016/s0140-6736(08)60728-x；razzaghi，h.et al.，cancer 124，203-211(2018))。需要替代治疗来改善存活，同时降低治疗相关的发病率。
5.自从最近批准了靶向pd-1/pd-l1轴的免疫检查点阻断治疗用于治疗患有复发性或转移性hnscc的患者以来，探索免疫学方法的兴趣得以提高(soulieres，d.et al.abstract ct115：updated survival results of the keynote-040 study of pembrolizumab vs standard-of-care chemotherapy for recurrent or metastatic head and neck squamous cell carcinoma.cancer res.(2018).doi：10.1158/1538-7445.am2018-ct115)。驱动恶性转化并由癌细胞组成型表达的hpv癌蛋白e6和e7(mesri，e.a.，feitelson，m.a.& munger，k.，cell host and microbe(2014).doi：10.1016/j.chom.2014.02.011)是免疫治疗的理想靶标。通过以下观察结果进一步支持了这一点：针对hpv16癌蛋白的自发发生的t细胞对于病毒清除和hpv阳性癌变前病变的消退至关重要(kenter，g.g.et al.，n.engl.j.med.361，1838-1847(2009))，以及肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte，til)的密度是hpv阳性hnscc的结局的强预测因子(ward，m.j.et al.，br.j.cancer 110，489-500(2014))。
6.在临床试验中，治疗性hpv16疫苗已表明通过免疫接种诱导针对e6和e7的全身性cd8
+
t细胞应答的可行性(kenter，g.g.et al.，n.engl.j.med.361，1838-1847(2009)；trimble，c.l.et al.，lancet 386，2078-2088(2015)；welters，m.j.p.et al.，clin.cancer res.24，634-647(2018))。
7.癌症疫苗的最终目标是通过将抗原递送至抗原呈递细胞(优选淋巴结中的)以用
于其在最佳免疫刺激条件下的呈递来诱导强效、持久和临床相关的免疫应答(melero，i.et al.，nat.rev.clin.oncol.11，509-24(2014))。
8.合成mrna正在成为有吸引力的疫苗形式，这是由于其以下有利的特征导致的：mrna是非整合的，并且因此被认为是安全的。其以不依赖hla的方式递送编码的抗原，由于其tlr7/8配体活性而为天然佐剂，并且其产生具有时间和成本效益。
9.在此，呈现了hpv16 e6和e7 rna-lpx的特征，其为第一在小鼠模型中静脉内施用的基于rna的治疗性hpv16疫苗。在人源化hla转基因a2dr1小鼠(表达人hla-a*0201和hla-drb1*01分子)中疫苗接种hpv16 e6和e7 rna-lpx诱导了针对疫苗编码的抗原的强t细胞应答。由于在小鼠中没有天然加工和呈递的来源于e6癌蛋白的cd8
+
t细胞表位，因此治疗性实验专注于e7癌蛋白以治疗性地评价hpv16 rna-lpx疫苗。
10.显示了在c57bl/6小鼠中通过e7 rna-lpx诱导强t细胞免疫，其通过e7 rna-lpx介导的e7特异性cd8 t细胞、cd4 t细胞、nk细胞和促炎(分泌inos)巨噬细胞的浸润，引起鼠hpv16阳性tc-1和c3肿瘤的持久缓解。e7 rna-lpx疫苗接种增强了tc-1和c3肿瘤排斥、防止复发并且进一步与免疫检查点阻断治疗(例如pd-l1抑制剂)协同作用。
11.此外，显示了e7 rna-lpx与为许多hpv+癌症患者的护理标准的局部放射治疗(local radiotherapy，lrt)协同作用。组合的e7 rna-lpx/lrt介导hpv16
+
tc-1和c3肿瘤模型二者的优异消退，这在任一单一治疗之后均未观察到。
12.尽管e7 rna-lpx疫苗主要诱导e7特异性肿瘤浸润cd8
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t细胞，但lrt还增强肿瘤细胞死亡、降低局部免疫抑制并使经疫苗致敏的细胞毒性t细胞更强效。
13.无论其是否接受lrt，经e7 rna-lpx处理的肿瘤中免疫抑制性treg的募集与肿瘤细胞上的阴性t细胞调节物pd-l1的表达是等同的。经e7 rna-lpx和组合治疗处理的小鼠显示出高水平的pd-l1，这可能是e7特异性t细胞在tme中持续分泌ifnγ的结果。e7 rna-lpx疫苗接种提高了e7特异性cd8 til上pd-1和tim-3以及nkg2ab的表达，而组合的lrt进一步提高了nkg2ab表达。本文中呈现的数据表明，除lrt之外，检查点阻断例如抗pd-1/pd-l1 cpi可以是涉及基于hpv的疫苗(例如hpv16 e6/e7 rna-lpx)的治疗的有吸引力的组合伴侣。
14.另外，显示了顺铂(cisplatin)增强e7 rna-lpx疫苗接种的抗肿瘤作用。因此，rna-lpx疫苗和基于铂的化学治疗可用作协同组合伴侣以用于改善癌症治疗。
15.发明概述
16.本发明一般地包括对象的免疫治疗性治疗，所述治疗包括施用(i)编码氨基酸序列即疫苗抗原的rna即疫苗rna，所述氨基酸序列包含hpv e6蛋白、其免疫原性变体、或者hpv e6蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段，即抗原肽或蛋白质，以及(ii)编码氨基酸序列即疫苗抗原的rna即疫苗rna，所述氨基酸序列包含hpv e7蛋白、其免疫原性变体、或者hpv e7蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段，即抗原肽或蛋白质。因此，疫苗抗原包含hpv e6蛋白或hpv e7蛋白的表位以用于在对象中诱导针对hpv e6蛋白或hpv e7蛋白的免疫应答。施用编码疫苗抗原的rna以(在通过合适的靶细胞表达多核苷酸之后)提供抗原以用于诱导(即刺激、致敏和/或扩增)靶向靶抗原(hpv e6蛋白或hpv e7蛋白)或其加工产物的免疫应答，例如抗体和/或免疫效应细胞。在一个实施方案中，根据本公开内容待诱导的免疫应答是b细胞介导的免疫应答，即抗体介导的免疫应答。作为替代或补充，在一个实施
方案中，根据本公开内容待诱导的免疫应答是t细胞介导的免疫应答。在一个实施方案中，免疫应答是抗hpv免疫应答。
17.本文中所述的疫苗包含作为活性成分的单链rna，其可在进入接受体的细胞之后被翻译成相应的蛋白质。除了编码抗原序列的野生型序列或经密码子优化的序列之外，rna可包含针对rna的关于稳定性和翻译效率的最大效力而优化的一种或更多种结构元件(5’帽、5’utr、3’utr、poly(a)尾)。在一个实施方案中，rna包含所有这些元件。在一个实施方案中，β-s-arca(d1)(m
27，2
’‑ogppspg)可用作在rna药物物质的5’端的特定加帽结构。作为5
’‑
utr序列，可使用人α-珠蛋白mrna的5
’‑
utr序列，其任选地具有经优化的“kozak序列”以提高翻译效率。作为3
’‑
utr序列，可使用置于编码序列与poly(a)尾之间以确保较高的最大蛋白质水平和延长的mrna持久性的两种序列元件(fi元件)的组合，所述两种序列元件(fi元件)来源于“分裂的氨基端增强子”(amino terminal enhancer of split，aes)mrna(称为f)和线粒体编码的12s核糖体rna(称为i)。这些通过对赋予rna稳定性和增强总蛋白表达的序列进行离体选择过程来鉴定(参见wo 2017/060314，其通过引用并入本文)。此外，可使用测量长度为110个核苷酸的poly(a)尾，其由以下区段组成：30个腺苷残基，随后是(随机核苷酸的)10个核苷酸的接头序列和另外70个腺苷残基。这种poly(a)尾序列被设计成用于增强rna稳定性和翻译效率。
18.此外，sec(分泌信号肽)和/或mitd(mhc i类运输结构域)可以以相应元件分别翻译成n端或c端标签的方式与抗原编码区融合。来源于编码人mhc i类复合物(hla-b51、单倍型a2、b27/b51、cw2/cw3)的序列的融合蛋白标签已显示改善抗原加工和呈递。sec可对应于编码分泌信号肽的78 bp片段，其引导新生多肽链易位到内质网中。mitd可对应于mhc i类分子的跨膜和胞质结构域，也称为mhc i类运输结构域。编码主要由如通常用于融合蛋白的氨基酸甘氨酸(glycine，g)和丝氨酸(serine，s)组成的短接头肽的序列可用作gs/接头。
19.可将抗原与辅助表位组合施用以破坏免疫耐受。辅助表位可以是破伤风类毒素来源的，例如来源于破伤风梭菌(clostridium tetani)的破伤风类毒素(tetanus toxoid，tt)的p2p16氨基酸序列。这些序列可通过在致敏期间提供肿瘤非特异性t细胞辅助来支持克服耐受机制。破伤风类毒素重链包含可与mhc ii类等位基因混杂结合并在几乎所有经破伤风疫苗接种的个体中诱导cd4+记忆t细胞的表位。另外，已知tt辅助表位与肿瘤相关抗原的组合与施加单独的肿瘤相关抗原相比通过在致敏期间提供cd4+介导的t细胞辅助来改善免疫刺激。为了降低刺激cd8+t细胞的风险，可使用已知包含混杂结合辅助表位的两种肽序列(例如p2和p16)以确保与尽可能多的mhc ii类等位基因结合。
20.在一个实施方案中，疫苗抗原包含破坏免疫耐受的氨基酸序列。在一个实施方案中，破坏免疫耐受的氨基酸序列包含辅助表位，优选破伤风类毒素来源的辅助表位。破坏免疫耐受的氨基酸序列可直接或通过接头隔开地与疫苗序列(例如抗原序列)的c端融合。任选地，破坏免疫耐受的氨基酸序列可连接疫苗序列和mitd。破坏免疫耐受的氨基酸序列可以是rna编码的。在一个实施方案中，将靶向抗原的rna与编码辅助表位的rna一起施加以增强产生的免疫应答。该编码辅助表位的rna可包含抗原编码rna的上述针对rna关于稳定性和翻译效率的最大效力而优化的结构元件(5’帽、5’utr、3’utr、poly(a)尾)。
21.疫苗rna可与脂质体复合以产生用于静脉内(intravenous，i.v.)施用的在血清中稳定的rna脂质复合物(lipoplex，lpx)。如果使用不同rna的组合，则rna可分别与脂质体复
合以产生用于静脉内(i.v.)施用的在血清中稳定的rna脂质复合物。rna脂质复合物可靶向淋巴器官中的抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，apc)，这导致对免疫系统的有效刺激。
22.可使用脂质体来制备rna脂质复合物颗粒，所述脂质体可通过将脂质在乙醇中的溶液注射到水或合适的水相中而获得。在一个实施方案中，水相具有酸性ph。在一个实施方案中，水相包含例如约5mm的量的乙酸。通过将脂质体与rna混合，脂质体可用于制备rna脂质复合物颗粒。在一个实施方案中，脂质体和rna脂质复合物颗粒包含至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质。在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-o-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(dotma)。在一个实施方案中，所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dope)。在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-o-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(dotma)，并且所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dope)。在一个实施方案中，脂质体和rna脂质复合物颗粒包含1，2-二-o-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(dotma)和1，2-二-(9z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dope)。在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质与至少一种另外的脂质的摩尔比为约2∶1。在一个实施方案中，在生理ph下，rna脂质复合物颗粒中的正电荷与负电荷的电荷比为约1.6∶2至约1∶2或约1.6∶2至约1.1∶2。在一些具体实施方案中，在生理ph下，rna脂质复合物颗粒中的正电荷与负电荷的电荷比为约1.6∶2.0、约1.5∶2.0、约1.4∶2.0、约1.3∶2.0、约1.2∶2.0、约1.1∶2.0、或约1∶2.0。
23.在一个实施方案中，将疫苗rna与编码破坏免疫耐受的氨基酸序列的rna共配制成脂质复合物颗粒。
24.在一个方面中，本发明涉及组合物或药物制剂，其包含至少一种rna，其中所述至少一种rna编码：
25.(i)包含人乳头瘤病毒(hpv)e6蛋白、其免疫原性变体、或者所述hpv e6蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列；以及
26.(ii)包含hpv e7蛋白、其免疫原性变体、或者所述hpv e7蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列。
27.在一个实施方案中，(i)或(ii)中所述氨基酸序列中的每一种均由单独的rna编码。
28.在一个实施方案中，
29.(i)编码(i)中所述氨基酸序列的rna包含seq id no：2的核苷酸序列，或者与seq id no：2的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或
30.(ii)(i)中所述氨基酸序列包含seq id no：1的氨基酸序列，或者与seq id no：1的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
31.在一个实施方案中，
32.(i)编码(ii)中所述氨基酸序列的rna包含seq id no：4的核苷酸序列，或者与seq id no：4的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或
33.(ii)(ii)中所述氨基酸序列包含seq id no：3的氨基酸序列，或者与seq id no：3的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
34.在一个实施方案中，(i)或(ii)中的至少一种氨基酸序列包含增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列。
35.在一个实施方案中，(i)或(ii)中的每种氨基酸序列均包含增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列。
36.在一个实施方案中，所述增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列包含对应于mhc分子、优选mhc i类分子的跨膜和胞质结构域的氨基酸序列。
37.在一个实施方案中，所述增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列包含seq id no：26的氨基酸序列，或者与seq id no：26的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
38.在一个实施方案中，所述增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列还包含编码分泌信号肽的氨基酸序列。
39.在一个实施方案中，所述分泌信号肽包含seq id no：25的氨基酸序列，或者与seq id no：25的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
40.在一个实施方案中，(i)或(ii)中的至少一种氨基酸序列包含破坏免疫耐受的氨基酸序列，和/或至少一种rna与编码破坏免疫耐受的氨基酸序列的rna共施用。
41.在一个实施方案中，(i)或(ii)中的每种氨基酸序列均包含破坏免疫耐受的氨基酸序列，和/或每种rna均与编码破坏免疫耐受的氨基酸序列的rna共施用。
42.在一个实施方案中，所述破坏免疫耐受的氨基酸序列包含辅助表位，优选破伤风类毒素来源的辅助表位。
43.在一个实施方案中，所述破坏免疫耐受的氨基酸序列包含seq id no：27的氨基酸序列，或者与seq id no：27的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
44.在一个实施方案中，(i)或(ii)中所述氨基酸序列中的至少一种由这样的编码序列来编码：与野生型编码序列相比，其g/c含量提高，和/或其是经密码子优化的，其中所述密码子优化和/或所述g/c含量提高优选地不改变所编码氨基酸序列的序列。
45.在一个实施方案中，(i)或(ii)中所述氨基酸序列中的每一种均由这样的编码序列来编码：与野生型编码序列相比，其g/c含量提高，和/或其是经密码子优化的，其中所述密码子优化和/或所述g/c含量提高优选地不改变所编码氨基酸序列的序列。
46.在一个实施方案中，至少一种rna是经修饰rna，特别是稳定化的mrna。在一个实施方案中，至少一种rna包含代替至少一个尿苷的经修饰核苷。在一个实施方案中，至少一种rna包含代替每个尿苷的经修饰核苷。在一个实施方案中，每种rna均包含代替至少一个尿苷的经修饰核苷。在一个实施方案中，每种rna均包含代替每个尿苷的经修饰核苷。在一个实施方案中，经修饰核苷独立地选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。
47.在一个实施方案中，至少一种rna包含5’帽m
27，2
’‑ogppsp(5’)g。
48.在一个实施方案中，每种rna均包含5’帽m
27，2
’‑ogppsp(5’)g。
49.在一个实施方案中，至少一种rna包含含有以下的5’utr：seq id no：30的核苷酸序列，或者与seq id no：30的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
50.在一个实施方案中，每种rna均包含含有以下的5’utr：seq id no：30的核苷酸序列，或者与seq id no：30的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
51.在一个实施方案中，至少一种rna包含含有以下的3’utr：seq id no：31的核苷酸序列，或者与seq id no：31的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
52.在一个实施方案中，每种rna均包含含有以下的3’utr：seq id no：31的核苷酸序列，或者与seq id no：31的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
53.在一个实施方案中，至少一种rna包含poly-a序列。
54.在一个实施方案中，每种rna均包含poly-a序列。
55.在一个实施方案中，所述poly-a序列包含至少100个核苷酸。
56.在一个实施方案中，所述poly-a序列包含seq id no：32的核苷酸序列或由seq id no：32的核苷酸序列组成。
57.在一个实施方案中，(i)中所述的氨基酸序列，即包含hpv e6蛋白、其免疫原性变体、或者所述hpv e6蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列，从n端到c端包含：n-分泌信号肽-e6-破坏免疫耐受的氨基酸序列-增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列-c。
58.在一个实施方案中，(ii)中所述的氨基酸序列，即包含hpv e7蛋白、其免疫原性变体、或者所述hpv e7蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列，从n端到c端包含：n-分泌信号肽-e7-破坏免疫耐受的氨基酸序列-增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列-c。
59.在一个实施方案中，所述rna被配制成液体剂、配制成固体剂或其组合。
60.在一个实施方案中，所述rna被配制成用于注射。
61.在一个实施方案中，所述rna被配制成用于静脉内施用。
62.在一个实施方案中，所述rna被配制成或待被配制成脂质复合物颗粒。
63.在一个实施方案中，所述rna脂质复合物颗粒可通过将所述rna与脂质体混合来获得。
64.在一个实施方案中，所述组合物或药物制剂还包含免疫检查点抑制剂。
65.在一个实施方案中，所述免疫检查点抑制剂选自pd-1抑制剂和pd-l1抑制剂。
66.在一个实施方案中，所述免疫检查点抑制剂选自抗pd-1抗体和抗pd-l1抗体。
67.在一个实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是抗pd-1抗体。
68.在一个实施方案中，所述抗pd-1抗体是派姆单抗(pembrolizumab)(keytruda；mk-3475)、纳武单抗(nivolumab)(opdivo；bms-936558)、皮地利珠单抗(pidilizumab)(ct-011)、西米普利单抗(cemiplimab)(libtayo，regn2810)、斯巴达珠单抗(spartalizumab)
(pdr001)、medi0680(amp-514)、多塔利单抗(dostarlimab)(tsr-042)、西利单抗(cetrelimab)(jnj 63723283)、特瑞普利单抗(toripalimab)(js001)、amp-224(gsk-2661380)、pf-06801591、替雷利珠单抗(tislelizumab)(bgb-a317)、abbv-181、bi 754091或shr-1210。
69.在一个实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是抗pd-l1抗体。
70.在一个实施方案中，所述抗pd-l1抗体是阿特珠单抗(atezolizumab)(tecentriq；rg7446；mpdl3280a；r05541267)、度伐单抗(durvalumab)(medi4736)、bms-936559、阿维单抗(avelumab)(bavencio)、洛达利单抗(lodapolimab)(ly3300054)、cx-072(proclaim-cx-072)、faz053、kn035或mdx-1105。
71.在一个实施方案中，所述组合物或药物制剂还包含铂化合物。
72.在一个实施方案中，所述铂化合物包含顺铂。
73.在一个实施方案中，所述组合物或药物制剂包含免疫检查点抑制剂和铂化合物。
74.在一个实施方案中，所述组合物或药物制剂是药物组合物。
75.在一个实施方案中，所述药物组合物还包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。
76.在一个实施方案中，所述药物制剂是药盒。
77.在一个实施方案中，所述rna和任选地所述免疫检查点抑制剂在单独的小瓶中。
78.在一个实施方案中，所述组合物或药物制剂还包含所述rna和任选地所述免疫检查点抑制剂用于治疗或预防hpv阳性癌症的使用说明。
79.在一个方面中，本发明涉及本文中所述的组合物或药物制剂，其用于药用用途。
80.在一个实施方案中，所述药用用途包括疾病或病症的治疗性或预防性治疗。
81.在一个实施方案中，所述疾病或病症的治疗性或预防性治疗包括治疗或预防hpv阳性癌症。
82.在一个实施方案中，本文中所述的组合物或药物制剂用于施用于人。
83.在一个实施方案中，所述疾病或病症的治疗性或预防性治疗还包括施用放射治疗，优选局部放射治疗。
84.在一个实施方案中，所述疾病或病症的治疗性或预防性治疗还包括施用另外的治疗。在一个实施方案中，所述另外的治疗包括：手术以切去、切除肿瘤或使其减积，和/或化学治疗。在一个实施方案中，所述另外的治疗包括施用另外的治疗剂。在一个实施方案中，所述另外的治疗剂包含抗癌治疗剂。
85.在一个方面中，本发明涉及在对象中治疗hpv阳性癌症的方法，其包括向所述对象施用至少一种rna，其中所述至少一种rna编码：
86.(i)包含人乳头瘤病毒(hpv)e6蛋白、其免疫原性变体、或者所述hpv e6蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列；以及
87.(ii)包含hpv e7蛋白、其免疫原性变体、或者所述hpv e6蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列；
88.在一个实施方案中，(i)或(ii)中所述氨基酸序列中的每一种均由单独的rna编码。
89.在一个实施方案中，
90.(i)编码(i)中所述氨基酸序列的rna包含seq id no：2的核苷酸序列，或者与seq id no：2的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或
91.(ii)(i)中所述氨基酸序列包含seq id no：1的氨基酸序列，或者与seq id no：1的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
92.在一个实施方案中，
93.(i)编码(ii)中所述氨基酸序列的rna包含seq id no：4的核苷酸序列，或者与seq id no：4的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列；和/或
94.(ii)(ii)中所述氨基酸序列包含seq id no：3的氨基酸序列，或者与seq id no：3的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
95.在一个实施方案中，(i)或(ii)中的至少一种氨基酸序列包含增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列。
96.在一个实施方案中，(i)或(ii)中的每种氨基酸序列均包含增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列。
97.在一个实施方案中，所述增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列包含对应于mhc分子、优选mhc i类分子的跨膜和胞质结构域的氨基酸序列。
98.在一个实施方案中，所述增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列包含seq id no：26的氨基酸序列，或者与seq id no：26的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
99.在一个实施方案中，所述增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列还包含编码分泌信号肽的氨基酸序列。
100.在一个实施方案中，所述分泌信号肽包含seq id no：25的氨基酸序列，或者与seq id no：25的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
101.在一个实施方案中，(i)或(ii)中的至少一种氨基酸序列包含破坏免疫耐受的氨基酸序列，和/或至少一种rna与编码破坏免疫耐受的氨基酸序列的rna共施用。
102.在一个实施方案中，(i)或(ii)中的每种氨基酸序列均包含破坏免疫耐受的氨基酸序列，和/或每种rna均与编码破坏免疫耐受的氨基酸序列的rna共施用。
103.在一个实施方案中，所述破坏免疫耐受的氨基酸序列包含辅助表位，优选破伤风类毒素来源的辅助表位。
104.在一个实施方案中，所述破坏免疫耐受的氨基酸序列包含seq id no：27的氨基酸序列，或者与seq id no：27的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列。
105.在一个实施方案中，(i)或(ii)中所述氨基酸序列中的至少一种由这样的编码序列来编码：与野生型编码序列相比，其g/c含量提高，和/或其是经密码子优化的，其中所述密码子优化和/或所述g/c含量提高优选地不改变所编码氨基酸序列的序列。
106.在一个实施方案中，(i)或(ii)中所述氨基酸序列中的每一种均由这样的编码序列来编码：与野生型编码序列相比，其g/c含量提高，和/或其是经密码子优化的，其中所述密码子优化和/或所述g/c含量提高优选地不改变所编码氨基酸序列的序列。
107.在一个实施方案中，至少一种rna是经修饰rna，特别是稳定化的mrna。在一个实施方案中，至少一种rna包含代替至少一个尿苷的经修饰核苷。在一个实施方案中，至少一种rna包含代替每个尿苷的经修饰核苷。在一个实施方案中，每种rna均包含代替至少一个尿苷的经修饰核苷。在一个实施方案中，每种rna均包含代替每个尿苷的经修饰核苷。在一个实施方案中，经修饰核苷独立地选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。
108.在一个实施方案中，至少一种rna包含5’帽m
27，2
’‑ogppsp(5’)g。
109.在一个实施方案中，每种rna均包含5’帽m
27，2
’‑ogppsp(5’)g。
110.在一个实施方案中，至少一种rna包含含有以下的5’utr：seq id no：30的核苷酸序列，或者与seq id no：30的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
111.在一个实施方案中，每种rna均包含含有以下的5’utr：seq id no：30的核苷酸序列，或者与seq id no：30的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
112.在一个实施方案中，至少一种rna包含含有以下的3’utr：seq id no：31的核苷酸序列，或者与seq id no：31的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
113.在一个实施方案中，每种rna均包含含有以下的3’utr：seq id no：31的核苷酸序列，或者与seq id no：31的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
114.在一个实施方案中，至少一种rna包含poly-a序列。
115.在一个实施方案中，每种rna均包含poly-a序列。
116.在一个实施方案中，所述poly-a序列包含至少100个核苷酸。
117.在一个实施方案中，所述poly-a序列包含seq id no：32的核苷酸序列或由seq id no：32的核苷酸序列组成。
118.在一个实施方案中，(i)中所述的氨基酸序列，即包含hpv e6蛋白、其免疫原性变体、或者所述hpv e6蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列，从n端到c端包含：n-分泌信号肽-e6-破坏免疫耐受的氨基酸序列-增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列-c。
119.在一个实施方案中，(ii)中所述的氨基酸序列，即包含hpv e7蛋白、其免疫原性变体、或者所述hpv e7蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列，从n端到c端包含：n-分泌信号肽-e7-破坏免疫耐受的氨基酸序列-增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列-c。
120.在一个实施方案中，所述rna通过注射来施用。
121.在一个实施方案中，所述rna通过静脉内施用来施用。
122.在一个实施方案中，所述rna被配制为脂质复合物颗粒。
123.在一个实施方案中，所述rna脂质复合物颗粒可通过将所述rna与脂质体混合来获得。
124.在一个实施方案中，本文中所述的方法还包括向所述对象施用免疫检查点抑制剂。
125.在一个实施方案中，所述免疫检查点抑制剂选自pd-1抑制剂和pd-l1抑制剂。
126.在一个实施方案中，所述免疫检查点抑制剂选自抗pd-1抗体和抗pd-l1抗体。
127.在一个实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是抗pd-1抗体。
128.在一个实施方案中，所述抗pd-1抗体是派姆单抗(keytruda；mk-3475)、纳武单抗(opdivo；bms-936558)、皮地利珠单抗(ct-011)、西米普利单抗(libtayo，regn2810)、斯巴达珠单抗(pdr001)、medi0680(amp-514)、多塔利单抗(tsr-042)、西利单抗(jnj 63723283)、特瑞普利单抗(js001)、amp-224(gsk-2661380)、pf-06801591、替雷利珠单抗(bgb-a317)、abbv-181、bi 754091或shr-1210。
129.在一个实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是抗pd-l1抗体。
130.在一个实施方案中，所述抗pd-l1抗体是阿特珠单抗(tecentriq；rg7446；mpdl3280a；r05541267)、度伐单抗(medi4736)、bms-936559、阿维单抗(bavencio)、洛达利单抗(ly3300054)、cx-072(proclaim-cx-072)、faz053、kn035或mdx-1105。
131.在一个实施方案中，所述对象是人。
132.在一个实施方案中，本文中所述的方法还包括向所述对象施用放射治疗，优选局部放射治疗。
133.在一个实施方案中，本文中所述的方法包括向所述对象施用放射治疗(优选局部放射治疗)和免疫检查点抑制剂。
134.在一个实施方案中，所述方法还包括施用另外的治疗。在一个实施方案中，所述另外的治疗包括：手术以切去、切除肿瘤或使其减积，和/或化学治疗。在一个实施方案中，所述另外的治疗包括施用另外的治疗剂。在一个实施方案中，所述另外的治疗剂包含抗癌治疗剂。
135.在一个实施方案中，本文中所述的方法还包括向所述对象施用铂化合物。
136.在一个实施方案中，所述铂化合物包含顺铂。
137.在一个实施方案中，本文中所述的方法包括向所述对象施用免疫检查点抑制剂和铂化合物。
138.在一个实施方案中，本文中所述的方法包括向所述对象施用放射治疗(优选局部放射治疗)和铂化合物。
139.在一个实施方案中，本文中所述的方法包括向所述对象施用放射治疗(优选局部放射治疗)、免疫检查点抑制剂和铂化合物。
140.在一个方面中，本文中提供了用于本文中所述的方法的本文中所述的rna，例如，
141.(i)编码包含hpv e6蛋白、其免疫原性变体、或者所述hpv e6蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列的rna；以及
142.(ii)编码包含hpv e7蛋白、其免疫原性变体、或者所述hpv e7蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列的rna。
143.附图简述
144.图1：在人源化hla转基因a2dr1小鼠中免疫接种e6和e7 rna-lpx诱导了强的e6和e7抗原特异性t细胞应答
145.将a2dr1小鼠(表达人hla-a*0201和hla-drb1*01分子)(n＝3/组)用30μg e6或e7 rna-lpx免疫接种(d0、d7、d14、d21)，并在最后一次免疫接种之后7天(d28)切除脾，以在ifnγ elispot中评估针对疫苗编码的抗原的t细胞反应性。针对e6、e7或对照蛋白(pp65)重叠肽合并物分析经(a)e6 rna-lpx和(b)e7 rna-lpx疫苗接种的a2dr1小鼠的t细胞应答，并计数ifnγ斑点。使用单因素anova、tukey事后检验确定显著性。平均值
±
sem。
146.图2：e7 rna-lpx免疫接种介导进行性hpv16阳性肿瘤的完全缓解并建立保护性t细胞记忆
147.(a至d)将tc-1 luc肿瘤细胞移植到舌的黏膜下衬里中。五天之后，将小鼠用e7 rna-lpx(n＝13)或无关(ova
257-264
)rna-lpx(n＝12)进行免疫接种。(a)如通过体内生物发光测量的tc-1 luc肿瘤生长动力学。(b至d)在肿瘤攻击之后13天处死小鼠并收获肿瘤组织(n＝3/组)。通过流式细胞术测量用e7 rna-lpx或无关(ova
257-264
)rna-lpx处理的小鼠中(b)cd45
+
和(c)e7
49-57
多聚体
+
cd8
+
t细胞的比例。(d)经e7 rna-lpx处理的小鼠的血液和肿瘤中e7
49-57
多聚体
+
cd8
+
t细胞的cd49α表达。(e、f)用e7 rna-lpx或无关(egfp)rna-lpx免疫接种三次(d4、d7、d13)的小鼠(n＝10/组)中的tc-1肿瘤生长(e)和存活(f)。处理开始时平均肿瘤尺寸为约6mm3。(g)在初始tc-1肿瘤攻击之后用tc-1再攻击的经e7 rna-lpx处理的小鼠(n＝10)的存活。未经处理的小鼠(n＝10)作为对照组。(h、i)用e7 rna-lpx(n＝9)或无关(ova
257-264
)rna-lpx(n＝10)免疫接种四次(d14、d21、d27、d33)的小鼠中的c3肿瘤生长(h)和存活(i)。处理开始时平均肿瘤尺寸为约25mm3。(j)在c3肿瘤攻击之后用tc-1再攻击的经e7 rna-lpx处理的小鼠的存活(n＝12/组)。未经处理的小鼠(n＝10)作为对照组。使用(a)双因素anova、sidak多重比较检验、(b、c)未配对双尾student t检验和(f、g、i、j)mantel-cox对数秩检验来确定显著性。比例描述了具有完全响应(complete response，cr)的小鼠的分数。平均值
±
sem。图3：经e7 rna-lpx免疫接种的小鼠的肿瘤具有活跃的免疫浸润、e7特异性cd8+t细胞和促炎性、细胞毒性和较少的免疫抑制结构(contexture)
148.对用e7 rna-lpx或无关(ova
257-264
)rna-lpx进行一次免疫接种之后11天从小鼠(n＝5/组)切除的tc-1(a、b、c至e)和c3肿瘤(a、b、f至h)中的til的分析(治疗开始时tc-1为约63mm3并且c3为约65mm3)。如通过流式细胞术测量的tc-1和c3肿瘤中(a)cd45
+
细胞的百分比和(b)e7
49-57
特异性cd8
+
t细胞的频率。(b，右)tc-1肿瘤中的代表性e7
49-57
多聚体染色。(c、f)(c)tc-1和(f)c3肿瘤中白细胞亚群的频率。(d、g)(d)tc-1和(g)c3肿瘤中肿瘤浸润cd4
+
t细胞和cd8
+
t细胞的ki67
+
分数。(e、h)(e)tc-1和(h)c3肿瘤的tam中inos和cd206的表达。(i)通过qrt-pcr确定了在用e7 rna-lpx或无关(ova
257-264
)rna-lpx进行两次免疫接种之后切除的tc-1(左)和c3肿瘤(右)中所选基因的基因表达分析。在最后一次免疫接种之后两天收获肿瘤组织。热图显示了所计算的log2倍数变化并相对于经无关(ova
257-264
)rna-lpx处理的小鼠归一化。使用未配对双尾student t检验来确定(a至h)显著性并使用多重比较检验来确定(i)显著性。平均值
±
sem。til：肿瘤浸润淋巴细胞；tam：肿瘤相关巨噬细胞；inos：诱导型一氧化氮合酶。
149.图4：e7 rna-lpx免疫接种通过使抗pd-l1难治性肿瘤响应而与检查点阻断协同作用
150.(a)用e7 rna-lpx或无关(ova
257-264
)rna-lpx最后一次免疫接种(d13、d19)之后两天从荷tc-1瘤小鼠(n＝5/组)切除的tc-1肿瘤中的差异基因表达分析。火山图示出了计算的差异表达的基因(log2倍数变化＞2，fdr 0.01)，并相对于经无关(ova
257-264
)rna-lpx处理的小鼠归一化。突出显示了编码可成药免疫检查点的基因。(b至d)用e7rna-lpx或无关(ova
257-264
)rna-lpx免疫接种(d11)并用抗pd-l1(apd-l1)抗体或同种型对照处理3至4天(d15、d18、d21、d25、d28)的荷tc-1瘤小鼠(n＝14/组)的肿瘤生长(b)和存活(c)。处理开始时，tc-1肿瘤的平均尺寸为约120mm3。(d)外周e7
49-57
多聚体阳性cd8
+
t细胞的分数(d17、d25、d32)。使用(c)mantel-cox对数秩检验和(d)双因素anova、sidak多重比较检验来确定经e7 rna-lpx与e7rna-lpx+apd-l1处理的小鼠之间的显著性。(b)比例描述了具有完全响应(cr)的小鼠的分数。平均值
±
sem。fdr＝错误发现率。
151.图5：lrt与e7 rna-lpx疫苗接种协同作用以控制所建立的hpv16
+
肿瘤。
152.(a至c)用e7或对照(ova
257-264
)rna-lpx进行免疫接种并以12gy、7gy或1.8gy对肿瘤进行局部辐照的荷s.c.tc-1瘤(平均肿瘤体积为75mm3)的c57bl/6小鼠(n＝6至14/组)中的抗肿瘤作用。(a)个体肿瘤生长曲线。(b)存活。(c)如通过流式细胞术确定的血液中的e7多聚体
+
cd8
+
t细胞(n＝4/组)。(d、e)用e7或对照(ova
257-264
)rna-lpx进行免疫接种并以12gy对肿瘤进行局部辐照的荷s.c.c3瘤(平均肿瘤体积为65mm3)的c57bl/6小鼠(n＝10至11/组)中的抗肿瘤作用。(d)存活。(e)个体肿瘤生长曲线。使用mantel-cox对数秩检验确定(b、d)中的显著性并使用单因素anova、tukey多重比较检验确定(c)中的显著性。(a、e)比例描述了具有完全响应(cr)的小鼠的分数。平均值
±
sem。图6：经e7 rna-lpx处理的小鼠的肿瘤被效应免疫细胞高度浸润。
153.从用e7或对照(ova
257-264
)rna-lpx进行疫苗接种并以12gy进行局部辐照的荷s.c.tc-1瘤(平均肿瘤体积为165mm3)的c57bl/6小鼠(n＝6/组)中切除的s.c.tc-1肿瘤、脾和肿瘤引流淋巴结(腹股沟)的流式细胞术表征。(a)平均肿瘤生长。(b)肿瘤浸润cd45
+
白细胞和肿瘤细胞的分数以及(c)cd4
+
、cd8
+
、调节性t(regulatory t，treg)细胞和nk细胞的分数。(d)肿瘤、脾和肿瘤引流淋巴结中e7
49-57
多聚体阳性cd8
+
t细胞的分数。代表性伪色图(pseudocolor plot)示出了tc-1肿瘤中的e7
49-57
多聚体染色。(e)在用e7
49-57
肽离体再刺激之后cd8
+
til上的ifnγ和tnfα的胞内细胞因子染色。使用单因素anova、tukey多重比较检验确定(b至e)中的显著性。平均值
±
sem。ns＝无显著性。图7：组合的lrt增强肿瘤细胞死亡、降低局部免疫抑制并促进疫苗诱导的cd8
+
t细胞增殖。
154.(a至f)来自用e7或对照(ova
257-264
)rna-lpx进行疫苗接种并以12gy进行局部辐照的荷s.c.tc-1瘤(平均肿瘤体积为125mm3)的c57bl/6小鼠(n＝6至7/组)的肿瘤细胞的流式细胞术表征。(a)tc-1肿瘤细胞计数/mg肿瘤组织。(b)经切割的胱天蛋白酶-3
+
tc-1肿瘤细胞的分数。(c至f)tc-1肿瘤细胞上的(c)fas、(d)mhc i类(泛h-2)、(e)pd-l1和(f)qa-1b的表达。(g)来自用e7或对照(ova
257-264
)rna-lpx进行免疫接种并以12gy进行局部辐照的荷tc-1瘤(平均肿瘤体积为160mm3)的c57bl/6小鼠(n＝4/组)的tc-1肿瘤切片中的缺氧肿瘤区域的免疫荧光染色。在肿瘤切除之前1小时注射缺氧探针哌莫硝唑(pimonidazole)。哌莫硝唑
+
区域以总肿瘤区域的分数来确定。(h)如通过溴脱氧尿苷(bromdeoxyuridine，brdu)体内标记确定的来自用e7或对照(ova
257-264
)rna-lpx进行疫苗接种并以12gy进行局部辐照的荷s.c.tc-1瘤(平均肿瘤体积为165mm3，)的c57bl/6小鼠(n＝6/组)的brdu
+
cd4和cd8 til
的分数。在器官切除之前一天用1mg brdu碱基类似物注射小鼠。使用单因素anova、tukey多重比较检验来确定(a至f)中的显著性并使用未配对双尾student t检验来确定(g、h)中的显著性。平均值
±
sem。mfi＝中位荧光强度。
155.图8：lrt使e7特异性cd8
+
t细胞应答更强效和持久。
156.来自用e7 rna-lpx进行疫苗接种并以12gy进行局部辐照的荷s.c.tc-1瘤(平均肿瘤体积为120mm3)的c57bl/6小鼠(n＝7/组)的肿瘤浸润cd8 t细胞的流式细胞术表征。(a)平均肿瘤生长曲线。(b)tc-1肿瘤中的e7特异性cd8
+
til的分数。(c至e)e7特异性cd8
+
til中的(c)tim-3、(d)pd-1的表达和(e)nkg2ab
+
细胞的分数。(f至g)用负载e7
49-57
肽的c57bl/6 bmdc离体再刺激的经macs分选的cd8
+
til中(f)ifnγ和tnfα以及(g)il-2的胞内细胞因子染色。通过未配对双尾student t检验来确定(b至g)中的显著性。平均值
±
sem。mfi＝中位荧光强度。
157.图9：e7 rna-lpx和顺铂化学治疗协同作用以排斥hpv16
+
tc-1肿瘤。
158.将荷tc-1 luc瘤c57bl/6小鼠在第16天用40μg e7 rna-lpx或对照(ova)rna-lpx进行免疫接种，并在第22天和第28天用80μg顺铂或pbs i.p.处理(n＝10至12只小鼠/组)。a)个体肿瘤生长曲线。b)直至第40天的平均肿瘤生长，此时对照rna-lpx+pbs组中小鼠的数目降低至45％(只要n≥5只小鼠即可用locf)。双因素anova与tukey多重比较检验(示出了第40天的结果)。平均值
±
sem。c)存活。无bonferroni校正的对数秩检验。locf＝末次观测值结转法；ova＝鸡卵清蛋白；rna lpx＝核糖核酸脂质复合物；sem＝平均值的标准误差。
159.序列描述
160.下表提供了本文中引用的某些序列的列表。
161.162.163.164.165.166.167.168.169.170.171.172.[0173][0174]
发明详述
[0175]
尽管以下详细描述了本公开内容，但是应理解，本公开内容不限于本文中所述的
特定方法、方案和试剂，因为这些可改变。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述一些具体实施方案的目的，而不旨在限制将仅受所附权利要求书限制的本公开内容的范围。除非另外限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
[0176]
优选地，将本文中使用的术语定义为如“a multilingual glossary of biotechnological terms：(iupac recommendations)”，h.g.w.leuenberger，b.nagel和h.编辑，helvetica chimica acta，ch-4010 basel，switzerland，(1995)中所述。
[0177]
除非另外指出，否则本公开内容的实践将采用本领域的文献中阐明的化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组dna技术的常规方法(参见例如，molecular cloning：a laboratory manual，第二版，j.sambrook et al.编辑，cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor 1989)。
[0178]
在下文中，将描述本公开内容的要素。这些要素与一些具体实施方案一起列出，然而，应理解，其可以以任何方式且以任意数量组合以产生另外的实施方案。多种不同描述的实例和实施方案不应被理解为将本公开内容仅限于明确描述的一些实施方案。本说明书应理解为公开和涵盖将明确描述的实施方案与任何数目的所公开要素组合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则所有描述的要素的任何排列和组合应认为被本说明书公开。
[0179]
术语“约”意指大约或接近，并且在一个实施方案中在本文中所列的数值或范围的情况下意指所记载或要求保护的数值或范围的
±
20％、
±
10％、
±
5％、或
±
3％。
[0180]
除非本文中另外指出或者明显与上下文相矛盾，否则在描述本公开内容的上下文中(尤其在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词以及类似提及应解释为涵盖一个/种和/或更多个/种。本文中值的范围的记载仅旨在用作单独提及落在所述范围内的各个单独值的速记法。除非本文中另外指出，否则各个单独值被并入到本说明书中，就像其在本文中被单独记载。除非本文中另外指出或者在其他情况下明显与上下文相矛盾，否则本文中所述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地举例说明本公开内容，而不对权利要求书的范围提出限制。本说明书中的语言均不应被解释为指明对实践本公开内容必需的任何未要求保护的要素。
[0181]
除非另有明确说明，否则在本文件的上下文中使用术语“包含/包括”以表示除了由“包含/包括”引入的列表的成员之外还可任选地存在另一些成员。然而，考虑了作为本公开内容的具体实施方案，术语“包含/包括”涵盖不存在另一些成员的可能性，即，出于这个目的，实施方案“包含/包括”应理解为具有“由
……
组成”的含义。
[0182]
在本说明书的正文通篇引用了数篇文献。本文中无论是在上文还是在下文引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、用法指导等)均在此通过引用整体并入。本文中的内容均不应解释为承认本公开内容无权早于这样的公开内容。
[0183]
定义
[0184]
下面将提供适用于本公开内容所有方面的定义。除非另外指出，否则以下术语具有以下含义。任何未经定义的术语均具有其本领域公认的含义。
[0185]
本文中使用的术语例如“降低”或“抑制”意指引起水平总体降低例如约5％或更大、约10％或更大、约20％或更大、约50％或更大、或约75％或更大的能力。术语“抑制”或类
似短语包括完全或基本上完全抑制，即降低至零或基本上至零。
[0186]
在一个实施方案中，术语例如“提高”或“增强”涉及提高或增强了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约80％、或至少约100％。
[0187]
本文中使用的“生理ph”是指约7.5的ph。
[0188]
术语“离子强度”是指特定溶液中不同种类的离子物质的数目与其各自电荷之间的数学关系。因此，离子强度i在数学上由下式表示：
[0189][0190]
其中c是特定离子物质的摩尔浓度，并且z是其电荷的绝对值。总和∑取自溶液中所有不同种类的离子(i)。
[0191]
根据本公开内容，在一个实施方案中，术语“离子强度”涉及单价离子的存在。关于二价离子，特别是二价阳离子的存在，在一个实施方案中，其浓度或有效浓度(游离离子的存在)由于螯合剂的存在而足够低以防止rna的降解。在一个实施方案中，二价离子的浓度或有效浓度低于用于水解rna核苷酸之间的磷酸二酯键的催化水平。在一个实施方案中，游离二价离子的浓度为20μm或更小。在一个实施方案中，不存在或基本上不存在游离二价离子。
[0192]
术语“冷冻”涉及液体的固化，通常伴随着热量的去除。
[0193]
术语“冻干”或其变化形式是指通过将物质冷冻并随后降低周围压力以使该物质中的冷冻介质直接从固相升华至气相而进行的物质的冷冻干燥。
[0194]
术语“喷雾干燥”是指通过将(加热的)气体与在容器(喷雾干燥器)内雾化(喷雾)的流体混合来使物质喷雾干燥，其中来自所形成的液滴的溶剂蒸发，导致干燥粉末。
[0195]
术语“冷冻保护剂”涉及添加至制剂以在冷冻阶段期间保护活性成分的物质。
[0196]
术语“冻干保护剂”涉及添加至制剂以在干燥阶段期间保护活性成分的物质。
[0197]
术语“重构”涉及向干燥产品添加溶剂(例如水)以使其返回液体状态，例如其原始液体状态。
[0198]
在本公开内容的上下文中的术语“重组”意指“通过遗传工程制备的”。在一个实施方案中，在本公开内容的上下文中的“重组物体”不是天然存在的。
[0199]
本文中使用的术语“天然存在的”是指物体可在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可从自然界中的来源分离且没有在实验室中被人有意修饰的肽或核酸是天然存在的。术语“在自然界中发现”意指“存在于自然界中”并且包括已知的物体以及尚未从自然界发现和/或分离但可在将来从天然来源发现和/或分离的物体。
[0200]
在本公开内容的上下文中，术语“颗粒”涉及由分子或分子复合物形成的结构化实体。在一个实施方案中，术语“颗粒”涉及微米或纳米尺寸的结构，例如微米或纳米尺寸的密实结构。
[0201]
在本公开内容的上下文中，术语“rna脂质复合物颗粒”涉及包含脂质(特别是阳离子脂质)和rna的颗粒。带正电荷的脂质体与带负电荷的rna之间的静电相互作用导致rna脂质复合物颗粒的络合和自发形成。带正电荷的脂质体通常可使用阳离子脂质(例如dotma)和另外的脂质(例如dope)来合成。在一个实施方案中，所述rna脂质复合物颗粒是纳米粒。
[0202]
在颗粒制剂中，将每种rna种类(例如，编码hpv e6疫苗抗原的rna和编码hpv e7疫苗抗原的rna)独立配制成单独的颗粒制剂是可能的。在那种情况下，每种单独的颗粒制剂将包含一种rna种类。单独的颗粒制剂可作为独立的实体存在，例如在独立的容器中。这样的制剂可通过分别将每种rna种类(通常各自以含rna的溶液的形式)与颗粒形成剂一起提供从而允许形成颗粒来获得。各颗粒将仅包含当形成颗粒时提供的特定rna种类(单独的颗粒制剂)。在一个实施方案中，组合物例如药物组合物包含多于一种单独的颗粒制剂。各药物组合物称为混合颗粒制剂。根据本发明的混合颗粒制剂可通过如上所述独立地形成单独的颗粒制剂、然后混合单独的颗粒制剂的步骤来获得。通过混合步骤，可获得包含含rna之颗粒的混合群体的制剂(用于举例说明：例如，第一颗粒群体可包含编码hpv e6疫苗抗原的rna，并且第二颗粒制剂可包含编码hpve7疫苗抗原的rna)。单独的颗粒群体可一起在包含单独的颗粒制剂的混合群体的一个容器中。或者，可将药物组合物的所有rna种类(例如，编码hpv e6疫苗抗原的rna和编码hpv e7疫苗抗原的rna)一起配制成组合颗粒制剂。这样的制剂可通过将所有rna种类的组合制剂(通常是组合溶液)以及颗粒形成剂一起提供从而允许形成颗粒来获得。与混合颗粒制剂相反，组合颗粒制剂通常将包含含有多于一种rna种类的颗粒。在组合颗粒组合物中，不同的rna种类通常一起存在于单个颗粒中。
[0203]
本公开内容中使用的“纳米粒”是指包含rna和至少一种阳离子脂质并且具有适合于静脉内施用的平均直径的颗粒。
[0204]
术语“平均直径”是指颗粒的平均流体动力学直径，如通过动态光散射(dynamic light scattering，dls)以及使用所谓的累积量算法(cumulant algorithm)进行数据分析而测量的，其提供了具有长度维度的所谓的z
平均值
和无量纲的多分散性指数(polydispersity index，pi)的结果(koppel，d.，j.chem.phys.57，1972，第4814至4820页，iso 13321)。在此，颗粒的“平均直径”、“直径”或“尺寸”与该z
平均值
的值同义使用。
[0205]
术语“多分散性指数”在本文中用作颗粒(例如，纳米粒)系综(ensemble)的尺寸分布的量度。基于动态光散射测量通过所谓的累积量分析来计算多分散性指数。
[0206]
术语“乙醇注射技术”是指其中通过针将包含脂质的乙醇溶液快速注射到水溶液中的过程。该作用将脂质分散在整个溶液中并促进脂质结构形成，例如脂质囊泡形成例如脂质体形成。一般来说，本文中所述的rna脂质复合物颗粒可通过将rna添加至胶体脂质体分散体来获得。在一个实施方案中，使用乙醇注射技术，如下形成这样的胶体脂质体分散体：在搅拌下将包含脂质(例如阳离子脂质(如dotma)和另外的脂质)的乙醇溶液注射到水溶液中。在一个实施方案中，本文中所述的rna脂质复合物颗粒无需挤出步骤即可获得。
[0207]
术语“挤出”及其变化形式是指产生具有固定的截面轮廓的颗粒。特别地，其是指颗粒的小型化，由此迫使颗粒通过具有限定孔的滤器。
[0208]
本文中使用的术语“共施用”及其变化形式等是指同步(concurrently)、同时(simultaneously)或基本上同时施用两种或更多种药剂，作为单一制剂的一部分或作为通过相同或不同途径施用的多种制剂。本文中使用的“基本上同时”意指在彼此约1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时或6小时的时期内。
[0209]
本公开内容描述了分别与给定核酸序列或氨基酸序列(参考序列)具有一定程度同一性的核酸序列和氨基酸序列。
[0210]
两个核酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的核苷酸的百分比。两个氨
基酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的氨基酸的百分比。
[0211]
术语“相同(％)”、“同一性(％)”或类似术语特别地旨在是指待比较的序列之间在最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。所述百分比是纯统计学的，并且两个序列之间的差异可以(但不一定)是随机分布在待比较的序列的整个长度上。两个序列的比较通常在关于区段或“比较窗口”进行最佳比对以鉴定相应序列的局部区域之后通过比较所述序列来进行。用于比较的最佳比对可人工进行，或者借助于smith and waterman，1981，ads app.math.2，482的局部同源性算法，借助于needleman and wunsch，1970，j.mol.biol.48，443的局部同源性算法，借助于pearson and lipman，1988，proc.natl acad.sci.usa 88,2444的相似性检索算法，或借助于使用所述算法的计算机程序(在wisconsin genetics software package，genetics computer group，575 science drive，madison，wis中的gap、bestfit、fasta、blast p、blast n和tfasta)来进行。在一些实施方案中，使用可在美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information，ncbi)网站(例如，在blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi？page_type＝blastsearch&blast_spec＝blast2seq&link_loc＝align2seq)上获得的blastn或blastp算法来确定两个序列的百分比同一性。在一些实施方案中，在ncbi网站上用于blastn算法的算法参数包括：(i)预期阈值设置为10；(ii)字长设置为28；(iii)查询范围内的最大匹配设置为0；(iv)匹配/不匹配评分设置为1、-2；(v)空位成本(gap cost)设置为线性；以及(vi)正在使用的低复杂性区域的筛选程序(filter)。在一些实施方案中，在ncbi网站上用于blastp算法的算法参数包括：(i)预期阈值设置为10；(ii)字长设置为3；(iii)查询范围内的最大匹配设置为0；(iv)矩阵设置为blosum62；(v)空位成本设置为存在11：延伸：1；以及(vi)条件组成评分矩阵调整。
[0212]
百分比同一性通过确定待比较序列所对应的相同位置的数目，将该数目除以比较的位置数目(例如，参考序列中的位置数目)，并将该结果乘以100来获得。
[0213]
在一些实施方案中，针对为参考序列全长的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的区域给出同一性程度。例如，在一些实施方案中，如果参考核酸序列由200个核苷酸组成，则针对连续核苷酸中的至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个核苷酸给出同一性程度。在一些实施方案中，针对参考序列的全长给出同一性程度。
[0214]
分别与给定核酸序列或氨基酸序列具有特定同一性程度的核酸序列或氨基酸序列可具有所述给定序列的至少一种功能性特性，例如，并且在一些情况下，与所述给定序列在功能上等同。一个重要的特性包括免疫原性特性，特别是当施用于对象时。在一些实施方案中，与给定核酸序列或氨基酸序列具有特定同一性程度的核酸序列或氨基酸序列与给定序列在功能上等同。
[0215]
rna
[0216]
在本公开内容中，术语“rna”涉及包括核糖核苷酸残基的核酸分子。在一些优选实施方案中，rna包含全部或大部分的核糖核苷酸残基。本文中使用的“核糖核苷酸”是指在β-d-呋喃核糖基基团的2
’‑
位具有羟基的核苷酸。rna涵盖但不限于双链rna、单链rna、分离的rna(例如部分纯化的rna)、基本上纯的rna、合成rna、重组产生的rna以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或更多个核苷酸而不同于天然存在的rna之经修饰的rna。这样的改变
可以是指将非核苷酸物质添加至内部rna核苷酸或添加至rna末端。本文中还考虑了rna中的核苷酸可以是非标准核苷酸，例如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开内容，这些改变的rna被认为是天然存在rna的类似物。
[0217]
在本公开内容的某些实施方案中，rna是与编码肽或蛋白质的rna转录物相关的信使rna(messenger rna，mrna)。如本领域中认可的，mrna通常包含5’非翻译区(5
’‑
untranslated region，5
’‑
utr)、肽编码区和3’非翻译区(3
’‑
untranslated region，3
’‑
utr)。在一些实施方案中，rna通过体外转录或化学合成来产生。在一个实施方案中，mrna通过使用dna模板进行体外转录来产生，其中dna是指包含脱氧核糖核苷酸的核酸。
[0218]
在一个实施方案中，rna是体外转录的rna(in vitro transcribed rna，ivt-rna)，并且可通过体外转录合适的dna模板来获得。用于控制转录的启动子可以是任何rna聚合酶的任何启动子。用于体外转录的dna模板可通过克隆核酸，特别是cdna，并将其引入到用于体外转录的合适载体中来获得。cdna可通过rna的反转录来获得。
[0219]
在一个实施方案中，rna可具有经修饰核苷。在一些实施方案中，rna包含代替至少一个(例如，每个)尿苷的经修饰核苷。
[0220]
本文中使用的术语“尿嘧啶”描述了可存在于rna核酸中的核碱基之一。尿嘧啶的结构为：
[0221][0222]
本文中使用的术语“尿苷”描述了可存在于rna中的核苷之一。尿苷的结构为：
[0223][0224]
utp(尿苷5
’‑
三磷酸)具有以下结构：
[0225][0226]
假utp(假尿苷5
’‑
三磷酸)具有以下结构：
[0227][0228]“假尿苷”是作为尿苷的异构体的经修饰核苷的一个实例，其中尿嘧啶通过碳-碳键而不是氮-碳糖苷键与戊糖环连接。
[0229]
另一种示例性的经修饰核苷为n1-甲基-假尿苷(m1ψ)，其具有以下结构：
[0230][0231]
n1-甲基-假-utp具有以下结构：
[0232][0233]
另一种示例性的经修饰核苷为5-甲基-尿苷(m5u)，其具有以下结构：
[0234][0235]
在一些实施方案中，本文中所述的rna中的一个或更多个尿苷被经修饰核苷替代。在一些实施方案中，经修饰核苷是经修饰尿苷。
[0236]
在一些实施方案中，替代尿苷的经修饰尿苷是假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5u)。
[0237]
在一些实施方案中，替代rna中的一个或更多个尿苷的经修饰核苷可以是以下中的任一种或更多种：3-甲基-尿苷(m3u)、5-甲氧基-尿苷(mo5u)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2u)、4-硫代-尿苷(s4u)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5u)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘代-尿苷或5-溴代-尿苷)、尿苷5-羟乙酸(cmo5u)、尿苷5-羟乙酸甲酯(mcmo5u)、5-羧甲基-尿苷(cm5u)、1-羧甲
基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5u)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm5u)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5u)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2u)、5-氨甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2u)、5-甲基氨甲基-尿苷(mnm5u)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2u)、5-甲基氨甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2u)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5u)、5-羧甲基氨甲基-尿苷(cmnm5u)、5-羧甲基氨甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2u)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5u)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2u)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2u)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、二氢尿苷(d)、二氢假尿苷、5，6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5d)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、n1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3u)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨甲基)尿苷(inm5u)、5-(异戊烯基氨甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2u)、α-硫代-尿苷、2
’‑
o-甲基-尿苷(um)、5，2
’‑
o-二甲基-尿苷(m5um)、2
’‑
o-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2
’‑
o-甲基-尿苷(s2um)、5-甲氧基羰基甲基-2
’‑
o-甲基-尿苷(mcm5um)、5-氨甲酰基甲基-2
’‑
o-甲基-尿苷(ncm5um)、5-羧甲基氨甲基-2
’‑
o-甲基-尿苷(cmnm5um)、3，2
’‑
o-二甲基-尿苷(m3um)、5-(异戊烯基氨甲基)-2
’‑
o-甲基-尿苷(inm5um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2
’‑
f-阿糖-尿苷、2
’‑
f-尿苷、2
’‑
oh-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-e-丙烯基氨基)尿苷或本领域中已知的任何其他经修饰尿苷。
[0238]
在一些实施方案中，至少一种rna包含代替至少一个尿苷的经修饰核苷。在一些实施方案中，至少一种rna包含代替每个尿苷的经修饰核苷。在一些实施方案中，每种rna均包含代替至少一个尿苷的经修饰核苷。在一些实施方案中，每种rna均包含代替每个尿苷的经修饰核苷。
[0239]
在一些实施方案中，经修饰核苷独立地选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含n1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含5-甲基-尿苷(m5u)。在一些实施方案中，至少一种rna可包含多于一种类型的经修饰核苷，并且所述经修饰核苷独立地选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含假尿苷(ψ)和n1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含假尿苷(ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)。
[0240]
在一个实施方案中，rna包含其他经修饰核苷或包含另一些经修饰核苷，例如经修饰胞苷。例如，在一个实施方案中，在rna中5-甲基胞苷部分地或完全地、优选完全地替换胞苷。在一个实施方案中，rna包含5-甲基胞苷和选自假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5u)中的一种或更多种。在一个实施方案中，rna包含5-甲基胞苷和n1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，rna包含代替每个胞苷的5-甲基胞苷和代替每个尿苷的n1-甲基-假尿苷(m1ψ)。
[0241]
在一些实施方案中，根据本公开内容的rna包含5
’‑
帽。在一个实施方案中，本公开
内容的rna不具有未经加帽的5
’‑
三磷酸。在一个实施方案中，所述rna可被5
’‑
帽类似物修饰。术语“5
’‑
帽”是指存在于mrna分子的5’端上的结构，并且通常由通过5
’‑
至5
’‑
三磷酸键联与mrna连接的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7位被甲基化。提供具有5
’‑
帽或5
’‑
帽类似物的rna可通过体外转录来实现，其中5
’‑
帽被共转录表达到rna链中，或者可使用加帽酶在转录后与rna连接。
[0242]
在一些实施方案中，rna的构件单元帽是m
27，3
’‑ogppp(m
12
’‑o)apg(有时也称为m
27，3`o
g(5’)ppp(5’)m2’‑oapg)，其具有以下结构：
[0243][0244]
下面是示例性的帽1(cap1)rna，其包含rna和m
27，3`o
g(5’)ppp(5’)m2’‑oapg：
[0245][0246]
下面是另一个示例性的帽1 rna(无帽类似物)：
[0247][0248]
在一些实施方案中，在一个实施方案中，使用具有以下结构的帽类似物抗反向帽
(arca帽(m2
7，3`o
g(5’)ppp(5’)g))用“帽0(cap0)’结构来修饰rna：
[0249][0250]
下面是包含rna和m
27，3`o
g(5’)ppp(5’)g的示例性帽0 rna：
[0251][0252]
在一些实施方案中，使用具有以下结构的帽类似物β-s-arca(m
27，2`o
g(5’)ppsp(5’)g)来产生“帽0”结构：
[0253][0254]
下面是包含β-s-arca(m
27，2`o
g(5’)ppsp(5’)g)和rna的示例性帽0rna：
[0255][0256]
特别优选的帽包含5
’‑
帽m
27，2`o
g(5’)ppsp(5’)g。在一些实施方案中，本文中所述
的至少一种rna包含5
’‑
帽m
27，2`o
g(5’)ppsp(5’)g。在一些实施方案中，本文中所述的每种rna均包含5’帽m
27，2`o
g(5’)ppsp(5’)g。
[0257]
β-s-arca的“d1”非对映体或“β-s-arca(d1)”是与β-s-arca的d2非对映体(β-s-arca(d2))相比首先在hplc柱上洗脱，并且因此显示出较短保留时间的β-s-arca的非对映体(参见wo 2011/015347，其通过引入并入本文)。特别优选的帽是β-s-arca(d1)(m
27，2
′‑ogppspg)。
[0258]
在一些实施方案中，根据本公开内容的rna包含5
’‑
utr和/或3
’‑
utr。术语“非翻译区”或“utr”涉及dna分子中被转录但未被翻译成氨基酸序列的区域，或涉及rna分子(例如mrna分子)中的相应区域。非翻译区(utr)可存在于开放阅读框的5’(上游)(5
’‑
utr)和/或开放阅读框的3’(下游)(3
’‑
utr)。5
’‑
utr(如果存在的话)位于5’端，蛋白质编码区的起始密码子的上游。5
’‑
utr位于5
’‑
帽(如果存在的话)的下游，例如直接与5’帽邻近。3
’‑
utr(如果存在的话)位于3’端，蛋白质编码区的终止密码子的下游，但是术语“3
’‑
utr”优选不包含poly-a序列。因此，3
’‑
utr位于poly-a序列(如果存在的话)的上游，例如直接与poly-a序列邻近。
[0259]
特别优选的5
’‑
utr包含seq id no：30的核苷酸序列。特别优选的3
’‑
utr包含seq id no：31的核苷酸序列。
[0260]
在一些实施方案中，至少一种rna包含含有以下的5
’‑
utr：seq id no：30的核苷酸序列，或者与seq id no：30的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每种rna均包含含有以下的5
’‑
utr：seq id no：30的核苷酸序列，或者与seq id no：30的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
[0261]
在一些实施方案中，至少一种rna包含含有以下的3
’‑
utr：seq id no：31的核苷酸序列，或者与seq id no：31的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，每种rna均包含含有以下的3
’‑
utr：seq id no：31的核苷酸序列，或者与seq id no：31的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
[0262]
本文中使用的术语“poly-a尾”或“poly-a序列”是指通常位于rna分子的3’端的腺苷酸残基的不间断或间断的序列。poly-a尾或poly-a序列是本领域技术人员已知的并且可在本文中所述的rna中的3
’‑
utr之后。不间断的poly-a尾的特征在于连续的腺苷酸残基。实际上，不间断的poly-a尾是典型的。本文中公开的rna可具有在转录之后通过模板非依赖性rna聚合酶与rna的游离3’端连接的poly-a尾或由dna编码并由模板依赖性rna聚合酶转录的poly-a尾。
[0263]
已表明，约120个a核苷酸的poly-a尾对经转染真核细胞中的rna水平以及对从存在于poly-a尾的上游(5’)的开放阅读框翻译的蛋白质水平具有有益影响(holtkamp et al.，2006，blood，第108卷，第4009至4017页)。
[0264]
poly-a尾可具有任何长度。在一些实施方案中，poly-a尾包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：至少20个、至少30个、至少40个、至少80个、或至少100个、并且多至500个、多至400个、多至300个、多至200个、或多至150个a核苷酸，并且特别是约120个a核苷酸。在本上下文中，“基本上由
……
组成”意指poly-a尾中的大多数核苷酸，通常按poly-a尾中
核苷酸的数目计至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％是a核苷酸，但允许其余核苷酸是除a核苷酸之外的核苷酸，例如u核苷酸(尿苷酸)、g核苷酸(鸟苷酸)或c核苷酸(胞苷酸)。在本上下文中，“由
……
组成”意指poly-a尾中的所有核苷酸，即按poly-a尾中核苷酸的数目计100％是a核苷酸。术语“a核苷酸”或“a”是指腺苷酸。
[0265]
在一些实施方案中，基于在与编码链互补的链中包含重复的dt核苷酸(脱氧胸苷酸)的dna模板，在rna转录期间，例如在制备体外转录的rna期间，连接poly-a尾。编码poly-a尾的dna序列(编码链)被称为poly(a)盒。
[0266]
在一些实施方案中，存在于dna编码链中的poly(a)盒基本上由da核苷酸组成，但被四种核苷酸(da、dc、dg和dt)的随机序列中断。这样的随机序列的长度可以是5至50、10至30或10至20个核苷酸。这样的盒公开于wo 2016/005324 a1中，其在此通过引用并入。wo 2016/005324 a1中公开的任何poly(a)盒均可用于本发明。涵盖以下：基本上由da核苷酸组成但被具有均等分布的四种核苷酸(da、dc、dg、dt)并且长度为例如5至50个核苷酸的随机序列中断的poly(a)盒显示，在dna水平上质粒dna在大肠杆菌(e.coli)中的恒定增殖，而在rna水平上仍与对于支持rna稳定性和翻译效率的有益特性相关。因此，在一些实施方案中，本文中所述的rna分子中包含的poly-a尾基本上由a核苷酸组成，但是被四种核苷酸(a、c、g、u)的随机序列中断。这样的随机序列的长度可以是5至50、10至30或10至20个核苷酸。
[0267]
在一些实施方案中，除a核苷酸之外无核苷酸在其3’端侧接poly-a尾，即，poly-a尾在其3’端未被除a之外的核苷酸掩蔽或跟随。
[0268]
在一些实施方案中，poly-a尾包含seq id no：32的序列。
[0269]
在一些实施方案中，至少一种rna包含poly-a尾。在一些实施方案中，每种rna均包含poly-a尾。在一些实施方案中，poly-a尾可包含至少20个、至少30个、至少40个、至少80个、或至少100个、并且多至500个、多至400个、多至300个、多至200个、或多至150个核苷酸。在一些实施方案中，poly-a尾可基本上由至少20个、至少30个、至少40个、至少80个、或至少100个、并且多至500个、多至400个、多至300个、多至200个、或多至150个核苷酸组成。在一些实施方案中，poly-a尾可由至少20个、至少30个、至少40个、至少80个、或至少100个、并且多至500个、多至400个、多至300个、多至200个、或多至150个核苷酸组成。在一些实施方案中，poly-a尾可包含seq id no：32中所示的poly-a尾。在一些实施方案中，poly-a尾包含至少100个核苷酸。在一些实施方案中，poly-a尾包含约150个核苷酸。在一些实施方案中，poly-a尾包含约120个核苷酸。
[0270]
在本公开内容的上下文中，术语“转录”涉及其中dna序列中的遗传密码转录成rna的过程。随后，rna可翻译成肽或蛋白质。
[0271]
关于rna，术语“表达”或“翻译”涉及通过其mrna的链指导组装氨基酸序列以产生肽或蛋白质之在细胞的核糖体中的过程。
[0272]
在一个实施方案中，在施用本文中所述的例如配制为rna脂质复合物颗粒的rna之后，至少一部分rna被递送至靶细胞。在一个实施方案中，至少一部分rna被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，所述rna被靶细胞翻译以产生其编码的肽或蛋白质。在一个实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一个实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞，例如脾中的专职抗原呈递细胞。在一个实施方案中，靶细胞是树突细胞或巨噬细胞。本文中所述的rna脂
质复合物颗粒可用于将rna递送至这样的靶细胞。因此，本公开内容还涉及用于在对象中将rna递送至靶细胞的方法，所述方法包括向对象施用本文中所述的rna脂质复合物颗粒。在一个实施方案中，所述rna被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，所述rna被靶细胞翻译以产生由该rna编码的肽或蛋白质。
[0273]
根据本公开内容，术语“rna编码”意指，如果存在于合适环境中，例如靶组织的细胞内，则rna可在翻译过程期间指导氨基酸组装以产生其编码的肽或蛋白质。在一个实施方案中，所述rna能够与细胞翻译机器相互作用，从而允许肽或蛋白质的翻译。细胞可在胞内(例如在胞质中和/或在细胞核中)产生编码的肽或蛋白质，可分泌编码的肽或蛋白质，或者可使其在表面上产生。
[0274]
根据本公开内容，术语“肽”包含寡肽和多肽，并且是指包含通过肽键彼此连接的约两个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多个、约16个或更多个、约20个或更多个，并且多至约50个、约100个、或约150个连续氨基酸的物质。术语“蛋白质”是指大肽，特别是具有至少约151个氨基酸的肽，但是术语“肽”和“蛋白质”在本文中通常作为同义词使用。
[0275]
术语“抗原”涉及包含这样的表位的物质：针对该表位可产生免疫应答。特别地，术语“抗原”包括蛋白质和肽。在一个实施方案中，抗原由免疫系统的细胞(例如抗原呈递细胞如树突细胞或巨噬细胞)呈递。在一个实施方案中，抗原或其加工产物例如t细胞表位，通过t或b细胞受体或通过免疫球蛋白分子例如抗体结合。因此，抗原或其加工产物可与抗体或t淋巴细胞(t细胞)特异性反应。在一个实施方案中，抗原是疾病相关抗原，例如肿瘤抗原，特别是hpv e6或hpv e7，并且表位来源于这样的抗原。
[0276]
术语“疾病相关抗原”以其最广泛的含义使用，是指与疾病相关的任何抗原。疾病相关抗原是这样的分子：其包含将刺激宿主的免疫系统以产生针对该疾病的细胞抗原特异性免疫应答和/或体液抗体应答的表位。因此，疾病相关抗原或其表位可用于治疗性目的。疾病相关抗原可与癌症(通常是肿瘤)相关。
[0277]
术语“肿瘤抗原”是指癌细胞的组分。特别地，它是指在胞内产生或在肿瘤细胞上作为表面抗原产生的那些抗原。
[0278]
术语“表位”是指分子(例如抗原)被免疫系统识别的部分或片段。例如，表位可被t细胞、b细胞或抗体识别。抗原的表位可包含抗原的连续或不连续部分，并且长度可以是约5至约100个氨基酸。在一个实施方案中，表位的长度为约10至约25个氨基酸。术语“表位”包括t细胞表位。
[0279]
术语“t细胞表位”是指当在mhc分子的背景下存在时被t细胞识别的蛋白质的部分或片段。术语“主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex)”和缩写“mhc”包括mhc i类和mhc ii类分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合物。mhc蛋白或分子对于免疫反应中淋巴细胞与抗原呈递细胞或患病细胞之间的信号传导是重要的，其中mhc蛋白或分子结合肽表位并呈递它们以被t细胞上的t细胞受体识别。由mhc编码的蛋白质在细胞表面上表达，并向t细胞展示自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，侵入微生物的片段)二者。在i类mhc/肽复合物的情况下，结合肽通常长约8至约10个氨基酸，尽管更长或更短的肽可以是有效的。在ii类mhc/肽复合物的情况下，结合肽通常长约10至约25个氨基酸，并且特别地长约13至约18个氨基酸，尽管更长和更短的肽可以是有
效的。
[0280]
在本公开内容的某些实施方案中，rna编码至少一种表位。在某些实施方案中，表位来源于如本文中所述的肿瘤抗原。
[0281]
人乳头瘤病毒相关恶性肿瘤
[0282]
人乳头瘤病毒感染(hpv感染)是由人乳头瘤病毒(hpv)引起的感染，所述人乳头瘤病毒(hpv)是来自乳头瘤病毒家族的dna病毒。hpv是最常见的性传播病毒感染。hpv感染已被确定为生殖器和头颈区域中的多种癌症的病因(causative agent)。所有宫颈癌均为hpv阳性，88％的肛门癌、78％的阴道癌以及较小程度的外阴癌和阴茎癌为hpv阳性。在头颈区域，归因于hpv的癌症占口咽癌的30.8％，而口腔和喉受影响的程度小得多。从1988年至2004年，hpv阴性口咽鳞状细胞癌(oropharyngeal squamous cell carcinoma，opscc)的发病率降低了50％，而hpv阳性口咽癌的发病率提高了多于两倍。存在超过100种不同的hpv类型，其可被分类为“低”或“高”风险，这取决于其介导恶性转化的能力。高风险hpv16和hpv18是最常见的致癌hpv类型，其中hpv16占所有hpv阳性头颈鳞状细胞癌(hnscc)的90％，并且占所有宫颈癌的66％。
[0283]
高风险hpv病毒是无包膜的双链dna病毒，其转化能力归因于其癌基因e6和e7。hpv感染黏膜和皮肤鳞状上皮，并具有上皮内感染周期。hpv表达六种早期蛋白(e1、e2、e4、e5、e6和e7)和两种晚期蛋白(l1和l2)。e1和e2是启动病毒复制所必需的，而e2也作为转录阻遏物调节e6和e7的表达。在滚环基因组整合期间，e2基因被破坏，导致e6和e7的较高表达。l1和l2是病毒衣壳蛋白，其对病毒组装和通过e4的辅助释放病毒颗粒至关重要。在病毒感染的急性期之后，在e6和e7持续表达的情况下hpv基因产物可保持在黏膜和皮肤鳞状上皮的细胞内，这可驱动恶性转化。hpv蛋白e6和e7能够调节细胞周期、抑制凋亡并且因此驱动癌症进展。e6具有消除肿瘤抑制蛋白p53功能的能力，p53控制细胞周期进展和凋亡。e7的致癌潜力由其调节数个细胞因子的能力来确定，所述细胞因子例如视网膜母细胞瘤袋蛋白(retinoblastoma pocket protein，prb)，其参与g1至s期的转变。e7靶向prb家族成员以使蛋白酶体降解，导致受损的dna修复、细胞周期检查点以及基因组完整性丧失。
[0284]
hpv驱动的癌症以为关键致癌驱动子的病毒癌基因e6和e7的持续表达为特征。
[0285]
hnscc是侵袭性且难以治疗的癌症类型，与生活品质降低和显著的发病率相关。尽管多种疫苗形式已进入临床测试，但尚无hpv疫苗被批准用于hpv阳性宫颈癌或hnscc癌症患者的治疗性用途。
[0286]
根据本公开内容，术语“hpv阳性癌症”包括由hpv感染引起的癌症，和/或其中可检测到hpv或某些组分、特别是hpv e6和/或hpv e7的癌症。这样的癌症的一些实例包括但不限于肛门生殖器癌、宫颈癌和阴茎癌以及头颈区域中的癌症，例如生殖器区域或头颈区域中的癌症。在一个实施方案中，hpv阳性癌症是头颈鳞状细胞癌(hnscc)。
[0287]
在一些实施方案中，本文中所述的组合物或药物制剂包含编码hpve6疫苗抗原的rna和编码hpv e7疫苗抗原的rna。同样，本文中所述的方法包括施用编码hpv e6疫苗抗原的rna和编码hpv e7疫苗抗原的rna。
[0288]
hpv e6和hpv e7疫苗抗原的分子结构和功能以及编码其的rna
[0289]
hpv可通过整合到宿主基因组中来诱导肿瘤发生过程。此外，由hpv病毒携带的“早期基因”中的一些(例如基因e6和e7)充当促进肿瘤生长和恶性转化的癌基因。高风险hpv类
型的两种主要癌蛋白是e6和e7。“e”名称表示这两种蛋白在hpv生命周期中早期表达。e6/e7蛋白使以下两种肿瘤抑制蛋白失活：p53(通过e6失活)和prb(通过e7失活)。
[0290]
如本文中所述的hpv e6蛋白或hpv e7蛋白可来源于任何hpv，特别是任何高风险hpv类型，例如hpv 16、18、31、33、45或58。在一个实施方案中，如本文中所述的hpv e6蛋白或hpv e7蛋白来源于不同的hpv类型。在一个实施方案中，如本文中所述的hpv e6蛋白或hpv e7蛋白来源于相同的hpv类型。在一个实施方案中，hpv类型是hpv 16。在一个实施方案中，hpv类型是hpv 18。在一个实施方案中，hpv类型是hpv 31。在一个实施方案中，hpv类型是hpv 33。在一个实施方案中，hpv类型是hpv 45。在一个实施方案中，hpv类型是hpv 58。
[0291]
在一个实施方案中，包含人乳头瘤病毒(hpv)e6蛋白、其免疫原性变体、或者所述hpv e6蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列，也称为“本文中的hpv e6疫苗抗原”，包含hpv e6蛋白的氨基酸序列、hpv e6蛋白的免疫原性变体的氨基酸序列、hpv e6蛋白的免疫原性片段的氨基酸序列、或hpv e6蛋白的免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列。
[0292]
在一个实施方案中，包含人乳头瘤病毒(hpv)e7蛋白、其免疫原性变体、或者所述hpv e7蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列，也称为“本文中的hpv e7疫苗抗原”，包含hpv e7蛋白的氨基酸序列、hpv e7蛋白的免疫原性变体的氨基酸序列、hpv e7蛋白的免疫原性片段的氨基酸序列、或hpv e7蛋白的免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列。
[0293]
在一个实施方案中，hpv e6蛋白来源于hpv 16。在一个实施方案中，hpv e6疫苗抗原包含：seq id no：1的第37至194位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：1的第37至194位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：1的第37至194位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：1的第37至194位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，hpv e6疫苗抗原包含seq id no：1的第37至194位氨基酸的氨基酸序列。
[0294]
在一个实施方案中，编码hpv e6疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：2的第161至634位核苷酸的核苷酸序列，与seq id no：2的第161至634位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者seq id no：2的第161至634位核苷酸的核苷酸序列的片段，或者与seq id no：2的第161至634位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码包含以下的氨基酸序列：seq id no：1的第37至194位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：1的第37至194位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：1的第37至194位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：1的第37至194位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，编码hpv e6疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：2的第161至634位核苷酸的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含seq id no：1的第37至194位氨基酸的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0295]
在一个实施方案中，hpv e6蛋白来源于hpv 18。在一个实施方案中，hpv e6疫苗抗
原包含：seq id no：5的第37至194位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：5的第37至194位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：5的第37至194位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：5的第37至194位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，hpv e6疫苗抗原包含seq id no：5的第37至194位氨基酸的氨基酸序列。
[0296]
在一个实施方案中，编码hpv e6疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：6的第161至634位核苷酸的核苷酸序列，与seq id no：6的第161至634位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者seq id no：6的第161至634位核苷酸的核苷酸序列的片段，或者与seq id no：6的第161至634位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码包含以下的氨基酸序列：seq id no：5的第37至194位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：5的第37至194位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：5的第37至194位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：5的第37至194位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，编码hpv e6疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：6的第161至634位核苷酸的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含seq id no：5的第37至194位氨基酸的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0297]
在一个实施方案中，hpv e6蛋白来源于hpv 31。在一个实施方案中，hpv e6疫苗抗原包含：seq id no：9的第37至185位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：9的第37至185位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：9的第37至185位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：9的第37至185位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，hpv e6疫苗抗原包含seq id no：9的第37至185位氨基酸的氨基酸序列。
[0298]
在一个实施方案中，编码hpv e6疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：10的第161至607位核苷酸的核苷酸序列，与seq id no：10的第161至607位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者seq id no：10的第161至607位核苷酸的核苷酸序列的片段，或者与seq id no：10的第161至607位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码包含以下的氨基酸序列：seq id no：9的第37至185位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：9的第37至185位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：9的第37至185位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：9的第37至185位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，编码hpv e6疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：10的第161至607位核苷酸的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含seq id no：9的第37至185位氨基酸的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0299]
在一个实施方案中，hpv e6蛋白来源于hpv 33。在一个实施方案中，hpv e6疫苗抗原包含：seq id no：13的第37至185位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：13的第37至185位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：13的第37至185位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：13的第37至185位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，hpv e6疫苗抗原包含seq id no：13的第37至185位氨基酸的氨基酸序列。
[0300]
在一个实施方案中，编码hpv e6疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：14的第161至607位核苷酸的核苷酸序列，与seq id no：14的第161至607位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者seq id no：14的第161至607位核苷酸的核苷酸序列的片段，或者与seq id no：14的第161至607位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码包含以下的氨基酸序列：seq id no：13的第37至185位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：13的第37至185位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：13的第37至185位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：13的第37至185位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，编码hpv e6疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：14的第161至607位核苷酸的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含seq id no：13的第37至185位氨基酸的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0301]
在一个实施方案中，hpv e6蛋白来源于hpv 45。在一个实施方案中，hpv e6疫苗抗原包含：seq id no：17的第37至194位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：17的第37至194位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：17的第37至194位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：17的第37至194位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，hpv e6疫苗抗原包含seq id no：17的第37至194位氨基酸的氨基酸序列。
[0302]
在一个实施方案中，编码hpv e6疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：18的第161至634位核苷酸的核苷酸序列，与seq id no：18的第161至634位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者seq id no：18的第161至634位核苷酸的核苷酸序列的片段，或者与seq id no：18的第161至634位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码包含以下的氨基酸序列：seq id no：17的第37至194位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：17的第37至194位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：17的第37至194位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：17的第37至194位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，编码hpv e6疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：18的第161至634位核苷酸的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含seq id no：17的第37至194位氨基酸
的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0303]
在一个实施方案中，hpv e6蛋白来源于hpv 58。在一个实施方案中，hpv e6疫苗抗原包含：seq id no：21的第37至185位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：21的第37至185位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：21的第37至185位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：21的第37至185位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，hpv e6疫苗抗原包含seq id no：21的第37至185位氨基酸的氨基酸序列。
[0304]
在一个实施方案中，编码hpv e6疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：22的第161至607位核苷酸的核苷酸序列，与seq id no：22的第161至607位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者seq id no：22的第161至607位核苷酸的核苷酸序列的片段，或者与seq id no：22的第161至607位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码包含以下的氨基酸序列：seq id no：21的第37至185位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：21的第37至185位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：21的第37至185位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：21的第37至185位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，编码hpv e6疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：22的第161至607位核苷酸的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含seq id no：21的第37至185位氨基酸的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0305]
在一个实施方案中，hpv e7蛋白来源于hpv 16。在一个实施方案中，hpv e7疫苗抗原包含：seq id no：3的第37至134位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：3的第37至134位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：3的第37至134位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：3的第37至134位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，hpv e7疫苗抗原包含seq id no：3的第37至134位氨基酸的氨基酸序列。
[0306]
在一个实施方案中，编码hpv e7疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：4的第161至454位核苷酸的核苷酸序列，与seq id no：4的第161至454位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者seq id no：4的第161至454位核苷酸的核苷酸序列的片段，或者与seq id no：4的第161至454位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码包含以下的氨基酸序列：seq id no：3的第37至134位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：3的第37至134位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：3的第37至134位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：3的第37至134位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，编码hpv e7疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：4的第161至454位
核苷酸的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含seq id no：3的第37至134位氨基酸的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0307]
在一个实施方案中，hpv e7蛋白来源于hpv 18。在一个实施方案中，hpv e7疫苗抗原包含：seq id no：7的第37至141位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：7的第37至141位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：7的第37至141位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：7的第37至141位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，hpv e7疫苗抗原包含seq id no：7的第37至141位氨基酸的氨基酸序列。
[0308]
在一个实施方案中，编码hpv e7疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：8的第161至475位核苷酸的核苷酸序列，与seq id no：8的第161至475位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者seq id no：8的第161至475位核苷酸的核苷酸序列的片段，或者与seq id no：8的第161至475位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码包含以下的氨基酸序列：seq id no：7的第37至141位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：7的第37至141位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：7的第37至141位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：7的第37至141位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，编码hpv e7疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：8的第161至475位核苷酸的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含seq id no：7的第37至141位氨基酸的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0309]
在一个实施方案中，hpv e7蛋白来源于hpv 31。在一个实施方案中，hpv e7疫苗抗原包含：seq id no：11的第37至134位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：11的第37至134位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：11的第37至134位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：11的第37至134位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，hpv e7疫苗抗原包含seq id no：11的第37至134位氨基酸的氨基酸序列。
[0310]
在一个实施方案中，编码hpv e7疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：12的第161至454位核苷酸的核苷酸序列，与seq id no：12的第161至454位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者seq id no：12的第161至454位核苷酸的核苷酸序列的片段，或者与seq id no：12的第161至454位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码包含以下的氨基酸序列：seq id no：11的第37至134位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：11的第37至134位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：11的第37至134位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：11的第37至134位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的
免疫原性片段。在一个实施方案中，编码hpv e7疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：12的第161至454位核苷酸的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含seq id no：11的第37至134位氨基酸的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0311]
在一个实施方案中，hpv e7蛋白来源于hpv 33。在一个实施方案中，hpv e7疫苗抗原包含：seq id no：15的第37至133位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：15的第37至133位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：15的第37至133位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：15的第37至133位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，hpv e7疫苗抗原包含seq id no：15的第37至133位氨基酸的氨基酸序列。
[0312]
在一个实施方案中，编码hpv e7疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：16的第161至451位核苷酸的核苷酸序列，与seq id no：16的第161至451位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者seq id no：16的第161至451位核苷酸的核苷酸序列的片段，或者与seq id no：16的第161至451位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码包含以下的氨基酸序列：seq id no：15的第37至133位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：15的第37至133位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：15的第37至133位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：15的第37至133位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，编码hpv e7疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：16的第161至451位核苷酸的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含seq id no：15的第37至133位氨基酸的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0313]
在一个实施方案中，hpv e7蛋白来源于hpv 45。在一个实施方案中，hpv e7疫苗抗原包含：seq id no：19的第37至142位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：19的第37至142位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：19的第37至142位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：19的第37至142位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，hpv e7疫苗抗原包含seq id no：19的第37至142位氨基酸的氨基酸序列。
[0314]
在一个实施方案中，编码hpv e7疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：20的第161至478位核苷酸的核苷酸序列，与seq id no：20的第161至478位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者seq id no：20的第161至478位核苷酸的核苷酸序列的片段，或者与seq id no：20的第161至478位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码包含以下的氨基酸序列：seq id no：19的第37至142位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：19的第37至142位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：19的第37至142位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：19的第37至142位氨基酸的氨
基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，编码hpv e7疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：20的第161至478位核苷酸的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含seq id no：19的第37至142位氨基酸的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0315]
在一个实施方案中，hpv e7蛋白来源于hpv 58。在一个实施方案中，hpv e7疫苗抗原包含：seq id no：23的第37至134位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：23的第37至134位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：23的第37至134位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：23的第37至134位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，hpv e7疫苗抗原包含seq id no：23的第37至134位氨基酸的氨基酸序列。
[0316]
在一个实施方案中，编码hpv e7疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：24的第161至454位核苷酸的核苷酸序列，与seq id no：24的第161至454位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者seq id no：24的第161至454位核苷酸的核苷酸序列的片段，或者与seq id no：24的第161至454位核苷酸的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码包含以下的氨基酸序列：seq id no：23的第37至134位氨基酸的氨基酸序列，与seq id no：23的第37至134位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：23的第37至134位氨基酸的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：23的第37至134位氨基酸的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，编码hpv e7疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：24的第161至454位核苷酸的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含seq id no：23的第37至134位氨基酸的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0317]
根据某些实施方案，信号肽直接或通过接头(例如，具有根据seq id no：28的氨基酸序列的接头)与hpv e6/e7蛋白、其变体、或其片段(即抗原肽或蛋白质)融合。因此，在一个实施方案中，信号肽与由上述疫苗抗原包含的来源于hpv e6/e7蛋白或其免疫原性片段(抗原肽或蛋白质)的上述氨基酸序列融合。
[0318]
这样的信号肽是序列，其通常表现出约15至30个氨基酸的长度，并且优选地位于抗原肽或蛋白质的n端，而不限于此。如本文中限定的信号肽优选地允许将如由rna编码的抗原肽或蛋白质转运到限定的细胞区室，优选细胞表面、内质网(endoplasmic reticulum，er)或内体-溶酶体区室中。在一个实施方案中，如本文中限定的信号肽序列包括而不限于来源于编码人mhc i类复合物(hla-b51、单倍型a2、b27/b51、cw2/cw3)的序列的信号肽序列，并且优选地对应于引导新生多肽链易位到内质网中的编码分泌信号肽的78 bp片段，并且包括特别是包含seq id no：25的氨基酸序列或其功能变体的序列。
[0319]
在一个实施方案中，信号序列包含seq id no：25的氨基酸序列，与seq id no：25的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：25的氨基酸序列的功能片段，或者与seq id no：25的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的功能片段。在一
个实施方案中，信号序列包含seq id no：25的氨基酸序列。
[0320]
优选使用这样的信号肽以促进所编码的抗原肽或蛋白质的分泌。更优选地，将如本文中限定的信号肽与如本文中限定的所编码的抗原肽或蛋白质融合。
[0321]
因此，在一些特别优选的实施方案中，本文中所述的rna包含至少一个编码抗原肽或蛋白质的编码区以及信号肽，所述信号肽优选地与抗原肽或蛋白质融合，更优选地与如本文中所述的抗原肽或蛋白质的n端融合。
[0322]
根据某些实施方案，增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列直接或通过接头与hpv e6/e7蛋白、其变体、或其片段(即抗原肽或蛋白质)融合。因此，在一个实施方案中，增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列与由上述疫苗抗原包含的来源于hpv e6/e7或其免疫原性片段(抗原肽或蛋白质)的上述氨基酸序列融合。
[0323]
这样的增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列优选地位于抗原肽或蛋白质的c端(并且任选地位于破坏免疫耐受的氨基酸序列的c端)，而不限于此。如本文中限定的增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列优选地改善抗原加工和呈递。在一个实施方案中，如本文中限定的增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列包括但不限于来源于人mhc i类复合物(hla-b51、单倍型a2、b27/b51、cw2/cw3)的序列，特别是包含seq id no：26的氨基酸序列或其功能变体的序列。
[0324]
在一个实施方案中，增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列包含seq id no：26的氨基酸序列，与seq id no：26的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：26的氨基酸序列的功能片段，或者与seq id no：26的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的功能片段。在一个实施方案中，增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列包含seq id no：26的氨基酸序列。
[0325]
优选使用这样的增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列以促进所编码的抗原肽或蛋白质的抗原加工和/或呈递。更优选地，将如本文中限定的增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列与如本文中限定的所编码的抗原肽或蛋白质融合。
[0326]
因此，在一些特别优选的实施方案中，本文中所述的rna包含至少一个编码抗原肽或蛋白质的编码区以及增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列，所述增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列优选地与抗原肽或蛋白质融合，更优选地与如本文中所述的抗原肽或蛋白质的c端融合。
[0327]
来源于破伤风梭菌的破伤风类毒素的氨基酸序列可用于克服自身耐受性机制，以便通过在致敏期间提供t细胞辅助来有效地开展对自身抗原的免疫应答。
[0328]
已知破伤风类毒素重链包含可与mhc ii类等位基因混杂结合并在几乎所有经破伤风疫苗接种的个体中诱导cd4
+
记忆t细胞的表位。另外，已知破伤风类毒素(tt)辅助表位与肿瘤相关抗原的组合与施加单独的肿瘤相关抗原相比通过在致敏期间提供cd4
+
介导的t细胞辅助来改善免疫刺激。为了降低可与预期的肿瘤抗原特异性t细胞应答的诱导竞争的破伤风序列刺激cd8
+
t细胞的风险，不使用破伤风类毒素的整个片段c，因为已知其包含cd8
+
t细胞表位。替代地选择包含混杂结合辅助表位的两种肽序列以确保与尽可能多的mhcii类等位基因结合。基于离体研究的数据，选择了公知的表位p2(qyikanskfigitel；tt
830至844
)和p16(mtnsvddalinstkiysyfpsviskvnqgaqg；tt
578至609
)。p2表位已在临床试验中用于肽疫苗
接种，以加强抗黑素瘤活性。
[0329]
目前的非临床数据(未发表)显示，编码肿瘤抗原加混杂结合的破伤风类毒素序列二者的rna疫苗导致针对肿瘤抗原的cd8
+
t细胞应答增强以及耐受破坏改善。来自用疫苗进行疫苗接种的患者的免疫监测数据(包括与肿瘤抗原特异性序列在框内融合的那些序列)显示，所选择的破伤风序列能够在几乎所有患者中诱导破伤风特异性t细胞应答。
[0330]
根据某些实施方案，破坏免疫耐受的氨基酸序列直接或通过接头(例如，具有根据seq id no：28的氨基酸序列的接头)与hpv e6/e7蛋白、其变体、或其片段(即抗原肽或蛋白质)融合。因此，在一个实施方案中，破坏免疫耐受的氨基酸序列与由上述疫苗抗原包含的来源于hpv e6/e7蛋白或其免疫原性片段(抗原肽或蛋白质)的上述氨基酸序列融合。
[0331]
这样的破坏免疫耐受的氨基酸序列优选地位于抗原肽或蛋白质的c端(并且任选地在增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列的n端，其中破坏免疫耐受的氨基酸序列以及增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列可直接或通过接头(例如，具有根据seq id no：29的氨基酸序列的接头)融合)，而不限于此。如本文中限定的破坏免疫耐受的氨基酸序列优选地改善t细胞应答。在一个实施方案中，如本文中限定的破坏免疫耐受的氨基酸序列包括而不限于来源于破伤风类毒素来源的辅助序列p2和p16(p2p16)的序列，特别是包含seq id no：27的氨基酸序列或其功能变体的序列。
[0332]
在一个实施方案中，破坏免疫耐受的氨基酸序列包含seq id no：27的氨基酸序列，与seq id no：27的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：27的氨基酸序列的功能片段，或者与seq id no：27的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的功能片段。在一个实施方案中，破坏免疫耐受的氨基酸序列包含seq id no：27的氨基酸序列。
[0333]
代替使用与破伤风类毒素辅助表位融合的抗原rna，肿瘤抗原rna可在疫苗接种期间与编码tt辅助表位的单独rna共施用。在此，tt辅助表位编码rna将在制备之前被添加至每个抗原编码rna。以此方式，形成包含抗原和辅助表位编码rna二者的混合脂质复合物纳米颗粒，以便将这两种化合物递送至给定的apc。
[0334]
因此，在一些实施方案中，本文中所述的组合物可包含编码破伤风类毒素来源的辅助序列p2和p16(p2p16)的rna。同样地，本文中所述的方法可包括施用编码破伤风类毒素来源的辅助序列p2和p16(p2p16)的rna。
[0335]
因此，另一个方面涉及包含颗粒例如脂质复合物颗粒的组合物，例如药物组合物，所述颗粒包含：
[0336]
(i)编码疫苗抗原的rna，和
[0337]
(ii)编码破坏免疫耐受的氨基酸序列的rna。
[0338]
这样的组合物可用于诱导针对疫苗抗原并因此针对疾病相关抗原的免疫应答的方法中。
[0339]
另一个方面涉及诱导免疫应答的方法，其包括施用颗粒例如脂质复合物颗粒，所述颗粒包含：
[0340]
(i)编码疫苗抗原的rna，和
[0341]
(ii)编码破坏免疫耐受的氨基酸序列的rna。
[0342]
在一个实施方案中，破坏免疫耐受的氨基酸序列包含辅助表位，优选破伤风类毒素来源的辅助表位。
[0343]
在一个实施方案中，将编码疫苗抗原的rna与编码破坏免疫耐受的氨基酸序列的rna以约4∶1至约16∶1、约6∶1至约14∶1、约8∶1至约12∶1、或约10∶1的比例共配制成颗粒，例如脂质复合物颗粒。
[0344]
在下文中，描述了hpv e6或e7疫苗rna的一些实施方案，其中当描述其元件时使用的某些术语具有以下含义：
[0345]
hag-kozak：人α-珠蛋白mrna的5
’‑
utr序列，带有经优化的
‘
kozak序列’以提高翻译效率。
[0346]
sec/mitd：来源于编码人mhc i类复合物(hla-b51、单倍型a2、b27/b51、cw2/cw3)的序列的融合蛋白标签，其已显示改善抗原加工和呈递。sec对应于编码分泌信号肽的78 bp片段，其引导新生多肽链易位到内质网中。mitd对应于mhc i类分子的跨膜和胞质结构域，也称为mhc i类运输结构域。
[0347]
e6/e7：编码各自的hpv抗原的序列。
[0348]
甘氨酸-丝氨酸接头(gs)：编码主要由如通常用于融合蛋白的氨基酸甘氨酸(g)和丝氨酸(s)组成的短接头肽的序列。
[0349]
p2p16：编码破伤风类毒素来源辅助表位以破坏免疫耐受的序列。
[0350]
fi元件：3
’‑
utr是来源于“分裂的氨基端增强子”(aes)mrna(称为f)和线粒体编码的12s核糖体rna(称为i)的两种序列元件的组合。这些通过对赋予rna稳定性和增强总蛋白表达的序列进行离体选择过程来鉴定。
[0351]
a30l70：测量长度为110个核苷酸的poly(a)尾，其由以下区段组成：30个腺苷残基，随后是10个核苷酸的接头序列和另外70个腺苷残基，所述poly(a)尾被设计成用于在树突细胞中增强rna稳定性和翻译效率。
[0352]
在一个实施方案中，本文中所述的疫苗rna具有以下结构：
[0353]
β-s-arca(d1)-hag-kozak-sec-gs(1)-e6/e7-gs(2)-p2p16-gs(3)-mitd-fi-a30l70
[0354]
在一个实施方案中，本文中所述的疫苗抗原具有以下结构：
[0355]
sec-gs(1)-e6/e7-gs(2)-p2p16-gs(3)-mitd
[0356]
在一个实施方案中，hag-kozak包含seq id no：30的核苷酸序列。在一个实施方案中，sec包含seq id no：25的氨基酸序列。在一个实施方案中，e6/e7包含本文中所述的疫苗抗原的e6或e7序列。在一个实施方案中，p2p16包含seq id no：27的氨基酸序列。在一个实施方案中，mitd包含seq id no：26的氨基酸序列。在一个实施方案中，gs(1)包含seq id no：28的氨基酸序列。在一个实施方案中，gs(2)包含seq id no：28的氨基酸序列。在一个实施方案中，gs(3)包含seq id no：29的氨基酸序列。在一个实施方案中，fi包含seq id no：31的核苷酸序列。在一个实施方案中，a30l70包含seq id no：32的核苷酸序列。
[0357]
在一个实施方案中，hpv 16 e6疫苗抗原包含seq id no：1的氨基酸序列，与seq id no：1的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：1的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：1的氨基酸序列的具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免
疫原性片段。在一个实施方案中，hpv 16 e6疫苗抗原包含seq id no：1的氨基酸序列。
[0358]
在一个实施方案中，编码hpv 16 e6疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：2的核苷酸序列，与seq id no：2的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者seq id no：2的核苷酸序列的片段，或者与seq id no：2的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码包含以下的氨基酸序列：seq id no：1的氨基酸序列，与seq id no：1的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：1的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：1的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，编码hpv 16 e6疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：2的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含seq id no：1的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0359]
在一个实施方案中，hpv 16 e7疫苗抗原包含seq id no：3的氨基酸序列，与seq id no：3的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：3的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：3的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，hpv 16 e7疫苗抗原包含seq id no：3的氨基酸序列。
[0360]
在一个实施方案中，编码hpv 16 e7疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：4的核苷酸序列，与seq id no：4的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者seq id no：4的核苷酸序列的片段，或者与seq id no：4的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码包含以下的氨基酸序列：seq id no：3的氨基酸序列，与seq id no：3的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：3的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：3的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％，90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，编码hpv 16 e7疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：4的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含seq id no：3的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0361]
在一个实施方案中，hpv 18 e6疫苗抗原包含seq id no：5的氨基酸序列，与seq id no：5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：5的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，hpv 18 e6疫苗抗原包含seq id no：5的氨基酸序列。
[0362]
在一个实施方案中，编码hpv 18 e6疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：6的核苷酸序列，与seq id no：6的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者seq id no：6的核苷酸序列的片段，或者与seq id no：6的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码包含以下的氨基酸序列：seq id no：5的氨基酸序列，与seq id no：5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：5的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片
段。在一个实施方案中，编码hpv 18 e6疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：6的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含seq id no：5的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0363]
在一个实施方案中，hpv 18 e7疫苗抗原包含seq id no：7的氨基酸序列，与seq id no：7的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：7的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：7的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，hpv 18 e7疫苗抗原包含seq id no：7的氨基酸序列。
[0364]
在一个实施方案中，编码hpv 18 e7疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：8的核苷酸序列，与seq id no：8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者seq id no：8的核苷酸序列的片段，或者与seq id no：8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码包含以下的氨基酸序列：seq id no：7的氨基酸序列，与seq id no：7的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：7的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：7的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，编码hpv 18 e7疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：8的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含seq id no：7的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0365]
在一个实施方案中，hpv 31 e6疫苗抗原包含seq id no：9的氨基酸序列，与seq id no：9的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：9的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：9的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，hpv 31 e6疫苗抗原包含seq id no：9的氨基酸序列。
[0366]
在一个实施方案中，编码hpv 31 e6疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：10的核苷酸序列，与seq id no：10的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者seq id no：10的核苷酸序列的片段，或者与seq id no：10的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码包含以下的氨基酸序列：seq id no：9的氨基酸序列，与seq id no：9的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：9的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：9的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，编码hpv 31 e6疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：10的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含seq id no：9的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0367]
在一个实施方案中，hpv 31 e7疫苗抗原包含seq id no：11的氨基酸序列，与seq id no：11的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：11的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：11的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，hpv 31 e7疫苗抗原包含seq id no：11的氨基酸序列。
[0368]
在一个实施方案中，编码hpv 31 e7疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：12的核苷酸序列，与seq id no：12的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或
no：21的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：21的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：21的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，编码hpv 58 e6疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：22的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含seq id no：21的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0379]
在一个实施方案中，hpv 58 e7疫苗抗原包含seq id no：23的氨基酸序列，与seq id no：23的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：23的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：23的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，hpv 58 e7疫苗抗原包含seq id no：23的氨基酸序列。
[0380]
在一个实施方案中，编码hpv 58 e7疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：24的核苷酸序列，与seq id no：24的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列，或者seq id no：24的核苷酸序列的片段，或者与seq id no：24的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码包含以下的氨基酸序列：seq id no：23的氨基酸序列，与seq id no：23的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列，或者seq id no：23的氨基酸序列的免疫原性片段，或者与seq id no：23的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，编码hpv 58 e7疫苗抗原的rna(i)包含seq id no：24的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含seq id no：23的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0381]
由hpv e6疫苗rna/hpv e7疫苗rna编码的抗原性hpv e6/e7蛋白或肽可来源于任何hpv，特别是任何高风险hpv类型，例如hpv 16、18、31、33、45或58。在一个实施方案中，由hpv e6疫苗rna/hpv e7疫苗rna编码的抗原性hpv e6/e7蛋白或肽来源于不同的hpv类型。在一个实施方案中，由hpv e6疫苗rna/hpv e7疫苗rna编码的抗原性hpv e6/e7蛋白或肽来源于相同的hpv类型。
[0382]
在一个实施方案中，hpv e6疫苗rna/hpv e7疫苗rna组合是编码hpv 16 e6疫苗抗原的rna和编码hpv 16 e7疫苗抗原的rna的组合。
[0383]
在一个实施方案中，hpv e6疫苗rna/hpv e7疫苗rna组合是编码hpv 18 e6疫苗抗原的rna和编码hpv 18 e7疫苗抗原的rna的组合。
[0384]
在一个实施方案中，hpv e6疫苗rna/hpv e7疫苗rna组合是编码hpv 31 e6疫苗抗原的rna和编码hpv 31 e7疫苗抗原的rna的组合。
[0385]
在一个实施方案中，hpv e6疫苗rna/hpv e7疫苗rna组合是编码hpv 33 e6疫苗抗原的rna和编码hpv 33 e7疫苗抗原的rna的组合。
[0386]
在一个实施方案中，hpv e6疫苗rna/hpv e7疫苗rna组合是编码hpv 45 e6疫苗抗原的rna和编码hpv 45 e7疫苗抗原的rna的组合。
[0387]
在一个实施方案中，hpv e6疫苗rna/hpv e7疫苗rna组合是编码hpv 58 e6疫苗抗原的rna和编码hpv 58 e7疫苗抗原的rna的组合。
[0388]
本文中的“变体”意指由于至少一种氨基酸修饰而不同于亲本氨基酸序列的氨基酸序列。亲本氨基酸序列可以是天然存在的或野生型(wild type，wt)氨基酸序列，或者可
以是野生型氨基酸序列的经修饰形式。优选地，变体氨基酸序列与亲本氨基酸序列相比具有至少一种氨基酸修饰，例如与亲本相比具有1至约20种氨基酸修饰，并且优选地1至约10或1至约5种氨基酸修饰。
[0389]
本文中的“野生型”或“wt”或“天然的”意指在自然界中存在的氨基酸序列，包括等位基因变化。野生型氨基酸序列、肽或蛋白质具有未经有意修饰的氨基酸序列。
[0390]
出于本公开内容的目的，氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。术语“变体”包括所有突变体、剪接变体、翻译后修饰的变体、构象体(conformation)、同种型、等位基因变体、物种变体和物种同源物，特别是天然存在的那些。
[0391]
氨基酸插入变体包括在特定氨基酸序列中单个或两个或更多个氨基酸的插入。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，一个或更多个氨基酸残基被插入到氨基酸序列中的特定位点中，尽管随机插入并合适筛选所得产物也是可以的。氨基酸添加变体包含一个或更多个氨基酸，例如1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸的氨基和/或羧基端融合体。氨基酸缺失变体的特征在于从序列中去除一个或更多个氨基酸，例如，去除1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸。缺失可在蛋白质的任何位置中。在蛋白质的n端和/或c端末端包含缺失的氨基酸缺失变体也称为n端和/或c端截短变体。氨基酸替换变体的特征在于除去序列中的至少一个残基，并在其位置中插入另一个残基。优先考虑的是在同源蛋白质或肽之间非保守的氨基酸序列中的位置中的修饰和/或考虑的是用具有相似特性的另一些氨基酸来替代氨基酸。优选地，肽和蛋白质变体中的氨基酸变化是保守的氨基酸变化，即类似带电荷或不带电荷氨基酸的替换。保守的氨基酸变化涉及在其侧链中相关的氨基酸家族之一的替换。天然存在的氨基酸通常分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)；碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同分类为芳香族氨基酸。在一个实施方案中，保守氨基酸替换包括以下组内的替换：
[0392]
甘氨酸、丙氨酸；
[0393]
缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；
[0394]
天冬氨酸、谷氨酸；
[0395]
天冬酰胺、谷氨酰胺；
[0396]
丝氨酸、苏氨酸；
[0397]
赖氨酸、精氨酸；以及
[0398]
苯丙氨酸、酪氨酸。
[0399]
优选地，给定氨基酸序列与作为所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性，优选同一性的程度将为至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。相似性或同一性的程度优选地针对为参考氨基酸序列的全长的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则相似性或同一性的程度优选地针对至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个氨基酸，优选地连续氨基酸给出。在一些优选实施方案
中，相似性或同一性的程度针对参考氨基酸序列的全长给出。
[0400]“序列相似性”表明相同的或表示保守氨基酸替换的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”表明序列之间相同氨基酸的百分比。
[0401]“来源于”指定氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)是指第一氨基酸序列的来源。优选地，来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与该特定序列或其片段相同、基本上相同或同源的氨基酸序列。来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是该特定序列或其片段的变体。
[0402]
当通过施用编码抗原(即疫苗抗原)的rna向对象提供本文中所述的肽和蛋白质抗原(e6蛋白和e7蛋白)时，优选地在该对象中导致t细胞的刺激、致敏和/或扩增。所述经刺激、致敏和/或扩增的t细胞优选地针对靶抗原，特别是由患病的细胞、组织和/或器官表达的靶抗原，即疾病相关抗原。因此，疫苗抗原可包含疾病相关抗原，或其片段或变体。在一个实施方案中，这样的片段或变体与疾病相关抗原免疫学上等同。在本公开内容的上下文中，术语“抗原的片段”或“抗原的变体”意指导致t细胞的刺激、致敏和/或扩增的物质，该经刺激、致敏和/或扩增的t细胞靶向疾病相关抗原，特别是当在患病的细胞、组织和/或器官的表面上表达时。因此，根据本公开内容施用的疫苗抗原可对应于或可包含疾病相关抗原，可对应于或可包含疾病相关抗原的片段，或者可对应于或可包含与疾病相关抗原或其片段同源的抗原。如果根据本公开内容施用的疫苗抗原包含疾病相关抗原的片段或与疾病相关抗原的片段同源的氨基酸序列，则所述片段或氨基酸序列可包含疾病相关抗原的表位或与疾病相关抗原的表位同源的序列，其中t细胞与所述表位结合。因此，根据本公开内容，抗原可包含疾病相关抗原的免疫原性片段或与疾病相关抗原的免疫原性片段同源的氨基酸序列。根据本公开内容的“抗原的免疫原性片段”优选地涉及能够刺激、致敏和/或扩增t细胞的抗原的片段。优选地，疫苗抗原(类似于疾病相关抗原)提供相关的表位以被t细胞结合。还优选地，疫苗抗原(类似于疾病相关抗原)在细胞例如抗原呈递细胞的表面上表达从而提供相关的表位以被t细胞结合。根据本发明的疫苗抗原可以是重组抗原。
[0403]
术语“免疫学上等同的”意指免疫学上等同的分子，例如免疫学上等同的氨基酸序列例如关于免疫学作用类型表现出相同或基本上相同的免疫特性和/或发挥相同或基本上相同的免疫学作用。在本公开内容的上下文中，术语“免疫学上等同的”优选地关于抗原或抗原变体的免疫学作用或特性使用。例如，如果氨基酸序列在暴露于与参考氨基酸序列结合的t细胞或表达参考氨基酸序列的细胞时诱导具有与该参考氨基酸序列反应的特异性的免疫反应，特别是对t细胞的刺激、致敏和/或扩增，则所述氨基酸序列与该参考氨基酸序列在免疫学上等同。因此，与抗原免疫学上等同的分子在t细胞的刺激、致敏和/或扩增方面表现出与t细胞所靶向的抗原相同或基本上相同的特性和/或发挥相同或基本上相同的作用。
[0404]
本文中使用的“活化”或“刺激”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的t细胞的状态。活化也可与诱导的细胞因子产生和可检测的效应物功能相关。术语“活化的t细胞”尤其是指正在进行细胞分裂的t细胞。
[0405]
术语“致敏”是指其中t细胞首次与其特异性抗原接触并导致分化为效应t细胞的过程。
[0406]
术语“克隆扩增”或“扩增”是指其中特定实体倍增的过程。在本公开内容的上下文中，该术语优选地在免疫应答的情况下使用，在所述免疫应答中淋巴细胞被抗原刺激，增
殖，并且扩增识别所述抗原的特异性淋巴细胞。优选地，克隆扩增导致淋巴细胞的分化。
[0407]
脂质复合物颗粒
[0408]
在本公开内容的某些实施方案中，本文中所述的rna可存在于rna脂质复合物颗粒中。在肠胃外施用之后，特别是在静脉内施用之后，本文中所述的rna脂质复合物颗粒和包含rna脂质复合物颗粒的组合物可用于将rna递送至靶组织。可使用脂质体来制备rna脂质复合物颗粒，所述脂质体可通过将脂质在乙醇中的溶液注射到水或合适的水相中而获得。在一个实施方案中，水相具有酸性ph。在一个实施方案中，水相包含例如约5mm的量的乙酸。在一个实施方案中，脂质体和rna脂质复合物颗粒包含至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质。在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-o-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(dotma)和/或1，2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(dotap)。在一个实施方案中，所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dope)、胆固醇(chol)和/或1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(dopc)。在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1，2-二-o-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(dotma)并且所述至少一种另外的脂质包含1，2-二-(9z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dope)。在一个实施方案中，脂质体和rna脂质复合物颗粒包含1，2-二-o-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(dotma)和1，2-二-(9z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dope)。通过将脂质体与rna混合，脂质体可用于制备rna脂质复合物颗粒。
[0409]
脾靶向rna脂质复合物颗粒描述于wo 2013/143683中，其通过引用并入本文。已发现具有净负电荷的rna脂质复合物颗粒可用于优先靶向脾组织或脾细胞，例如抗原呈递细胞，特别是树突细胞。因此，在施用rna脂质复合物颗粒之后，在脾中发生rna积聚和/或rna表达。因此，本公开内容的rna脂质复合物颗粒可用于在脾中表达rna。在一个实施方案中，在施用rna脂质复合物颗粒之后，在肺和/或肝中没有或基本上不发生rna积聚和/或rna表达。在一个实施方案中，在施用rna脂质复合物颗粒之后，在抗原呈递细胞，例如脾中的专职抗原呈递细胞中发生rna积聚和/或rna表达。因此，本公开内容的rna脂质复合物颗粒可用于在这样的抗原呈递细胞中表达rna。在一个实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞和/或巨噬细胞。
[0410]
rna脂质复合物颗粒直径
[0411]
在一个实施方案中，本文中所述的rna脂质复合物颗粒的平均直径为约200nm至约1000nm、约200nm至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm、或约350nm至约400nm。在一个实施方案中，所述rna脂质复合物颗粒的平均直径为约250nm至约700nm。在另一个实施方案中，所述rna脂质复合物颗粒的平均直径为约300nm至约500nm。在一个示例性实施方案中，所述rna脂质复合物颗粒的平均直径为约400nm。
[0412]
在一个实施方案中，本文中所述rna脂质复合物颗粒表现出小于约0.5、小于约0.4、或小于约0.3的多分散性指数。举例来说，rna脂质复合物颗粒可表现出为约0.1至约0.3的多分散性指数。
[0413]
脂质
[0414]
在一个实施方案中，本文中所述的脂质溶液、脂质体和rna脂质复合物颗粒包含阳离子脂质。本文中使用的“阳离子脂质”是指具有净正电荷的脂质。阳离子脂质通过与脂质基质的静电相互作用结合带负电荷的rna。一般来说，阳离子脂质具有亲脂性部分，例如甾
醇、酰基或二酰基链，并且脂质的头基通常携带正电荷。阳离子脂质的一些实例包括但不限于1，2-二-o-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(dotma)、二甲基双二十八烷基铵(ddab)、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(dotap)、1，2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(dodap)、1，2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷、1，2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷、双十八烷基二甲基氯化铵(dodac)、2，3-二(十四烷氧基)丙基-(2-羟乙基)-二甲基铵(2，3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium，dmrie)、1，2-二豆蔻酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(dmepc)、1，2-二豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(dmtap)、1，2-二油氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(dorie)、和2，3-二油酰氧基n-[2(精胺甲酰胺)乙基]-n，n-二甲基-1-三氟乙酸丙铵(dospa)。优选的是dotma、dotap、dodac和dospa。在一些具体实施方案中，阳离子脂质是dotma和/或dotap。
[0415]
可并入另外的脂质以调整总的正负电荷比和rna脂质复合物颗粒的物理稳定性。在某些实施方案中，所述另外的脂质是中性脂质。本文中使用的“中性脂质”是指净电荷为零的脂质。中性脂质的一些实例包括但不限于1，2-二-(9z-十八烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dope)、1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(dopc)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇和脑苷脂。在一些具体实施方案中，另外的脂质是dope、胆固醇和/或dopc。
[0416]
在某些实施方案中，rna脂质复合物颗粒包含阳离子脂质和另外的脂质二者。在一个示例性实施方案中，阳离子脂质是dotma，并且另外的脂质是dope。不希望受到理论的束缚，与所述至少一种另外的脂质的量相比，所述至少一种阳离子脂质的量可影响重要的rna脂质复合物颗粒特征，例如电荷、颗粒尺寸、稳定性、组织选择性和rna的生物活性。因此，在一些实施方案中，所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种另外的脂质的摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2、或约3∶1至约1∶1。在一些具体实施方案中，摩尔比可以为约3∶1、约2.75∶1、约2.5∶1、约2.25∶1、约2∶1、约1.75∶1、约1.5∶1、约1.25∶1、或约1∶1。在一个示例性实施方案中，所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种另外的脂质的摩尔比为约2∶1。
[0417]
电荷比
[0418]
本公开内容的rna脂质复合物颗粒的电荷是所述至少一种阳离子脂质中存在的电荷与rna中存在的电荷的总和。电荷比是所述至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与rna中存在的负电荷的比。至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与rna中存在的负电荷的电荷比通过以下方程来计算：电荷比＝[(阳离子脂质浓度(mol))*(阳离子脂质中的正电荷总数)]/[(rna浓度(mol))*(rna中的负电荷总数)]。rna的浓度和至少一种阳离子脂质的量可由本领域技术人员使用常规方法来确定。
[0419]
在一个实施方案中，在生理ph下rna脂质复合物颗粒中的正电荷与负电荷的电荷比为约1.6∶2至约1∶2或约1.6∶2至约1.1∶2。在一些具体实施方案中，在生理ph下rna脂质复合物颗粒中的正电荷与负电荷的电荷比为约1.6∶2.0、约1.5∶2.0、约1.4∶2.0、约1.3∶2.0、约1.2∶2.0、约1.1∶2.0或约1∶2.0。
[0420]
已发现具有这样的电荷比的rna脂质复合物颗粒可用于优先靶向脾组织或脾细胞，例如抗原呈递细胞，特别是树突细胞。因此，在一个实施方案中，在施用rna脂质复合物颗粒之后，在脾中发生rna积聚和/或rna表达。因此，本公开内容的rna脂质复合物颗粒可用于在脾中表达rna。在一个实施方案中，在施用rna脂质复合物颗粒之后，在肺和/或肝中没
有或基本上不发生rna积聚和/或rna表达。在一个实施方案中，在施用rna脂质复合物颗粒之后，在抗原呈递细胞，例如脾中的专职抗原呈递细胞中发生rna积聚和/或rna表达。因此，本公开内容的rna脂质复合物颗粒可用于在这样的抗原呈递细胞中表达rna。在一个实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞和/或巨噬细胞。
[0421]
放射治疗
[0422]
放射治疗(radiotherapy，rt)是第二最常使用的并且被给予至约50％的癌症患者的治疗方案。存在不同类型的rt治疗，使用高能光子(x射线和γ射线)、粒子辐照(例如质子、碳离子)或放射性核素(铯137、铱192、碘125)将辐射局部递送至恶性组织。局部rt(lrt)面临着超过120年长的技术改进和辐射剂量细化的历史。
[0423]
电离辐射是指具有足够能量以电离物质的辐射，并且可分为电磁辐射(x射线和γ射线)和粒子辐射(α和β粒子、质子、重离子)。电离辐射的天然来源是放射性同位素，其在放射性衰变时发射独特的α(he
2+
)、β(e-或e
+
)和γ射线(高能光子)谱。电离事件的数目和组织穿透深度是主动能(primary kinetic energy)和(如果带电荷的话)库仑能(coulomb energy)的函数。辐射剂量以格雷(gray，gy)测量，作为吸收的辐射剂量/单位物质质量(1j辐射/kg物质)的国际单位制(international systems of unit，si)单位。
[0424]
当电离辐射穿过生物物质时，其能够破坏化学键并电离分子，并且对细胞、组织和作为整体的生物体有直接和严重的影响。尽管所有细胞结构都可被辐射直接或间接(通过辐射诱导的活性氧类(reactive oxygen species，ros)间接电离)损害，但dna损伤被认为是最终和最严重的结果。电离辐射可引起不同类型的dna损伤，例如碱基损伤、单链断裂(single-strand break，ssb)和双链断裂(double-strand break，dsb)。dna损伤的类型和密度是辐射类型(例如，电磁或粒子)和剂量的函数。然而，确切的细胞命运取决于细胞内在因素，例如细胞类型、细胞周期阶段、修复能力和细胞死亡能力(proficiency)，其为启动的dna损伤响应(dna-damage response，ddr)的函数。第一，如果细胞有修复能力并且损伤最小，则细胞可修复其损伤。碱基损伤和ssb通过碱基切除修复(base-excision repair，ber)或核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，ner)来修复，而更严重的dsb通过非同源末端连接(non-homologous end-joining，nhej，所有细胞周期阶段)或同源重组(homologous recombination，hr，仅s和g2阶段)来修复。第二，细胞可试图修复dna损伤，但未成功并以其损伤形式增殖。然而未修复的dsb可通过有丝分裂灾变导致细胞死亡，错误修复的dsb导致染色体易位和基因组不稳定并可引起继发性癌症。第三，细胞识别损伤并经历程序性细胞死亡(凋亡)。
[0425]
由于大多数癌细胞表现出异常的dna修复途径和受损的细胞周期控制，其与其健康对应体相比对电离辐射的响应可不同。
[0426]
细胞杀伤的线性二次(linear-quadratic，lq)模型是辐射生物学和物理学中的关键数学工具之一，并提供了递送剂量与细胞存活之间的简单关系。在体外施加不同的辐射剂量，并且细胞的存活通过在克隆形成存活测定中测量的其产生可生存祖细胞集落的能力来确定。克隆形成存活测定是测量对辐射有响应的细胞存活的公认金标准，并且由定义，其中s是存活细胞分数，d是总剂量，并且α和β是细胞放射敏感性的量度。将存活分数针对辐射剂量以对数标度进行作图。存活曲线在低剂量下遵循线性斜率(α)，并且在高剂量下遵循曲线斜率(β)。该曲线的早期和晚期弯曲是细胞内在特征，并表示
为α/β比。具有高α/β比的细胞在不同剂量下经历相对恒定的细胞死亡率，而具有低α/β比的细胞显示出明显的曲率并且以提高的细胞死亡响应于高剂量辐射。缓慢增殖的细胞或组织(例如大多数健康细胞)通常修复非常好并且具有低α/β比(晚期响应组织)。快速增殖的细胞或组织(例如肿瘤细胞)通常修复较差并且具有高α/β比(急性响应组织)。尤其是在低剂量(＜2至2.5 gy)下，正常细胞由于较慢的生长和完整的dna修复而比肿瘤细胞具有存活优势。较高放射敏感性的肿瘤细胞在低剂量下形成分级放射治疗的基础，这目前仍在标准临床实践中使用。
[0427]
然而，lq模型在预测电离辐射作用方面存在严重的局限性：(i)它是用于预测体内辐射作用的体外模型，(ii)它测量克隆形成存活，然而未提供关于诱导的细胞死亡类型例如有丝分裂灾变、凋亡、坏死、坏死性凋亡、自噬或复制性衰老的信息，(iii)它没有考虑免疫系统的反应，以及(iv)在每分级的较高剂量(＞10gy)下不准确。
[0428]
对于肿瘤的放射治疗性治疗，使用两种类型的放射机器：电磁和粒子机器。根据类型(电磁或粒子)和主要能量，辐射束在组织中具有不同的剂量沉积谱。
[0429]
尽管光子不能深入穿透组织并且根据其主要能量将其能量沉积在水的前5至10cm内，但粒子束(如质子束)能够更深地穿透组织。x射线最常用于常规放射治疗，因为其相对便宜、作为粒子辐照危害较小、并且因此认为更安全。
[0430]
x射线的治疗用途面临着技术发展的悠久历史，并且许多早期的辐射机器目前仍在使用。在20世纪30年代，正电压(orthovoltage)x射线管(200至500千伏(kv))的发展首次允许用x射线束对肿瘤进行外部治疗。与天然的发射x射线或γ射线的放射性核素相比，x射线管是从电输入产生x射线的真空管。电子从阴极发射并通过真空向阳极加速。根据管电压(50kv至500kv)，电子被加速到不同的速度并产生不同能量的x射线。当电子与阳极材料碰撞时，垂直于电子束产生x范围内的轫致辐射。与天然发射的放射性核素相比，只有x射线管开启才产生辐射。所得的x射线能量是管电压和阳极材料的函数。由于其组织穿透深度低，正电压x射线在临床实践中被放弃，但它们仍然频繁应用于临床前研究。
[0431]
现今，正在使用兆伏级x射线(1至25mev)，利用医用直线加速器(linac)以产生高能x射线以用于治疗性目的。控制束的尺寸、形状和角度以覆盖肿瘤，同时避开(spearing)健康组织。常规的3d适形rt(3d conformal rt，3d-crt)和强度调制rt(intensity modulated rt，imrt)是不同形式的外部束rt(external beam rt，ebrt)。在常规rt中，辐射剂量以多个重叠束从不同角度来递送。在肿瘤内的束交叉处递送最高剂量，并且剂量随着距交叉点的距离而降低。在3d-crt中，使用肿瘤3d成像(计算机断层扫描(computed tomography，ct)、磁共振成像(magnetic resonance imaging，mri)或正电子发射断层扫描(positron emission tomography，pet))来设计更符合肿瘤形状并且更准确地勾勒出处于风险中的器官的辐射束。imrt是3d-crt的改进形式，其中束被分成数百个不同强度的子束(beamlet)，使能够实现高度适形的剂量分布和高度精确的肿瘤靶向。
[0432]
与电磁辐照相比，在20世纪70年代，使用质子束或碳束引入粒子辐照用于治疗性用途。粒子辐照的特征在于其良好的穿透潜力和在其范围末端的高能量沉积(布拉格峰(bragg peak))。在沿轨迹的有限剂量沉积的情况下允许极陡的剂量梯度。然而，辐射机器成本非常高，并且高剂量沉积伴随有继发性癌症的高风险。
[0433]
在辐射递送和辐射机器尚不成熟的时候，总辐射剂量被分级成多个较小的辐射剂
量，不是因为对基础生物学的理解，而是因为技术限制和对降低脱靶效应的期望。现今，临床lrt方案仍然基于分级lrt，每天施加1.8至2gy(星期一至星期五)持续6至8周，累积总剂量为60至80gy。
[0434]
由于在辐射递送方面的技术进步，辐射剂量可以以高准确度、降低的边缘和高剂量适形(conformation)来递送。这允许在降低的风险下在单个分级中递送较高的辐射剂量，称为立体定向体部rt(stereotactic body rt，sbrt)。另外，lrt的免疫调节作用变得已知，尤其是当每分级施加高剂量时。由于有利的免疫作用，变化正在发生，越来越多地施加单独的或与其他免疫调节剂联合的高剂量lrt。
[0435]
免疫检查点抑制剂
[0436]
本文中使用的“免疫检查点”是指免疫系统的调节剂，并且特别地是调节抗原的t细胞受体识别的强度(amplitude)和质量的共刺激和抑制性信号。在某些实施方案中，免疫检查点是抑制性信号。在某些实施方案中，抑制性信号是pd-1与pd-l1和/或pd-l2之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是ctla-4与cd80或cd86之间的相互作用以取代cd28结合。在某些实施方案中，抑制性信号是lag-3与mhc ii类分子之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是tim-3与其一种或更多种配体，例如半乳凝素9、ptdser、hmgb1和ceacam1之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是一种或数种kir与其配体之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是tigit与其配体pvr、pvrl2和pvrl3中的一种或更多种之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是cd94/nkg2a与hla-e之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是vista与其结合伴侣之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是一种或更多种siglec与其配体之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是garp与其一种或更多种配体之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是cd47与sirpα之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是pvrig与pvrl2之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是csf1r与csf1之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是btla与hvem之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是腺苷能途径(adenosinergic pathway)的一部分，例如，a2ar和/或a2br与由cd39和cd73产生的腺苷之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是b7-h3与其受体和/或b7-h4与其受体之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号由ido、cd20、nox或tdo介导。
[0437]“程序性死亡-1(programmed death-1，pd-1)”受体是指属于cd28家族的免疫抑制性受体。pd-1主要在体内先前激活的t细胞上表达，并与两种配体pd-l1(也被称为b7-h1或cd274)和pd-l2(也被称为b7-dc或cd273)结合。本文中使用的术语“pd-1”包括人pd-1(hpd-1)，hpd-1的变体、同种型和物种同源物，以及与hpd-1具有至少一个共同表位的类似物。“程序性死亡配体1(programmed death ligand-1，pd-l1)”是pd-1的两种细胞表面糖蛋白配体之一(另一种是pd-l2)，在与pd-1结合之后下调t细胞活化和细胞因子分泌。本文中使用的术语“pd-l1”包括人pd-l1(hpd-l1)，hpd-l1的变体、同种型和物种同源物，以及与hpd-l1具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“pd-l2”包括人pd-l2(hpd-l2)，hpd-l2的变体、同种型和物种同源物，以及与hpd-l2具有至少一个共同表位的类似物。pd-1的配体(pd-l1和pd-l2)在抗原呈递细胞(例如树突细胞或巨噬细胞)以及其他免疫细胞的表面上表达。pd-1与pd-l1或pd-l2的结合导致t细胞活化的下调。表达pd-l1和/或pd-l2的癌细胞能够关闭表达pd-1的t细胞，其导致抑制抗癌免疫应答。pd-1与其配体之间的相互作用导致
肿瘤浸润淋巴细胞减少、t细胞受体介导的增殖降低以及癌细胞的免疫逃避。免疫抑制可通过抑制pd-1与pd-l1的局部相互作用来逆转，并且当pd-1与pd-l2的相互作用也被阻断时，这种作用是累加的。
[0438]“细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic t lymphocyte associated antigen-4，ctla-4)”(也被称为cd152)是t细胞表面分子，并且是免疫球蛋白超家族的成员。该蛋白质通过与cd80(b7-1)和cd86(b7-2)结合来下调免疫系统。本文中使用的术语“ctla-4”包括人ctla-4(hctla-4)，hctla-4的变体、同种型和物种同源物，以及与hctla-4具有至少一个共同表位的类似物。ctla-4是刺激性检查点蛋白cd28的同源物，对cd80和cd86具有高得多的结合亲和力。ctla4在活化的t细胞表面表达，并且其配体在专职抗原呈递细胞表面表达。ctla4与其配体的结合阻止cd28的共刺激信号并产生抑制性信号。因此，ctla-4下调t细胞活化。
[0439]“具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体”(t cell immunoreceptor with ig and itim domains，tigit，也被称为wucam或vstm3)是t细胞和自然杀伤(natural killer，nk)细胞上的免疫受体，并与在dc、巨噬细胞等上的pvr(cd155)和pvrl2(cd112；连接蛋白-2)和pvrl3(cd113；连接蛋白-3)结合并调节t细胞介导的免疫。本文中使用的术语“tigit”包括人tigit(htigit)，htigit的变体、同种型和物种同源物，以及与htigit具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“pvr”包括人pvr(hpvr)，hpvr的变体、同种型和物种同源物，以及与hpvr具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“pvrl2”包括人pvrl2(hpvrl2)，hpvrl2的变体、同种型和物种同源物，以及与hpvrl2具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“pvrl3”包括人pvrl3(hpvrl3)，hpvrl3的变体、同种型和物种同源物，以及与hpvrl3具有至少一个共同表位的类似物。
[0440]“b7家族”是指具有未定义受体的抑制性配体。b7家族包括b7-h3和b7-h4，二者在肿瘤细胞和肿瘤浸润细胞上均被上调。本文中使用的术语“b7-h3”和“b7-h4”包括人b7-h3(hb7-h3)和人b7-h4(hb7-h4)，其变体、同种型和物种同源物，以及分别与b7-h3和b7-h4具有至少一个共同表位的类似物。
[0441]“b和t淋巴细胞弱化子”(b and t lymphocyte attenuator，btla，也被称为cd272)是在th1而非th2细胞中表达的tnfr家族成员。btla表达在t细胞活化期间被诱导，并且特别地在cd8+t细胞表面表达。本文中使用的术语“btla”包括人btla(hbtla)，hbtla的变体、同种型和物种同源物，以及与hbtla具有至少一个共同表位的类似物。btla表达在人cd8+t细胞分化为效应细胞表型期间逐渐被下调。肿瘤特异性人cd8+t细胞表达高水平的btla。btla与“疱疹病毒进入介质”(herpesvirus entry mediator，hvem，也被称为tnfrsf 14或cd270)结合并参与t细胞抑制。本文中使用的术语“hvem”包括人hvem(hhvem)，hhvem的变体、同种型和物种同源物，以及与hhvem具有至少一个共同表位的类似物。btla-hvem复合物负调节t细胞免疫应答。
[0442]“杀伤细胞免疫球蛋白样受体”(killer-cell immunoglobulin-like receptor，kir)是nk t细胞和nk细胞上mhc i类分子的受体，参与健康和患病细胞之间的分化。kir与人白细胞抗原(human leukocyte antigen，hla)a、b和c结合，抑制正常的免疫细胞活化。本文中使用的术语“kir”包括人kir(hkir)，hkir的变体、同种型和物种同源物，以及与hkir具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“hla”包括hla的变体、同种型和物种同
源物，以及与hla具有至少一个共同表位的类似物。如本文中所用，kir特别是指kir2dl1、kir2dl2和/或kir2dl3。
[0443]“淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activation gene-3，lag-3)”(也被称为cd223)是通过与ii类mhc分子结合而与淋巴细胞活性的抑制相关的抑制性受体。该受体增强treg细胞的功能并抑制cd8+效应t细胞功能，导致免疫应答的抑制。lag-3在活化的t细胞、nk细胞、b细胞和dc上表达。本文中使用的术语“lag-3”包括人lag-3(hlag-3)，hlag-3的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。
[0444]“t细胞膜蛋白-3(t cell membrane protein-3，tim-3)”(也被称为havcr-2)是通过抑制th1细胞应答参与淋巴细胞活性的抑制的抑制性受体。其配体是在多种类型的癌症中上调的半乳凝素9(gal9)。其他tim-3配体包括磷脂酰丝氨酸(ptdser)、高速泳动族蛋白1(high mobility group protein 1，hmgb1)和癌胚抗原相关细胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule 1，ceacam1)。本文中使用的术语“tim-3”包括人tim3(htim-3)，htim-3的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“gal9”包括人gal9(hgal9)，hgal9的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“pdtser”包括变体和具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“hmgb1”包括人hmgb1(hhmgb1)，hhmgb1的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“ceacam1”包括人ceacam1(hceacam1)，hceacam1的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。
[0445]“cd94/nkg2a”是主要在自然杀伤细胞和cd8+t细胞的表面上表达的抑制性受体。本文中使用的术语“cd94/nkg2a”包括人cd94/nkg2a(hcd94/nkg2a)，hcd94/nkg2a的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。cd94/nkg2a受体是包含cd94和nkg2a的异源二聚体。其可能通过与配体(例如hla-e)结合来抑制nk细胞活化和cd8+t细胞功能。cd94/nkg2a限制自然杀伤细胞(nk细胞)、自然杀伤t细胞(nk-t细胞)和t细胞(α/β和γ/δ)的细胞因子释放和细胞毒性应答。nkg2a经常在肿瘤浸润细胞中表达，而hla-e在数种癌症中过表达。
[0446]“吲哚胺2，3-双加氧酶”(ido)是具有免疫抑制特性的色氨酸分解代谢酶。本文中使用的术语“ido”包括人ido(hido)，hido的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。ido是色氨酸降解的限速酶，催化其转化为犬尿酸原。因此，ido参与必需氨基酸的耗竭。已知其参与抑制t细胞和nk细胞，产生和活化treg和髓源性抑制子细胞，以及促进肿瘤血管生成。ido在许多癌症中过表达，并且表明ido可促进肿瘤细胞的免疫系统逃逸，并且当被局部炎症诱导时促进慢性肿瘤进展。
[0447]
如本文中所用，在“腺苷能途径”或“腺苷信号传导途径”中，atp被外核苷酸酶cd39和cd73转化为腺苷，导致通过腺苷与一种或更多种抑制性腺苷受体“腺苷a2a受体”(adenosine a2a receptor，a2ar，也被称为adora2a)和“腺苷a2b受体”(adenosine a2b receptor，a2br，也被称为adora2b)的结合的抑制性信号传导。腺苷是具有免疫抑制特性的核苷，并且在肿瘤微环境中以高浓度存在，限制免疫细胞浸润、细胞毒性和细胞因子产生。因此，腺苷信号传导是癌细胞避免宿主免疫系统清除的一种策略。通过a2ar和a2br的腺苷信号传导是由通常存在于肿瘤微环境中的高腺苷浓度激活的癌症治疗重要检查点。cd39、
cd73、a2ar和a2br由大多数免疫细胞表达，包括t细胞、不变自然杀伤细胞、b细胞、血小板、肥大细胞和嗜酸性粒细胞。通过a2ar和a2br的腺苷信号传导抵消了t细胞受体介导的免疫细胞活化，并导致treg数量提高，dc和效应t细胞活化降低。本文中使用的术语“cd39”包括人cd39(hcd39)，hcd39的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“cd73”包括人cd73(hcd73)，hcd73的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“a2ar”包括人a2ar(ha2ar)，ha2ar的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“a2br”包括人a2br(ha2br)，ha2br的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。
[0448]“t细胞活化的v结构域ig抑制子”(v-domain ig suppressor of t cell activation，vista，也被称为c10orf54)与pd-l1具有同源性，但显示出限制于造血区室的独特表达模式。本文中使用的术语“vista”包括人vista(hvista)，hvista的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。vista诱导t细胞抑制并由肿瘤内的白细胞表达。
[0449]“唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素”(sialic acid binding immunoglobulin type lectin，siglec)家族成员识别唾液酸并参与区分“自身”和“非自身”。本文中使用的术语“siglec”包括人siglec(hsiglec)，hsiglec的变体、同种型和物种同源物，以及与一种或更多种hsiglec具有至少一个共同表位的类似物。人基因组包含14个siglec，其中数个参与免疫抑制，包括但不限于siglec-2、siglec-3、siglec-7和siglec-9。siglec受体结合含有唾液酸的聚糖，但在其识别唾液酸残基的连接区域化学和空间分布方面是不同的。家庭成员也有不同的表达模式。多种恶性肿瘤过表达一种或更多种siglec。
[0450]“cd20”是在b细胞和t细胞表面表达的抗原。cd20的高表达可见于癌症，例如b细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、b细胞慢性淋巴细胞白血病和黑素瘤癌症干细胞。本文中使用的术语“cd20”包括人cd20(hcd20)，hcd20的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。
[0451]“糖蛋白a为主的重复序列”(glycoprotein a repetitions predominant，garp)在免疫耐受和肿瘤逃逸患者免疫系统的能力中发挥作用。本文中使用的术语“garp”包括人garp(hgarp)，hgarp的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。garp在淋巴细胞上表达，包括外周血中的treg细胞和肿瘤部位的肿瘤浸润t细胞。其可能与潜在的“转化生长因子β”(transforming growth factorβ，tgf-β)结合。treg中garp信号传导的中断导致耐受性降低并抑制treg向肠道的迁移和细胞毒性t细胞的增殖提高。
[0452]“cd47”是与配体“信号调节蛋白α”(signal-regulatory protein alpha，sirpα)结合的跨膜蛋白。本文中使用的术语“cd47”包括人cd47(hcd47)，hcd47的变体、同种型和物种同源物，以及与hcd47具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“sirpα”包括人sirpα(hsirpα)，hsirpα的变体、同种型和物种同源物，以及与hsirpα具有至少一个共同表位的类似物。cd47信号传导参与一系列细胞过程，包括细胞凋亡、增殖、黏附和迁移。cd47在许多癌症中过表达，并作为对巨噬细胞的“别吃我(don
′
t eat me)”信号发挥功能。通过抑制性抗cd47或抗sirpα抗体阻断cd47信号传导，使巨噬细胞能够吞噬癌细胞并促进癌症特异性t淋巴细胞的活化。
[0453]“含有脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域”(poliovirus receptor related immunoglobulin domain containing，pvrig，也被称为cd112r)与“脊髓灰质炎病毒受体相关2”(poliovirus receptor-related 2，pvrl2)结合。pvrig和pvrl2在许多癌症中过表达。pvrig表达还诱导tigit和pd-1表达，并且pvrl2和pvr(一种tigit配体)在数种癌症中共同过表达。阻断pvrig信号传导途径会导致t细胞功能和cd8+t细胞应答的提高，并从而降低免疫抑制和提高干扰素应答。本文中使用的术语“pvrig”包括人pvrig(hpvrig)，hpvrig的变体、同种型和物种同源物，以及与hpvrig具有至少一个共同表位的类似物。如本文中所用，“pvrl2”包括如上定义的hpvrl2。
[0454]“集落刺激因子1”途径是根据本公开内容可被靶向的另一个检查点。csf1r是结合csf1的髓系生长因子受体。阻断csf1r信号传导可在功能上对巨噬细胞应答进行重编程，从而增强抗原呈递和抗肿瘤t细胞应答。本文中使用的术语“csf1r”包括人csf1r(hcsf1r)，hcsf1r的变体、同种型和物种同源物，以及与hcsf1r具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“csf1”包括人csf1(hcsf1)，hcsf1的变体、同种型和物种同源物，以及与hcsf1具有至少一个共同表位的类似物。
[0455]“烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸nadph氧化酶”是指产生免疫抑制活性氧类(reactive oxygen species，ros)的髓系细胞的nox家族酶的酶。已发现五种nox酶(nox1至nox5)参与癌症发展和免疫抑制。升高的ros水平在几乎所有癌症中都检测到，并促进肿瘤发展和进展的许多方面。nox产生的ros会抑制nk和t细胞的功能，抑制骨髓细胞中的nox可改善相邻nk细胞和t细胞的抗肿瘤功能。本文中使用的术语“nox”包括人nox(hnox)，hnox的变体、同种型和物种同源物，以及与hnox具有至少一个共同表位的类似物。
[0456]
根据本公开内容可被靶向的另一个免疫检查点是由“色氨酸-2，3-双加氧酶”(tdo)介导的信号。tdo表示色氨酸降解中ido的替代途径，并参与免疫抑制。由于肿瘤细胞可通过tdo而不是ido分解代谢色氨酸，tdo可代表检查点阻断的另外的靶标。实际上，已发现数种癌细胞系上调tdo，并且tdo可补充ido抑制。本文中使用的术语“tdo”包括人tdo(htdo)，htdo的变体、同种型和物种同源物，以及与htdo具有至少一个共同表位的类似物。
[0457]
许多免疫检查点受特定受体与配体对之间的相互作用(例如上述那些)调节。因此，免疫检查点蛋白介导免疫检查点信号传导。例如，检查点蛋白直接或间接调节t细胞活化、t细胞增殖和/或t细胞功能。癌细胞经常利用这些检查点途径来保护其免受免疫系统的攻击。因此，根据本公开内容调节的检查点蛋白的功能通常是调节t细胞活化、t细胞增殖和/或t细胞功能。免疫检查点蛋白因此调节和维持自身耐受性以及生理免疫应答的持续时间和强度。许多免疫检查点蛋白属于b7：cd28家族或肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，tnfr)超家族，并且通过与特定配体结合，激活被募集到胞质结构域的信号传导分子(suzuki et al.，2016，jap j clin onc，46：191-203)。
[0458]
本文中使用的术语“免疫检查点调节剂”或“检查点调节剂”是指调节一种或更多种检查点蛋白的功能的分子或化合物。免疫检查点调节剂通常能够调节自身耐受性和/或免疫应答的强度和/或持续时间。优选地，根据本公开使用的免疫检查点调节剂调节一种或更多种人检查点蛋白的功能，并且因此是“人检查点调节剂”。在一个优选的实施方案中，如本文中所用的人检查点调节剂是免疫检查点抑制剂。
[0459]
本文中使用的“免疫检查点抑制剂”或“检查点抑制剂”是指完全或部分降低、抑
制、干扰或负调节一种或更多种检查点蛋白或者完全或部分降低、抑制、干扰或负调节一种或更多种检查点蛋白的表达。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂与一种或更多种检查点蛋白结合。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂与调节检查点蛋白的一种或更多种分子结合。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂例如在dna或rna水平上与一种或更多种检查点蛋白的前体结合。可使用根据本公开内容作为检查点抑制剂发挥作用的任何药剂。
[0460]
本文中使用的术语“部分地”意指至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的水平，例如检查点蛋白的抑制水平。
[0461]
在某些实施方案中，适用于本文中公开的方法的免疫检查点抑制剂是抑制性信号的拮抗剂，例如靶向例如pd-1、pd-l1、ctla-4、lag-3、b7-h3、b7-h4或tim-3的抗体。这些配体和受体在pardoll，d.，nature.12：252-264，2012中进行了综述。本文中描述了可根据本公开内容靶向的另外的免疫检查点蛋白。
[0462]
在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止与免疫检查点相关的抑制性信号。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏与免疫检查点相关的抑制性信号传导的抗体或其片段。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏抑制性信号传导的小分子抑制剂。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏抑制性信号传导的基于肽的抑制剂。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏抑制性信号传导的抑制性核酸分子。
[0463]
在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是阻止检查点阻断剂蛋白之间相互作用的抗体、其片段或抗体模拟物，例如阻止pd-1与pd-l1或pd-l2之间相互作用的抗体或其片段。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是阻止ctla-4与cd80或cd86之间相互作用的抗体、其片段或抗体模拟物。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是阻止lag-3与其配体或tim-3与其配体之间相互作用的抗体、其片段或抗体模拟物。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止通过cd39和/或cd73的抑制性信号传导和/或a2ar和/或a2br与腺苷的相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止b7-h3与其受体和/或b7-h4与其受体的相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止btla与其配体hvem的相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止一种或更多种kir与其各自配体的相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止lag-3与一种或更多种其配体的相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止tim-3与其配体半乳凝素-9、ptdser、hmgb1和ceacam1中的一种或更多种的相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止tigit与其配体pvr、pvrl2和pvrl3中的一种或更多种的相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止cd94/nkg2a与hla-e的相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止vista与一种或更多种其结合伴侣的相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止一种或更多种siglec与其各自配体的相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止cd20信号传导。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止garp与一种或更多种其配体的相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止cd47与sirpα的相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止pvrig与pvrl2的相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止csf1r与csf1的相互作用。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止nox信号传导。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止ido和/或tdo信号传导。
[0464]
如本文中所述，抑制或阻断抑制性免疫检查点信号传导导致阻止或逆转免疫抑制
以及针对癌细胞的t细胞免疫的建立或增强。在一个实施方案中，如本文中所述，对免疫检查点信号传导的抑制降低或抑制了免疫系统的功能障碍。在一个实施方案中，如本文中所述，对免疫检查点信号传导的抑制使功能失调的免疫细胞功能失调程度降低。在一个实施方案中，如本文中所述，对免疫检查点信号传导的抑制使功能失调的t细胞之功能失调程度降低。
[0465]
本文中使用的术语“功能障碍”是指对抗原刺激的免疫应答性降低的状态。该术语包括可发生抗原识别但随后的免疫应答对控制感染或肿瘤生长无效的耗竭和/或无反应性的共同要素。功能障碍还包括抗原识别因免疫细胞功能障碍而受到阻滞的状态。
[0466]
本文中使用的术语“功能失调”是指处于对抗原刺激的免疫应答性降低的状态的免疫细胞。功能失调包括对抗原识别无应答以及将抗原识别转化为下游t细胞效应子功能的能力受损，所述功能例如增殖、细胞因子产生(例如，il-2)和/或靶细胞杀伤。
[0467]
本文中使用的术语“无反应性”是指由于通过t细胞受体(t cell receptor，tcr)递送的信号不完整或不足导致对抗原刺激无应答的状态。在没有共刺激的情况下，抗原刺激也会导致t细胞无反应性，导致即使在共刺激的情况下，细胞也难以被抗原随后激活。无应答状态通常会被il-2的存在所覆盖。无反应性t细胞不会进行克隆扩增和/或获得效应子功能。
[0468]
本文中使用的术语“耗竭”是指免疫细胞耗竭，例如作为在许多慢性感染和癌症期间发生的持续tcr信号传导引起的t细胞功能障碍状态的t细胞耗竭。其与无反应性的区别在于，其不是通过不完整或不充分的信号传导产生的，而是由于持续信号传导产生的。耗竭由不良的效应子功能、抑制性受体的持续表达和不同于功能性效应子或记忆t细胞的转录状态定义。耗竭阻止对疾病(例如感染和肿瘤)的最佳控制。耗竭可由外在负调节途径(例如免疫调节细胞因子)以及细胞内在负调节途径(抑制性免疫检查点途径，例如本文中所述)引起。
[0469]“增强t细胞功能”意指诱导、引起或刺激t细胞具有持续的或放大的生物学功能，或者更新或再活化已耗竭或失活的t细胞。增强t细胞功能的实例包括：相对于干预之前的该水平，来自cd8+t细胞的γ-干扰素分泌提高、增殖提高、抗原应答性(例如肿瘤清除)提高。在一个实施方案中，增强水平为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％或更多。测量这种增强的方式是本领域普通技术人员已知的。
[0470]
免疫检查点抑制剂可以是抑制性核酸分子。本文中使用的术语“抑制性核酸”或“抑制性核酸分子”是指完全或部分降低、抑制、干扰或负调节一种或更多种检查点蛋白的核酸分子，例如dna或rna。抑制性核酸分子包括但不限于寡核苷酸、sirna、shrna、反义dna或rna分子以及适配体(例如，dna或rna适配体)。
[0471]
本文中使用的术语“寡核苷酸”是指能够降低蛋白质表达(特别是检查点蛋白的表达，例如本文中所述的检查点蛋白的表达)的核酸分子。寡核苷酸是短的dna或rna分子，通常包含2至50个核苷酸。寡核苷酸可以是单链或双链的。检查点抑制剂寡核苷酸可以是反义寡核苷酸。反义寡核苷酸是与给定序列互补，特别是与检查点蛋白的核酸序列(或其片段)的序列互补的单链dna或rna分子。反义rna通常用于通过与所述mrna结合来阻止mrna，例如编码检查点蛋白的mrna的蛋白质翻译。反义dna通常用于靶向特定的互补(编码或非编码)
rna。如果发生结合，这样的dna/rna杂交体可被酶rna酶h降解。此外，吗啉代反义寡核苷酸可用于脊椎动物的基因敲除。例如，kryczek et al.，2006(j exp med，203：871-81)设计了b7-h4特异性的吗啉代，其特异性阻断巨噬细胞中b7-h4的表达，导致具有肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，taa)特异性t细胞的小鼠中t细胞增殖提高以及肿瘤体积降低。
[0472]
术语“sirna”或“小干扰rna”或“小抑制性rna”在本文中可互换使用并且是指具有20至25个碱基对的典型长度的双链rna分子，其干扰具有互补核苷酸序列的特定基因，例如编码检查点蛋白的基因的表达。在一个实施方案中，sirna干扰mrna，因此阻断翻译，例如免疫检查点蛋白的翻译。外源sirna的转染可用于基因敲低，然而效果可能只是暂时的，尤其是在快速分裂的细胞中。可通过例如rna修饰或通过使用表达载体来实现稳定转染。用于用sirna稳定转染细胞的可用修饰和载体是本领域已知的。还可修饰sirna序列以在两条链之间引入短环，从而产生“小发夹rna”或“shrna”。shrna可被dicer加工成功能性sirna。shrna具有相对较低的降解和周转率。因此，免疫检查点抑制剂可以是shrna。
[0473]
本文中使用的术语“适配体”是指能够结合靶分子(例如多肽)的通常长度为25至70个核苷酸的单链核酸分子，例如dna或rna。在一个实施方案中，适配体与免疫检查点蛋白，例如本文中所述的免疫检查点蛋白结合。例如，根据本公开内容的适配体可与免疫检查点蛋白或多肽特异性结合，或者与调节免疫检查点蛋白或多肽表达的信号传导途径中的分子特异性结合。适配体的产生和治疗性用途是本领域公知的(参见，例如，us 5,475,096)。
[0474]
术语“小分子抑制剂”或“小分子”在本文中可互换使用，并且是指低分子量有机化合物，通常高至1000道尔顿，其全部或部分降低、抑制、干扰或负调节一个或更多个如上所述的检查点蛋白。这样的小分子抑制剂通常是通过有机化学合成的，但也可从天然来源(例如，植物、真菌和微生物)中分离。小分子量允许小分子抑制剂迅速扩散穿过细胞膜。例如，本领域已知的多种a2ar拮抗剂是分子量低于500道尔顿的有机化合物。
[0475]
免疫检查点抑制剂可以是抗体、其抗原结合片段、抗体模拟物或包含具有所需特异性的抗原结合片段的抗体部分的融合蛋白。抗体或其抗原结合片段如本文中所述。作为免疫检查点抑制剂的抗体或其抗原结合片段特别地包括与免疫检查点蛋白，例如免疫检查点受体或免疫检查点受体配体结合的抗体或其抗原结合片段。如本文中所述，抗体或抗原结合片段也可与另外的部分缀合。特别地，抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。优选地，免疫检查点抑制剂抗体或其抗原结合片段是免疫检查点受体的拮抗剂或免疫检查点受体配体的拮抗剂。
[0476]
在一个优选的实施方案中，作为免疫检查点抑制剂的抗体是分离的抗体。
[0477]
根据本公开内容的作为免疫检查点抑制剂的抗体或其抗原结合片段也可以是与任何已知的免疫检查点抑制剂抗体交叉竞争抗原结合的抗体。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂抗体与一种或更多种本文中所述的免疫检查点抑制剂抗体交叉竞争。抗体交叉竞争结合抗原的能力表明，这些抗体可与抗原的相同表位区域结合，或者当与另一个表位结合时，会在空间上阻碍已知免疫检查点抑制剂抗体与该特定表位区域的结合。这些交叉竞争的抗体可具有与其交叉竞争的那些非常相似的功能特性，因为预计其通过与相同的表位结合或通过空间阻碍配体的结合来阻断免疫检查点与其配体的结合。交叉竞争抗体可基于其在标准结合测定(例如表面等离子体共振分析、elisa测定或流式细胞术)中与一种或
更多种已知抗体交叉竞争的能力而容易地被鉴定(参见，例如，wo 2013/173223)。
[0478]
在某些实施方案中，与一种或更多种已知抗体交叉竞争与给定抗原的结合或作为一种或更多种已知抗体与给定抗原的相同表位区域结合的抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。对于施用于人患者，这些交叉竞争的抗体可以是嵌合抗体，或者人源化抗体或人抗体。这样的嵌合、人源化或人的单克隆抗体可通过本领域公知的方法制备和分离。
[0479]
检查点抑制剂也可以是分子(或其变体)本身的可溶性形式，例如可溶性pd-l1或pd-l1融合物。
[0480]
在本公开内容的上下文中，可使用多于一种的检查点抑制剂，其中多于一种的检查点抑制剂靶向不同的检查点途径或相同的检查点途径。优选地，多于一种的检查点抑制剂是不同的检查点抑制剂。优选地，如果使用多于一种的不同的检查点抑制剂，特别是使用至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的检查点抑制剂，优选使用2、3、4或5种不同的检查点抑制剂，更优选使用2、3或4种不同的检查点抑制剂，甚至更优选使用2或3种不同的检查点抑制剂并且最优选使用2种不同的检查点抑制剂。不同检查点抑制剂组合的优选实例包括pd-1信号传导抑制剂和ctla-4信号传导抑制剂、pd-1信号传导抑制剂和tigit信号传导抑制剂、pd-1信号传导抑制剂和b7-h3和/或b7-h4信号传导抑制剂、pd-1信号传导抑制剂和btla信号传导抑制剂、pd-1信号传导抑制剂和kir信号传导抑制剂、pd-1信号传导抑制剂和lag-3信号传导抑制剂、pd-1信号传导抑制剂和tim-3信号传导抑制剂、pd-1信号传导抑制剂和cd94/nkg2a信号传导抑制剂、pd-1信号传导抑制剂和ido信号传导抑制剂、pd-1信号传导抑制剂和腺苷信号传导抑制剂、pd-1信号传导抑制剂和vista信号传导抑制剂、pd-1信号传导抑制剂和siglec信号传导抑制剂、pd-1信号传导抑制剂和cd20信号传导抑制剂、pd-1信号传导抑制剂和garp信号传导抑制剂、pd-1信号传导抑制剂和cd47信号传导抑制剂、pd-1信号传导抑制剂和pvrig信号传导抑制剂、pd-1信号传导抑制剂和csf1r信号传导抑制剂、pd-1信号传导抑制剂和nox信号传导抑制剂、以及pd-1信号传导抑制剂和tdo信号传导抑制剂。
[0481]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂(免疫检查点阻断剂)是pd-1/pd-l1或pd-1/pd-l2信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了用于向对象施用pd-1信号传导途径的检查点抑制剂。在某些实施方案中，pd-1信号传导途径的检查点抑制剂是pd-1抑制剂。在某些实施方案中，pd-1信号传导途径的检查点抑制剂是pd-1配体抑制剂，例如pd-l1抑制剂或pd-l2抑制剂。在一个优选的实施方案中，pd-1信号传导途径的检查点抑制剂是破坏pd-1受体与其配体pd-l1和/或pd-l2中的一种或更多种之间的相互作用的抗体或其抗原结合部分。与pd-1结合并破坏pd-1与一种或更多种其配体之间相互作用的抗体是本领域已知的。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分与pd-1特异性结合。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分与pd-l1特异性结合并抑制其与pd-1的相互作用，从而提高免疫活性。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分与pd-l2特异性结合并抑制其与pd-1的相互作用，从而提高免疫活性。
[0482]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是ctla-4信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了用于向对象施用ctla-4信号传导途径的检查点抑制剂。在某些实施方案中，ctla-4信号传导途径的检查点抑制剂是ctla-4抑制剂。在某些实施方案中，ctla-4信号传导途径的检查点抑制剂是ctla-4配体抑制剂。
[0483]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是tigit信号传导途径的组分。因此，本公
开内容的某些实施方案提供了用于向对象施用tigit信号传导途径的检查点抑制剂。在某些实施方案中，tigit信号传导途径的检查点抑制剂是tigit抑制剂。在某些实施方案中，tigit信号传导途径的检查点抑制剂是tigit配体抑制剂。
[0484]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是b7家族信号传导途径的组分。在某些实施方案中，b7家族成员是b7-h3和b7-h4。本公开内容的某些实施方案提供了用于向对象施用b7-h3和/或b7-4的检查点抑制剂。因此，本公开内容的某些实施方案提供了用于向对象施用靶向b7-h3或b7-h4的抗体或其抗原结合部分。b7家族没有任何限定的受体，但这些配体在肿瘤细胞或肿瘤浸润细胞上被上调。临床前小鼠模型已表明，阻断这些配体可增强抗肿瘤免疫。
[0485]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是btla信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了用于向对象施用btla信号传导途径的检查点抑制剂。在某些实施方案中，btla信号传导途径的检查点抑制剂是btla抑制剂。在某些实施方案中，btla信号传导途径的检查点抑制剂是hvem抑制剂。
[0486]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是一种或更多种kir信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了用于向对象施用一种或更多种kir信号传导途径的检查点抑制剂。在某些实施方案中，一种或更多种kir信号传导途径的检查点抑制剂是kir抑制剂。在某些实施方案中，一种或更多种kir信号传导途径的检查点抑制剂是kir配体抑制剂。例如，根据本公开内容的kir抑制剂可以是与kir2dl1、kir2dl2和/或kir2dl3结合的抗kir抗体。
[0487]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是lag-3信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了用于向对象施用lag-3信号传导的检查点抑制剂。在某些实施方案中，lag-3信号传导途径的检查点抑制剂是lag-3抑制剂。在某些实施方案中，lag-3信号传导途径的检查点抑制剂是lag-3配体抑制剂。
[0488]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是tim-3信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了用于向对象施用tim-3信号传导途径的检查点抑制剂。在某些实施方案中，tim-3信号传导途径的检查点抑制剂是tim-3抑制剂。在某些实施方案中，tim-3信号传导途径的检查点抑制剂是tim-3配体抑制剂。
[0489]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是cd94/nkg2a信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了用于向对象施用cd94/nkg2a信号传导途径的检查点抑制剂。在某些实施方案中，cd94/nkg2a信号传导途径的检查点抑制剂是cd94/nkg2a抑制剂。在某些实施方案中，cd94/nkg2a信号传导途径的检查点抑制剂是cd94/nkg2a配体抑制剂。
[0490]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是ido信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了用于向对象施用ido信号传导途径的检查点抑制剂，例如ido抑制剂。
[0491]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是腺苷信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了用于向对象施用腺苷信号传导途径的检查点抑制剂。在某些实施方案中，腺苷信号传导途径的检查点抑制剂是cd39抑制剂。在某些实施方案中，腺苷信号传导途径的检查点抑制剂是cd73抑制剂。在某些实施方案中，腺苷信号传导途径的检查点抑制剂是a2ar抑制剂。在某些实施方案中，腺苷信号传导途径的检查点抑制剂是a2br抑制
剂。
[0492]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是vista信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了用于向对象施用vista信号传导途径的检查点抑制剂。在某些实施方案中，vista信号传导途径的检查点抑制剂是vista抑制剂。
[0493]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是一种或更多种siglec信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了用于向对象施用一种或更多种siglec信号传导途径的检查点抑制剂。在某些实施方案中，一种或更多种siglec信号传导途径的检查点抑制剂是siglec抑制剂。在某些实施方案中，一种或更多种siglec信号传导途径的检查点抑制剂是siglec配体抑制剂。
[0494]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是cd20信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了用于向对象施用cd20信号传导途径的检查点抑制剂。在某些实施方案中，cd20信号传导途径的检查点抑制剂是cd20抑制剂。
[0495]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是garp信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了用于向对象施用garp信号传导途径的检查点抑制剂。在某些实施方案中，garp信号传导途径的检查点抑制剂是garp抑制剂。
[0496]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是cd47信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了用于向对象施用cd47信号传导途径的检查点抑制剂。在某些实施方案中，cd47信号传导途径的检查点抑制剂是cd47抑制剂。在某些实施方案中，cd47信号传导途径的检查点抑制剂是sirpα抑制剂。
[0497]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是pvrig信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了用于向对象施用pvrig信号传导途径的检查点抑制剂。在某些实施方案中，pvrig信号传导途径的检查点抑制剂是pvrig抑制剂。在某些实施方案中，pvrig信号传导途径的检查点抑制剂是pvrig配体抑制剂。
[0498]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是csf1r信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了用于向对象施用csf1r信号传导途径的检查点抑制剂。在某些实施方案中，csf1r信号传导途径的检查点抑制剂是csf1r抑制剂。在某些实施方案中，csf1r信号传导途径的检查点抑制剂是csf1抑制剂。
[0499]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是nox信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了用于向对象施用nox信号传导途径的检查点抑制剂，例如nox抑制剂。
[0500]
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是tdo信号传导途径的组分。因此，本公开内容的某些实施方案提供了用于向对象施用tdo信号传导途径的检查点抑制剂，例如tdo抑制剂。
[0501]
示例性pd-1抑制剂包括但不限于抗pd-1抗体，例如：bgb-a317(beigene；参见us 8,735,553、wo 2015/35606和us 2015/0079109)，西米普利单抗(regeneron；参见wo 2015/112800)和兰立珠单抗(例如，在wo2008/156712中公开为hpd109a及其人源化衍生物h409a1、h409a16和h409a17)，ab137132(abcam)，eh12.2h7和rmp1-14(#be0146；bioxcell lifesciences pvt.ltd.)，mih4(affymetrixebioscience)，纳武单抗(opdivo，bms-936558；bristol myers squibb；参见wo 2006/121168)，派姆单抗(keytruda；mk-3475；
merck；参见wo 2008/156712)，皮地利珠单抗(ct-011；curetech；参见hardy et al.，1994，cancer res.，54(22)：5793-6和wo 2009/101611)，pdr001(novartis；参见wo 2015/112900)，medi0680(amp-514；astrazeneca；参见wo 2012/145493)，tsr-042(参见wo 2014/179664)、regn-2810(h4h7798n；参见us 2015/0203579)，js001(taizhou junshi pharma；参见si-yang liu et al.，2007，j.hematol.oncol.70：136)，amp-224(gsk-2661380；参见li et al.，2016，int j mol sci 17(7)：1151以及wo 2010/027827和wo 2011/066342)、pf-06801591(pfizer)，bgb-a317(beigene；参见wo 2015/35606和us 2015/0079109)，bi 754091，shr-1210(参见wo2015/085847)，以及如wo 2006/121168中所述的抗体17d8、2d3、4h1、4a11、7d3和5f4，incshr1210(jiangsu hengrui medicine；也被称为shr-1210；参见wo 2015/085847)，tsr-042(tesaro biopharmaceutical；也被称为anb011；参见wo2014/179664)，gls-010(wuxi/harbin gloria pharmaceuticals；也被称为wbp3055；参见si-yang et al.，2017，j.hematol.oncol.70：136)，sti-1110(sorrento therapeutics；参见wo 2014/194302)，agen2034(agenus；参见wo 2017/040790)，mga012(macrogenics；参见wo 2017/19846)，ibi308(innovent；参见wo 2017/024465、wo 2017/025016、wo 2017/132825和wo 2017/133540)，如在例如us 7,488,802、us 8,008,449、us 8,168,757、wo 03/042402、wo 2010/089411(还公开了抗pd-l1抗体)、wo 2010/036959、wo 2011/159877(还公开了针对tim-3的抗体)、wo 2011/082400、wo 2011/161699、wo 2009/014708、wo 03/099196、wo 2009/114335、wo 2012/145493(还公开了针对pd-l1的抗体)、wo 2015/035606、wo 2014/055648(还公开了抗kir抗体)、us 2018/0185482(还公开了抗pd-l1和抗tigit抗体)、us 8,008,449、us 8,779,105、us 6,808,710、us 8,168,757、us 2016/0272708和us 8,354,509中所述的抗pd-1抗体，如例如在shaabani et al.，2018，expert op ther pat.，28(9)：665-678和sasikumar和ramachandra，2018，biodrugs，32(5)：481-497中公开的针对pd-1信号传导途径的小分子拮抗剂，如例如在wo 2019/000146和wo 2018/103501中公开的针对pd-1的sirna，如在wo 2018/222711中公开的可溶性pd-1蛋白，以及如例如在wo 2018/022831中所述的包含可溶形式的pd-1的溶瘤病毒。
[0502]
在某个实施方案中，pd-1抑制剂是纳武单抗(opdivo；bms-936558)、派姆单抗(keytruda；mk-3475)、皮地利珠单抗(ct-011)、pdr001、medi0680(amp-514)、tsr-042、regn2810、js001、amp-224(gsk-2661380)、pf-06801591、bgb-a317、bi 754091或shr-1210。
[0503]
示例性pd-1配体抑制剂是pd-l1抑制剂和pd-l2抑制剂，并且包括但不限于抗pd-l1抗体，例如：medi4736(度伐单抗；astrazeneca；参见wo 2011/066389)，msb-0010718c(参见us 2014/0341917)，yw243.55.s70(参见wo 2010/077634和us 8,217,149的seq id no：20)，mih1(affymetrix ebioscience；参见ep 3 230 319)，mdx-1105(roche/genentech；参见wo2013019906和us 8,217,149)sti-1014(sorrento；参见wo2013/181634)，ck-301(检查点治疗剂)，kn035(3d med/alphamab；参见zhang et al.，2017，cell discov.3：17004)，阿特珠单抗(tecentriq；rg7446；mpdl3280a；r05541267；参见us 9,724,413)，bms-936559(bristol myers squibb；参见us 7,943,743、wo 2013/173223)，阿维单抗(bavencio；参见us 2014/0341917)，ly3300054(eli lilly co.)，cx-072(proclaim-cx-072；也被称为cytomx；参见wo2016/149201)，faz053，kn035(参见wo2017020801和wo2017020802)，mdx-1105(参见us 2015/0320859)，在us 7,943,743中公开的抗pd-l1抗体，包括3g10、12a4(也
被称为bms-936559)、10a5、5f8、10h10、1b12、7h1、11e6、12b7和13g4，如wo 2010/077634，us 8,217,149，wo 2010/036959，wo 2010/077634，wo 2011/066342，us 8,217,149，us 7,943,743，wo 2010/089411，us 7,635,757，us 8,217,149，us 2009/0317368，wo 2011/066389，wo2017/034916，wo2017/020291，wo2017/020858，wo2017/020801，wo2016/111645，wo2016/197367，wo2016/061142，wo2016/149201，wo2016/000619，wo2016/160792，wo2016/022630，wo2016/007235，wo2015/179654，wo2015/173267，wo2015/181342，wo2015/109124，wo 2018/222711，wo2015/112805，wo2015/061668，wo2014/159562，wo2014/165082，wo2014/100079中所述的抗pd-l1抗体。
[0504]
示例性ctla-4抑制剂包括但不限于单克隆抗体伊匹单抗(yervoy；bristol myers squibb)和替西木单抗(pfizer/medlmmune)，trevilizumab，agen-1884(agenus)和ator-1015，在wo 2001/014424、us 2005/0201994、ep 1212422、us 5,811,097、us 5,855,887、us 6,051,227、us 6,682,736、us 6,984,720、wo 01/14424、wo 00/37504、us 2002/0039581、us 2002/086014、wo 98/42752、us 6,207,156、us 5,977,318、us 7,109,003和us 7,132,281中公开的抗ctla4抗体，显性负蛋白阿巴西普(orencia；参见ep 2 855 533)，其包含与ctla-4 ecd融合的igg 1的fe区，以及贝拉西普(nulojix；参见wo 2014/207748)，其是相对于阿巴西普在ctla-4 ecd中具有两个氨基酸替换的第二代更高亲和力ctla-4-ig变体，可溶性ctla-4多肽，例如rg2077和ctla4-igg4m(参见us 6,750,334)，针对ctla-4的抗ctla-4适配体和sirna，例如，如us 2015/203848中所公开。示例性的ctla-4配体抑制剂描述于pile et al.，2015(encyclopedia of inflammatory diseases，m.pamham(ed.)，doi：10.1007/978-3-0348-0620-6_20)。
[0505]
tigit信号传导途径的示例性检查点抑制剂包括但不限于抗tigit抗体，例如bms-986207、com902(cgen-15137；compugen)、ab154(arcusbiosciences)或etigilimab(omp-313m32；oncomed pharmaceuticals)，或者在wo2017/059095(特别是“mab10”)、us 2018/0185482、wo 2015/009856和us 2019/0077864中公开的抗体。
[0506]
b7-h3的示例性检查点抑制剂包括但不限于fc优化的单克隆抗体依诺妥珠单抗(enoblituzumab)(mga271；macrogenics；参见us 2012/0294796)以及抗b7-h3抗体mgd009(macrogenics)和皮地利珠单抗(参见us 7,332,582)。
[0507]
示例性b7-h4抑制剂包括但不限于如dangaj et al.，2013(cancer research 73：4820-9)和smith et al.，2014(gynecol oncol，134：181-189)、wo 2013/025779(例如，由seq id no：3和4编码的2d1，由seq id no：37和39编码的2h9，以及由seq id no：41和43编码的2e11)以及wo 2013/067492(例如，具有选白seq id no：1至8的氨基酸序列的抗体)所述的抗体，吗啉代反义寡核苷酸，例如，如kryczek et al.，2006(j exp med，203：871-81)所述，或者b7-h4的可溶性重组形式，例如如在us 2012/0177645中所公开的。
[0508]
示例性btla抑制剂包括但不限于crawford和wherry，2009(j leukocyte biol 86：5-8)、wo 2011/014438(例如，4c7或包含根据seq id no：8和15和/或seq id no：11和18的重链和轻链的抗体)、wo 2014/183885(例如，以cncm i-4752号保藏的抗体)和us 2018/155428中所述的抗btla抗体。
[0509]
kir信号传导的检查点抑制剂包括但不限于单克隆抗体lirilumab(1-7f9；iph2102；参见参见us 8,709,411)，iph4102(innate pharma；参见marie-cardine et al.，
2014，cancer 74(21)：6060-70)，如例如在us 2018/208652、us 2018/117147、us 2015/344576、wo 2005/003168、wo 2005/009465、wo 2006/072625、wo 2006/072626、wo 2007/042573、wo 2008/084106(例如包含根据seq id no：2和3的重链和轻链的抗体)、wo 2010/065939、wo 2012/071411、wo 2012/160448和wo 2014/055648中公开的抗kir抗体。
[0510]
lag-3抑制剂包括但不限于抗lag-3抗体bms-986016(bristol-myers squibb；参见wo 2014/008218和wo 2015/116539)，25f7(参见us2011/0150892)，imp731(参见wo 2008/132601)，h5l7bw(参见wo2014140180)，mk-4280(28g-10；merck；参见wo 2016/028672)，regn3767(regneron/sanofi)，bap050(参见wo 2017/019894)，imp-701(lag-525；novartis)sym022(symphogen)，tsr-033(tesaro)，mgd013(macrogenics开发的靶向lag-3和pd-1的双特异性dart抗体)，bi754111(boehringer ingelheim)，fs118(f-star开发的靶向lag-3和pd-1的双特异性抗体)，gsk2831781(gsk)以及如wo 2009/044273，wo 2008/132601，wo 2015/042246，ep 2 320 940，us 2019/169294，us 2019/169292，wo 2016/028672，wo 2016/126858，wo 2016/200782，wo 2015/200119，wo 2017/220569，wo 2017/087589，wo 2017/219995，wo 2017/019846，wo 2017/106129，wo 2017/062888，wo 2018/071500，wo 2017/087901，us 2017/0260271，wo 2017/198741，wo2017/220555，wo2017/015560，wo2017/025498，wo2017/149143，wo 2018/069500，wo2018/083087，wo2018/034227 wo2014/140180，
[0511]
中公开的抗体，lag-3拮抗性蛋白ava-017(avacta)，可溶性lag-3融合蛋白imp321(eftilagimod alpha；immutep；参见ep 2 205 257和brignone et al.，2007，j.immunol.，179：4202-4211)，以及在wo 2018/222711中公开的可溶性lag-3蛋白。
[0512]
tim-3抑制剂包括但不限于靶向tim-3的抗体，例如f38-2e2(biolegend)，考伯利单抗(cobolimab)(tsr-022；tesaro)，ly3321367(eli lilly)，mbg453(novartis)以及如例如在wo 2013/006490、wo 2018/085469(例如，包含由根据seq id no：3和4的核酸序列编码的重链和轻链序列的抗体)、wo 2018/106588、wo 2018/106529(例如，包含根据seq id no：8至11的重链和轻链序列的抗体)中公开的抗体。
[0513]
tim-3配体抑制剂包括但不限于ceacam1抑制剂，例如抗ceacam1抗体cm10(ccam biotherapeutics；参见wo 2013/054331)，在wo 2015/075725中公开的抗体(例如cm-24、26h7、5f4、tec-11、12-140-4、4/3/17、col-4、f36-54、34b1、yg-c28f2、d14hd11、m8.7.7、d11-ad11、hea81、b 1.1、clb-gran-10、f34-187、t84.1、b6.2、b 1.13、yg-c94g7、12-140-5、scfv diathis 1、tet-2；ccam biotherapeutics)，watt et al.，2001(blood，98：1469-1479)和wo 2010/12557中所述的抗体，以及ptdser抑制剂，例如巴维昔单抗(bavituximab)(peregrine)。
[0514]
cd94/nkg2a抑制剂包括但不限于，莫那利珠单抗(monalizumab)(iph2201；innate pharma)以及如在us 9,422,368(例如，人源化z199；参见ep 2 628 753)、ep 3 193 929和wo2016/032334(例如，人源化z270；参见ep 2 628 753)中公开的抗体及其制备方法。
[0515]
ido抑制剂包括但不限于exiguamine a，epacadostat(incb024360；incyte；参见us 9,624,185)，indoximod(newlink genetics；cas#：110117-83-4)，nlg919(newlink genetics/genentech；cas#：1402836-58-1)，gdc-0919(newlink genetics/genentech；cas#：1402836-58-1)，f001287(flexus biosciences/bms；cas#：2221034-29-1)，khk2455
(cheong et al.，2018，expert opin ther pat.28(4)：317-330)，pf-06840003(参见wo 2016/181348)，navoximod(rg6078，gdc-0919，nlg919；cas#：1402837-78-8)，linrodostat(bms-986205；bristol-myers suibb；cas#：1923833-60-6)，小分子，例如1-甲基色氨酸、吡咯烷-2，5-二酮衍生物(参见wo 2015/173764)，以及sheridan，2015，nat biotechnol33：321-322公开的ido抑制剂。
[0516]
cd39抑制剂包括但不限于a001485(arcus biosciences)、psb 069(cas#：78510-31-3)和抗cd39单克隆抗体iph5201(innate pharma；参见perrot et al.，2019，cell reports 8：2411-2425.e9)。
[0517]
cd73抑制剂包括但不限于抗cd73抗体，例如cpi-006(corvus pharmaceuticals)、medi9447(medimmune；参见wo2016075099)，iph5301(innate pharma；参见perrot et al.，2019，cell reports 8：2411-2425.e9)，在wo2018/110555中所述的抗cd73抗体，小分子抑制剂pbs 12379(tocris bioscience；cas#：1802226-78-3)、a000830、a001190和a001421(arcusbiosciences，参见becker et al.，2018，cancer research 78(13 supplement)：3691-3691，doi：10.1158/1538-7445.am2018-3691)，cb-708(calithera biosciences)以及如allard et al.，2018(immunol rev.，276(1)：121-144)所述的基于嘌呤细胞毒性核苷类似物的二膦酸盐。
[0518]
a2ar抑制剂包括但不限于小分子抑制剂，例如istradefylline(kw-6002；cas#：155270-99-8)、pbf-509(palobiopharma)、ciforadenant(cpi-444：corvus pharma/genentech；cas#：1202402-40-1)、st1535([2丁基-9-甲基-8-(2h-1，2，3-三唑2-基)-9h-嘌呤-6-xylamine]；cas#：496955-42-1)、st4206(参见stasi et al.，2015，europ j phamm 761：353-361；cas#：1246018-36-9)、tozadenant(syn115；cas#：870070-55-6)、v81444(参见wo 2002/055082)、preladenant(sch420814；merck；cas#：377727-87-2)、vipadenant(biib014；cas#：442908-10-3)、st1535(cas#：496955-42-1)、sch412348(cas#：377727-26-9)、sch442416(axon 2283；axon medchem；cas#：316173-57-6)、zm241385(4-(2-(7-氨基-2-(2-呋喃基)-(1，2，4)三唑并(2，3-a)-(1，3，5)三嗪-5-基-氨基)乙基)酚；cas#：139180-30-6)、azd4635(astrazeneca)、ab928(双重a2ar/a2br小分子抑制剂；arcus biosciences)和sch58261(参见popoli et al.，2000，neuropsychopharm 22：522-529；cas#：160098-96-4)。
[0519]
a2br抑制剂包括但不限于ab928(双重a2ar/a2br小分子抑制剂；arcus biosciences)、mrs 1706(cas#：264622-53-9)、gs6201(cas#：752222-83-6)和pbs 1115(cas#：152529-79-8)。
[0520]
vista抑制剂包括但不限于抗vista和抗体，例如jnj-61610588(onvatilimab；janssen biotech)和小分子抑制剂ca-170(抗pd-l1/l2和抗vista小分子；cas#：1673534-76-3)。
[0521]
siglec抑制剂包括但不限于在us 2019/023786和wo 2018/027203中公开的抗sigle-7抗体(例如，包含根据seq id no：1的重链可变区和根据seq id no：15的轻链可变区)，抗siglec-2抗体奥英妥珠单抗(besponsa；参见us 8,153,768和us 9,642,918)，抗siglec-3抗体吉妥珠单抗奥唑米星(mylotarg；参见us 9,359,442)，或者在us 2019/062427、us 2019/023786、wo 2019/011855、wo 2019/011852(例如，包含根据seq id no：
171至176、或3和4、或5和6、或7和8、或9和10、或11和12、或13和14、或15和16、或17和18、或19和20、或21和22、或23和24、或25和26的cdr的抗体)、us 2017/306014和ep 3 146 979中公开的抗siglec-9抗体。
[0522]
cd20抑制剂包括但不限于抗cd20抗体，例如利妥昔单抗(rituxan；idec-102；idec-c2b8；参见us 5,843,439)、abp 798(利妥昔单抗生物仿制药)、奥法木单抗(2f2；参见wo2004/035607)、奥滨尤妥珠单抗、奥美珠单抗(2h7；参见2004/056312)、替伊莫单抗(zevalin)、托西莫单抗、ublituximab(lfb-r603；lfb biotechnologies)和us 2018/0036306中公开的抗体(例如，包含根据seq id no：1至3和4至6，或7和8，或9和10的轻链和重链的抗体)。
[0523]
garp抑制剂包括但不限于抗garp抗体，例如argx-115(argen-x)以及如us 2019/127483、us 2019/016811、us 2018/327511、us 2016/251438、ep 3 253 796中公开的抗体及其制备方法。
[0524]
cd47抑制剂包括但不限于抗cd47抗体，例如huf9-g4(stanford university/forty seven)，cc-90002/inbrx-103(celgene/inhibrx)，srf231(surface oncology)，ibi188(innovent biologics)，ao-176(arch oncology)，靶向cd47的双特异性抗体，包括tg-1801(ni-1701；靶向cd47和cd19的双特异性单克隆抗体；novimmune/tg therapeutics)和m-1801(靶向cd47和间皮素的双特异性单克隆抗体；novimmune)，以及cd47融合蛋白，例如alx148(alx oncology；参见kauder et al.，2019，plos one，doi：10.1371/journal.pone.0201832)。
[0525]
sirpα抑制剂包括但不限于抗sirpα抗体，例如ose-172(boehringer ingelheim/ose)、fsi-189(forty seven)、抗sirpα融合蛋白，例如tti-621和tti-662(trillium therapeutics；参见wo 2014/094122)。
[0526]
pvrig抑制剂包括但不限于抗pvrig抗体，例如com701(cgen-15029)以及如在例如wo 2018/033798(例如，cha.7.518.1h4(s241p)、cha.7.538.1.2.h4(s241p)、cpa.9.086h4(s241p)、cpa.9.083h4(s241p)、cha.9.547.7.h4(s241p)、cha.9.547.13.h4(s241p)，以及wo 2018/033798的包含根据seq id no：5的可变重结构域和根据seq id no：10的可变轻结构域的抗体，或者包含根据seq id no：9的重链和根据seq id no：14的轻链的抗体；wo 2018/033798还公开了抗tigit抗体以及抗tigit与抗pvrig抗体的组合治疗)、wo2016134333、wo2018017864(例如，包含与seq id no：11具有至少90％序列同一性的根据seq id no：5至7的重链和/或与seq id no：12具有至少90％序列同一性的根据seq id no：8至10的轻链的抗体，或者由seq id no：13和/或14或者seq id no：24和/或29编码的抗体，或者在wo 2018/017864中公开的其他抗体)中公开的抗体及其制造方法，以及如wo 2016/134335中公开的抗pvrig抗体和融合肽。
[0527]
csf1r抑制剂包括但不限于抗csf1r抗体卡比利珠单抗(cabiralizumab)(fpa008；fiveprime；参见wo 2011/140249、wo 2013/169264和wo 2014/036357)、imc-cs4(eiililly)、emactuzumab(r05509554；roche)、rg7155(wo 2011/70024、wo 2011/107553、wo 2011/131407、wo 2013/87699、wo 2013/119716、wo 2013/132044)以及小分子抑制剂blz945(cas#：953769-46-5)和pexidartinib(plx3397；selleckchem；cas#：1029044-16-3)。
[0528]
csf1抑制剂包括但不限于在ep 1 223 980和weir et al.，1996(j bone mineral res 11：1474-1481)、wo 2014/132072中公开的抗csf1抗体，以及在wo 2001/030381中公开的反义dna和rna。
[0529]
示例性的nox抑制剂包括但不限于nox1抑制剂，例如小分子ml171(gianni et al.，2010，acs chem biol 5(10)：981-93)、nos31(yamamoto et al.，2018，biol pharm bull.41(3)：419-426)，nox2抑制剂，例如小分子ceplene(二盐酸组胺；cas#：56-92-8)、bj-1301(gautam et al.，2017，mol cancer ther 16(10)：2144-2156；cas#：1287234-48-3)和lu et al.，2017，biochem pharmacol 143：25-38所述的抑制剂，nox4抑制剂，例如小分子抑制剂vas2870(et al.，2012，cell mol life sciences 69(14)：2327-2343)、二亚苯基碘(cas#：244-54-2)和gkt137831(cas#：1218942-37-0；参见tang et al.，2018，19(10)：578-585)。
[0530]
tdo抑制剂包括但不限于4-(吲哚-3-基)-吡唑衍生物(参见us 9,126,984和us 2016/0263087)，3-吲哚取代的衍生物(参见wo 2015/140717、wo 2017/025868、wo 2016/147144)，3-(吲哚-3-基)-吡啶衍生物(参见us 2015/0225367和wo 2015/121812)，双重ido/tdo拮抗剂，例如在wo 2015/150097、wo 2015/082499、wo 2016/026772、wo 2016/071283、wo 2016/071293、wo 2017/007700中公开的小分子双重ido/tdo抑制剂，以及小分子抑制剂cb548(kim，c，et al.，2018，annals oncol 29(suppl_8)：viii400-viii441)。
[0531]
根据本公开内容，免疫检查点抑制剂是抑制性检查点蛋白的抑制剂，但优选不是刺激性检查点蛋白的抑制剂。如本文中所述，许多ctla-4、pd-1、tigit、b7-h3、b7-h4、btla、kir、lag-3、tim-3、cd94/nkg2a、ido、a2ar、a2br、vista、siglec、cd20、cd39、cd73、garp、cd47、pvrig、csf1r、nox和tdo抑制剂以及相应配体的抑制剂是已知的，并且其中数种已经在临床试验中，或甚至已经被批准。基于这些已知的免疫检查点抑制剂，可开发替代的免疫检查点抑制剂。特别地，优选的免疫检查点蛋白的已知抑制剂可以其本身使用或可使用其类似物，特别是嵌合的、人源化的或人形式的抗体以及与本文中所述的任何抗体交叉竞争的抗体。
[0532]
本领域普通技术人员将理解，其他免疫检查点靶标也可被拮抗剂或抗体靶向，前提是这种靶向导致刺激免疫应答，例如抗肿瘤免疫应答，如反映在t细胞增殖的提高、t细胞活化的增强和/或细胞因子(例如，ifn-γ、il2)产生的提高。
[0533]
检查点抑制剂可以以任何方式以及通过本领域已知的任何途径施用。施用方式和途径将取决于待使用的检查点抑制剂的类型。
[0534]
检查点抑制剂可以以如本文中所述的任何合适的药物组合物的形式施用。
[0535]
检查点抑制剂可以以编码免疫检查点抑制剂(例如，抑制性核酸分子或者抗体或其片段)的核酸(例如dna或rna)分子的形式施用。例如，如本文中所述，抗体可在表达载体中递送编码。核酸分子可以其本身递送，例如以质粒或mrna分子的形式，或者与递送载剂复合，例如脂质体、脂质复合物或核酸脂质颗粒。检查点抑制剂也可通过包含编码检查点抑制剂的表达盒的溶瘤病毒施用。检查点抑制剂也可通过施用能够表达检查点抑制剂的内源性或同种异体细胞来施用，例如以基于细胞的治疗的形式。
[0536]
术语“基于细胞的治疗”是指将表达免疫检查点抑制剂的细胞(例如，t淋巴细胞、树突细胞或干细胞)移植到对象中以用于治疗疾病或病症(例如，癌症疾病)的目的。在一个
实施方案中，基于细胞的治疗包括经遗传改造细胞。在一个实施方案中，经遗传改造细胞表达免疫检查点抑制剂，例如本文中所述。在一个实施方案中，经遗传改造细胞表达免疫检查点抑制剂，所述免疫检查点抑制剂是抑制性核酸分子，例如sirna、shrna、寡核苷酸、反义dna或rna、适配体、抗体或其片段或者可溶性免疫检查点蛋白或融合物。经遗传改造细胞还可表达增强t细胞功能的另外的物质。这样的物质是本领域已知的。用于抑制免疫检查点信号转导的基于细胞的治疗公开于例如wo 2018/222711中，其通过引用整体并入本文。
[0537]
本文中使用的术语“溶瘤病毒”是指能够在体外或体内选择性地在癌细胞或过度增殖细胞中复制并减缓其生长或诱导其死亡，同时对正常细胞没有影响或影响很小的病毒。用于递送免疫检查点抑制剂的溶瘤病毒包含可编码免疫检查点抑制剂的表达盒，所述免疫检查点抑制剂是抑制性核酸分子，例如sirna、shrna、寡核苷酸、反义dna或rna、适配体、抗体或其片段或者可溶性免疫检查点蛋白或融合物。溶瘤病毒优选具有复制能力并且表达盒在病毒启动子(例如，合成的早期/晚期痘病毒启动子)的控制下。示例性溶瘤病毒包括水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，vsv)、弹状病毒(例如，小rna病毒，例如塞内加谷病毒(seneca valley virus)；svv-001)、柯萨奇病毒、细小病毒、新城疫病毒(newcastle disease virus，ndv)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，hsv；oncovex gmcsf)、逆转录病毒(例如流感病毒)、麻疹病毒、呼肠孤病毒、辛德比斯病毒(sinbis virus)、如wo 2017/209053中示例性描述的痘苗病毒(包括copenhagen、western reserve、wyeth毒株)和腺病毒(例如，δ-24、δ-24-rgd、icovir-5、icovir-7、onyx-015、coload1、h101、ad5/3-d24-gmcsf)。包含可溶形式的免疫检查点抑制剂的重组溶瘤病毒的产生及其使用方法公开于wo 2018/022831中，其通过引用整体并入本文。溶瘤病毒可用作减毒病毒。
[0538]
如本文中所述，在一个实施方案中，hpv e6疫苗rna和hpv e7疫苗rna与检查点抑制剂一起施用(即，共施用)于对象，例如患者。在某些实施方案中，检查点抑制剂和hpv e6疫苗rna/hpv e7疫苗rna作为单一组合物施用于对象。在某些实施方案中，检查点抑制剂和hpv e6疫苗rna/hpv e7疫苗rna同时(同时作为单独的组合物)施用于对象。在某些实施方案中，检查点抑制剂和hpv e6疫苗rna/hpv e7疫苗rna分别施用于对象。在某些实施方案中，检查点抑制剂在hpv e6疫苗rna/hpv e7疫苗rna之前施用于对象。在某些实施方案中，检查点抑制剂在hpv e6疫苗rna/hpv e7疫苗rna之后施用于对象。在某些实施方案中，检查点抑制剂和hpv e6疫苗rna/hpv e7疫苗rna在同一天施用于对象。在某些实施方案中，检查点抑制剂和hpv e6疫苗rna/hpv e7疫苗rna在不同的日期施用于对象。
[0539]
铂化合物
[0540]
本文中使用的术语“铂化合物”是指在其结构中包含铂的化合物，例如铂配合物。在一些实施方案中，该术语是指如在基于铂的化学治疗中使用的这样的化合物。在一些实施方案中，该术语包括化合物例如顺铂、卡铂(carboplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin)。在一些实施方案中，铂化合物是顺铂。
[0541]
术语“顺铂”或“顺铂(cisplatinum)”是指下式的化合物顺-二氯二氨合铂(ii)(cddp)：
[0542]
[0543]
术语“卡铂”是指下式的化合物顺-(1，1-环丁烷二羧酸根合)二氨合铂(ii)：
[0544][0545]
术语“奥沙利铂”是指这样的化合物，其是具有下式的与二氨基环己烷载体配体复合的铂化合物：
[0546][0547]
特别地，术语“奥沙利铂”是指化合物[(1r，2r)-环己烷-1，2-二胺](乙二酸根合-o，o’)铂(ii)。注射用奥沙利铂也以商品名eloxatine销售。
[0548]
a.盐和离子强度
[0549]
根据本公开内容，本文中所述的组合物可包含盐，例如氯化钠。不希望受到理论的束缚，氯化钠在与至少一种阳离子脂质混合之前，用作用于预处理rna的离子渗量浓度剂(ionic osmolality agent)。在本公开内容中，某些实施方案考虑了氯化钠的替代有机盐或无机盐。替代盐包括但不限于：氯化钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、乙酸钾、碳酸氢钾、硫酸钾、乙酸钾、磷酸二钠、磷酸二氢钠、乙酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠、乙酸钠、氯化锂、氯化镁、磷酸镁、氯化钙和乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，edta)钠盐。
[0550]
一般而言，包含本文中所述的rna脂质复合物颗粒的组合物包含浓度优选为0mm至约500mm、约5mm至约400mm或约10mm至约300mm的氯化钠。在一个实施方案中，包含rna脂质复合物颗粒的组合物包含对应于这样的氯化钠浓度的离子强度。
[0551]
b.稳定剂
[0552]
本文中所述的组合物可包含稳定剂以在冷冻、冻干、喷雾干燥或储存例如储存经冷冻、经冻干或经喷雾干燥的组合物期间避免产品品质的实质性损失，并且特别是避免rna活性的实质性损失。
[0553]
在一个实施方案中，稳定剂是碳水化合物。本文中使用的术语“碳水化合物”是指并且涵盖单糖、二糖、三糖、寡糖和多糖。
[0554]
在本公开内容的一些实施方案中，稳定剂为甘露糖、葡萄糖、蔗糖或海藻糖。
[0555]
根据本公开内容，本文中所述的rna脂质复合物颗粒组合物具有适合于组合物的稳定性，特别是rna脂质复合物颗粒的稳定性和rna的稳定性的稳定剂浓度。
[0556]
c.ph和缓冲剂
[0557]
根据本公开内容，本文中所述的rna脂质复合物颗粒组合物具有适合于rna脂质复合物颗粒的稳定性，并且特别是适合于rna的稳定性的ph。在一个实施方案中，本文中所述的rna脂质复合物颗粒组合物的ph为约5.5至约7.5。
[0558]
根据本公开内容，提供了包含缓冲剂的组合物。不希望受到理论的束缚，缓冲剂的使用在组合物的制造、储存和使用期间维持组合物的ph。在本公开内容的某些实施方案中，缓冲剂可以是碳酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、[三(羟甲基)甲基氨基]丙烷磺酸(taps)、2-(双(2-羟乙基)氨基)乙酸(bicine)、2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1，3-二醇(tris)、n-(2-羟基-1，1-双(羟甲基)乙基)甘氨酸(tricine)、3-[[1，3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]-2-羟基丙烷-1-磺酸(tapso)、2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙烷磺酸(hepes)、2-[[1，3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]乙烷磺酸(tes)、1，4-哌嗪二乙烷磺酸(pipes)、二甲基次胂酸、2-吗啉-4-基乙烷磺酸(mes)、3-吗啉-2-羟基丙烷磺酸(mopso)或磷酸缓冲盐水(pbs)。另一些合适的缓冲剂可以是乙酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐和磷酸盐。
[0559]
在一个实施方案中，缓冲剂是hepes。
[0560]
在一个实施方案中，缓冲剂的浓度为约2.5 mm至约15 mm。
[0561]
d.螯合剂
[0562]
本公开内容的某些实施方案考虑使用螯合剂。螯合剂是指能够与金属离子形成至少两个配位共价键从而产生稳定的水溶性络合物的化学化合物。不希望受到理论的束缚，螯合剂降低了游离二价离子的浓度，其在本公开内容中可另外地诱导加速的rna降解。合适的螯合剂的一些实例包括但不限于：乙二胺四乙酸(edta)、edta盐、去铁敏b(desferrioxamine b)、去铁胺(deferoxamine)、二硫代氨基甲酸钠(dithiocarb sodium)、青霉胺、戊酸钙、戊酸钠盐、琥巯酸(succimer)、曲恩汀(trientine)、氨三乙酸(nitrilotriacetic acid)、反式-二氨基环己烷四乙酸(dcta)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、双(氨基乙基)乙二醇醚-n，n，n’，n
’‑
四乙酸、亚氨基二乙酸、柠檬酸、酒石酸、富马酸，或其盐。在某些实施方案中，螯合剂是edta或edta盐。在一个示例性实施方案中，螯合剂是edta二水合二钠。
[0563]
在一些实施方案中，edta的浓度为约0.05mm至约5mm。
[0564]
e.本公开内容的组合物的物理状态
[0565]
在一些实施方案中，本公开内容的组合物是液体或固体。固体的一些非限制性实例包括冷冻形式或经冻干的形式。在一个优选实施方案中，组合物是液体。
[0566]
本公开内容的药物组合物
[0567]
本文中所述的药剂，例如配制为rna脂质复合物颗粒的例如本文中所述的rna可用作用于治疗性或预防性治疗的药物组合物或药物或者用于制备这样的药物组合物或药物。
[0568]
本公开内容的组合物可以以任何合适的药物组合物的形式施用。
[0569]
术语“药物组合物”涉及包含治疗有效剂，优选与可药用的载体、稀释剂和/或赋形剂一起的治疗有效剂的制剂。通过将所述药物组合物施用于对象，所述药物组合物可用于治疗、预防或减轻疾病或病症的严重程度。药物组合物在本领域中也称为药物制剂。在本公开内容的上下文中，药物组合物包含本文中所述的例如配制为rna脂质复合物颗粒的rna。
[0570]
本公开内容的药物组合物优选地包含一种或更多种佐剂或者可与一种或更多种佐剂一起施用。术语“佐剂”涉及延长、增强或加速免疫应答的化合物。佐剂包含化合物例如油乳剂(例如，弗氏佐剂(freund’s adjuvant))、矿物质化合物(例如明矾)、细菌产品(例如百日咳鲍特菌(bordetella pertussis)毒素)或免疫刺激复合物的非均质组。佐剂的一些
实例包括但不限于：lps、gp96、cpg寡脱氧核苷酸、生长因子和细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白介素、趋化因子。趋化因子可以是il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-12、infa、inf-γ、gm-csf、lt-a。另一些已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂或油类，例如isa51。用于本公开内容的另一些合适的佐剂包括脂肽，例如pam3cys。
[0571]
根据本公开内容的药物组合物通常以“药学有效量”和以“可药用制剂”施加。
[0572]
术语“可药用的”是指不与药物组合物的活性组分的作用相互作用的物质的无毒性。
[0573]
术语“药学有效量”是指单独或与另外的剂量一起实现期望的反应或期望的作用的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选地涉及对疾病进程的抑制。这包括减慢疾病的进展，并且特别是中断或逆转疾病的进展。疾病治疗中的期望反应还可以是对所述疾病或所述病症的发作的延迟或发作的预防。本文中所述组合物的有效量将取决于：待治疗病症，疾病的严重程度，患者的个体参数，包括年龄、生理状况、大小和体重，治疗的持续时间，伴随治疗(如果有的话)的类型，具体施用途径和类似因素。因此，本文中所述组合物的施用剂量可取决于多种这样的参数。在初始剂量下患者中的反应不充分的情况下，可使用更高剂量(或通过不同的更局部的施用途径来实现有效地更高剂量)。
[0574]
在一些实施方案中，有效量包含足以引起肿瘤/病变缩小的量。在一些实施方案中，有效量是足以降低肿瘤生长速率(例如抑制肿瘤生长)的量。在一些实施方案中，有效量是足以延迟肿瘤发展的量。在一些实施方案中，有效量是足以预防或延迟肿瘤复发的量。在一些实施方案中，有效量是足以提高对象对肿瘤的免疫应答的量，使得降低、延迟、改善和/或预防肿瘤生长和/或尺寸和/或转移。有效量可以以一次或更多次施用来施用。在一些实施方案中，有效量(例如，包含mrna的组合物)的施用可：(i)降低癌细胞数目；(ii)降低肿瘤尺寸；(iii)在一定程度上抑制、延缓、减慢并且可阻止癌细胞浸润到外周器官中；(iv)抑制(例如，在一定程度上减慢和/或阻断或防止)转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上减轻与癌症相关的一种或更多种症状。
[0575]
本公开内容的药物组合物可包含盐、缓冲剂、防腐剂和任选地其他治疗剂。在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含一种或更多种可药用的载体、稀释剂和/或赋形剂。
[0576]
用于本公开内容的药物组合物中的合适的防腐剂包括但不限于：苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
[0577]
本文中使用的术语“赋形剂”是指可存在于本公开内容的药物组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的一些实例包括但不限于：载体、黏合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。
[0578]
术语“稀释剂”涉及稀释剂(diluting agent)和/或稀化剂(thinning agent)。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体混悬剂和/或混合介质中的任一种或更多种。合适的稀释剂的一些实例包括乙醇、甘油和水。
[0579]
术语“载体”是指可以是天然的、合成的、有机的、无机的组分，在其中将活性组分组合以促进、增强或实现药物组合物的施用。本文中使用的载体可以是适合于施用于对象的一种或更多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。合适的载体包括但不限于：
无菌水、林格液(ringer)、乳酸林格液、无菌氯化钠溶液、等张盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘并且特别是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含等张盐水。
[0580]
用于治疗性用途的可药用的载体、赋形剂或稀释剂在药学领域中是公知的，并且描述于例如remington’s pharmaceutical sciences，mack publishing co.(a.r gennaro编辑.1985)中。
[0581]
可根据预期的施用途径和标准药物实践来选择药用载体、赋形剂或稀释剂。
[0582]
本公开内容的药物组合物的施用途径
[0583]
在一个实施方案中，本文中所述的药物组合物可静脉内、动脉内、皮下、皮内、结节内或肌内施用。在某些实施方案中，将药物组合物配制成用于局部施用或全身性施用。全身性施用可包括涉及通过胃肠道吸收的肠施用，或肠胃外施用。本文中使用的“肠胃外施用”是指以除通过胃肠道之外的任何方式施用，例如通过静脉内注射。在一个优选实施方案中，将药物组合物配制成用于全身性施用。在另一个优选实施方案中，全身性施用通过静脉内施用。
[0584]
本公开内容的药物组合物的用途
[0585]
本文中所述的药剂，例如配制为rna脂质复合物颗粒的例如本文中所述的rna可用于hpv阳性癌症的治疗性或预防性治疗中。
[0586]
术语“疾病”是指影响个体身体的异常状况。疾病通常被解释为与特定症状和体征相关的医学病症。疾病可由最初来自外部来源的因素引起，例如感染性疾病，或者疾病可由内部功能障碍引起，例如自身免疫病。在人中，“疾病”通常被更广泛地用于指引起以下的任何病症：痛苦、功能障碍、困扰、社会问题、或所折磨个体的死亡、或与接触个体的那些类似的问题。从广义上讲，疾病有时包括损伤、残疾、病症、综合征、感染、孤立的症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化，而在另一些背景下和出于其他目的，这些可被视为可区分的类别。疾病通常不仅在身体上影响个体而且在情感上影响个体，因为感染多种疾病和在有多种疾病的情况下生活可改变人对生活的看法和人的性格。
[0587]
在本发明背景中，术语“治疗”及其变化形式或“治疗性干预”涉及出于对抗病症例如疾病或障碍目的的对对象的管理和护理。该术语旨在包括针对对象所遭受的给定病症的全谱治疗，例如施用治疗有效的化合物以减轻症状或并发症，延缓疾病、障碍或病症的进展，缓解或减轻症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、障碍或病症以及预防病症，其中预防应理解为出于对抗疾病、病症或障碍目的的对个体的管理和护理，并且包括施用活性化合物以预防症状或并发症的发作。
[0588]
术语“治疗性治疗”涉及改善健康状况和/或延长(提高)个体寿命的任何治疗。所述治疗可在个体中消除疾病，在个体中阻止或减慢疾病的发展，在个体中抑制或减慢疾病的发展，在个体中降低症状的频率或严重程度，和/或在当前患有或以前患有疾病的个体中降低复发。
[0589]
术语“预防性治疗”或“防止性治疗”涉及旨在在个体中防止疾病发生的任何治疗。术语“预防性治疗”或“防止性治疗”在本文中可互换使用。
[0590]
术语“个体”和“对象”在本文中可互换使用。它们是指可受疾病或病症(例如癌症)折磨或易于患有疾病或病症(例如癌症)但是可患有或可未患有疾病或病症的人或其他哺
乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类)。在许多实施方案中，个体是人。除非另有说明，否则术语“个体”和“对象”不表示特定年龄，并因此涵盖成年人、老年人、儿童和新生儿。在本公开内容的一些实施方案中，“个体”或“对象”是“患者”。
[0591]
术语“患者”意指治疗的个体或对象，特别是患病的个体或对象。
[0592]
在本公开内容的一个实施方案中，目的是提供针对表达一种或更多种hpv抗原、特别是hpv e6和/或hpv e7的癌细胞的免疫应答，并且治疗涉及表达一种或更多种hpv抗原的细胞的癌症疾病。在一个实施方案中，癌症是hpv阳性癌症。在一个实施方案中，癌症是肛门生殖器癌、宫颈癌和阴茎癌、或者头颈区域中的癌症，例如生殖器区域中的癌症或头颈区域中的癌症。在一个实施方案中，癌症是头颈鳞状细胞癌(hnscc)。
[0593]
可向对象施用包含rna的药物组合物以在所述对象中引发针对由所述rna编码的一种或更多种抗原或者一种或更多种表位的免疫应答，其可以是治疗性的或者部分或完全保护性的。本领域技术人员将知道免疫治疗和疫苗接种的原理之一是基于以下事实：通过用抗原或表位对对象进行免疫接种来产生针对疾病的免疫保护性反应，所述抗原或表位在免疫学上与待治疗的疾病相关。因此，本文中所述的药物组合物可应用于诱导或增强免疫应答。因此，本文中所述的药物组合物可用于涉及抗原或表位的疾病(特别是hpv阳性癌症)的预防性和/或治疗性治疗中。
[0594]
本文中使用的“免疫应答”是指对抗原或表达抗原的细胞的整合的身体应答，并且是指细胞免疫应答和/或体液免疫应答。细胞免疫应答包括但不限于针对表达抗原并且以用i类或ii类mhc分子呈递抗原为特征的细胞的细胞应答。细胞应答与t淋巴细胞有关，t淋巴细胞可归类为辅助t细胞(也称为cd4+t细胞)，它们通过调节免疫应答或杀伤细胞(也称为细胞毒性t细胞，cd8
+
t细胞或ctl)发挥中心作用，在感染的细胞或癌细胞中诱导凋亡。在一个实施方案中，施用本公开内容的药物组合物涉及刺激针对表达一种或更多种肿瘤抗原的癌细胞的抗肿瘤cd8
+
t细胞应答。在一个具体实施方案中，肿瘤抗原与i类mhc分子一起呈递。
[0595]
本公开内容考虑了可以是保护性、防止性、预防性和/或治疗性的免疫应答。本文中使用的“诱导免疫应答”可指示在诱导之前不存在针对特定抗原的免疫应答，或者其可指示在诱导之前存在针对特定抗原的基础水平的免疫应答，其在诱导之后增强。因此，“诱导免疫应答”包括“增强免疫应答”。
[0596]
术语“免疫治疗”涉及通过诱导或增强免疫应答来治疗疾病或病症。术语“免疫治疗”包括抗原免疫接种或抗原疫苗接种。
[0597]
术语“免疫接种”或“疫苗接种”描述了以诱导免疫应答为目的例如出于治疗性或预防性的原因而向个体施用抗原的过程。
[0598]
在一个实施方案中，本公开内容考虑了这样的实施方案：其中施用靶向脾组织的如本文中所述的rna脂质复合物颗粒。rna编码包含例如本文中所述的抗原或表位的肽或蛋白质。rna被脾中的抗原呈递细胞(例如树突细胞)摄取，以表达肽或蛋白质。在抗原呈递细胞进行任选的加工和呈递之后，可产生针对抗原或表位的免疫应答，从而导致对涉及抗原或表位的疾病的预防性和/或治疗性治疗。在一个实施方案中，由本文中所述的rna脂质复合物颗粒诱导的免疫应答包括抗原呈递细胞例如树突细胞和/或巨噬细胞对抗原或其片段例如表位的呈递，以及由于该呈递而引起的细胞毒性t细胞的活化。例如，由rna编码的肽或
ii类分子复合物相互作用，则抗原呈递细胞产生诱导t细胞活化的共刺激分子。专职抗原呈递细胞包括树突细胞和巨噬细胞。
[0606]
术语“非专职抗原呈递细胞”是指不组成性表达mhc ii类分子，但在受到某些细胞因子例如干扰素-γ刺激之后组成性表达mhc ii类分子的抗原呈递细胞。一些示例性的非专职抗原呈递细胞包括成纤维细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、胶质细胞、胰腺β细胞或血管内皮细胞。
[0607]“抗原加工”是指抗原降解为加工产物，其为所述抗原的片段(例如，蛋白质降解为肽)，并且是指这些片段中的一个或更多个(例如，通过结合)与mhc分子的缔合，用于通过细胞例如抗原呈递细胞呈递至特定的t细胞。
[0608]
术语“涉及抗原的疾病”或“涉及表位的疾病”是指牵涉抗原或表位的任何疾病，例如以抗原或表位的存在为特征的疾病。涉及抗原或表位的疾病可以是癌症疾病或仅是癌症。如上所述，抗原可以是疾病相关抗原，例如肿瘤相关抗原，并且表位可来源于这样的抗原。
[0609]
术语“癌症疾病”或“癌症”是指或描述个体中通常以失调的细胞生长为特征的生理状况。癌症的一些实例包括但不限于：癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更特别地，这样的癌症的一些实例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌、霍奇金病(hodgkin
′
s disease)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(central nervous system，cns)赘生物、神经外胚层癌症、脊椎轴肿瘤(spinal axis tumor)、胶质瘤、脑脊膜瘤和垂体腺瘤。可通过本文中所述的组合物和方法治疗的一种特定形式的癌症是hpv阳性癌症。根据本公开内容的术语“癌症”还包括癌症转移。
[0610]
由于产生的协同作用，在癌症治疗中的组合策略可以是期望的，它可比单一治疗方法的影响要强得多。在一个实施方案中，药物组合物与免疫治疗剂一起施用。本文中使用的“免疫治疗剂”涉及可参与激活特异性免疫应答和/或免疫效应物功能的任何试剂。本公开内容考虑了抗体作为免疫治疗剂的用途。不希望受到理论的束缚，抗体能够通过多种机制来实现针对癌细胞的治疗性作用，包括诱导凋亡、阻断信号转导途径的组分或抑制肿瘤细胞的增殖。在某些实施方案中，抗体是单克隆抗体。单克隆抗体可通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell mediated cytotoxicity，adcc)来诱导细胞死亡，或结合补体蛋白，导致直接的细胞毒性，称为补体依赖性细胞毒性(complement dependent cytotoxicity，cdc)。可与本公开内容组合使用的抗癌抗体和潜在抗体靶标(在括号里)的一些非限制性实例包括：阿巴伏单抗(ca-125)、阿昔单抗(cd41)、阿达木单抗(epcam)、阿夫土珠单抗(afutuzumab)(cd20)、培化阿珠单抗(alacizumab pegol)(vegfr2)、喷替酸阿妥莫单抗(cea)、阿麦妥昔单抗(amatuximab)(morab-009)、马安那莫单抗(tag-72)、阿泊珠单抗(hla-dr)、阿昔莫单抗(cea)、阿特珠单抗(atezolizumab)(pd-l1)、巴维昔单抗(磷脂酰丝氨酸)、贝妥莫单抗(cd22)、贝利木单抗(baff)、贝伐珠单抗(vegf-a)、莫比伐单抗(bivatuzumab mertansine)(cd44 v6)、博纳吐单抗(blinatumomab)(cd 19)、布妥昔单抗(cd30 tnfrsf8)、莫坎妥珠单抗(黏蛋白canag)、雷坎妥珠单抗(muc1)、卡罗单抗喷地肽(前列腺癌细胞)、卡鲁单抗(carlumab)(cnt0888)、卡妥索单抗
(epcam、cd3)、西妥昔单抗(egfr)、泊西他珠单抗(citatuzumab bogatox)(epcam)、西妥木单抗(igf-1受体)、克劳西单抗(claudiximab)(密蛋白)、替坦司可利妥珠单抗(clivatuzumab tetraxetan)(muc1)、西他土珠单抗(trail-r2)、达西珠单抗(cd40)、达罗土珠单抗(dalotuzumab)(胰岛素样生长因子i受体)、地诺单抗(rankl)、地莫单抗(b-淋巴瘤细胞)、多兹图单抗(drozitumab)(dr5)、依美昔单抗(gd3神经节苷脂)、依决洛单抗(epcam)、埃罗妥珠单抗(slamf7)、依那妥珠单抗(pdl192)、恩司昔单抗(ensituximab)(npc-1c)、依帕珠单抗(cd22)、厄妥索单抗(her2/neu、cd3)、伊瑞西珠单抗(整合素ανβ3)、法勒珠单抗(farletuzumab)(叶酸受体1)、fbta05(cd20)、芬克拉妥珠单抗(ficlatuzumab)(sch 900105)、芬妥木单抗(figitumumab)(igf-1受体)、弗拉伏妥单抗(flanvotumab)(糖蛋白75)、夫苏木单抗(fresolimumab)(tgf-β)、加利昔单抗(galiximab)(cd80)、盖尼塔单抗(igf-i)、吉妥单抗奥唑米星(cd33)、吉伏珠单抗(gevokizumab)(il-iβ)、吉瑞妥昔单抗(girentuximab)(碳酸酐酶9(ca-ix))、格莱木单抗-维多汀(glembatumumab vedotin)(gpnmb)、替伊莫单抗(cd20)、依库单抗(icrucumab)(vegfr-1)、伊戈伏单抗(ca-125)、依坦希单抗(indatuximab ravtansine)(sdc1)、英妥木单抗(intetumumab)(cd51)、奥英妥珠单抗(cd22)、伊匹单抗(cd 152)、伊妥木单抗(iratumumab)(cd30)、拉贝珠单抗(cea)、来沙木单抗(trail-r2)、利韦单抗(乙型肝炎表面抗原)、林妥珠单抗(cd33)、洛妥珠单抗(lorvotuzumab mertansine)(cd56)、鲁卡木单抗(cd40)、鲁昔单抗(cd23)、马帕木单抗(trail-r1)、马妥珠单抗(egfr)、美泊利单抗(il-5)、米拉珠单抗(milatuzumab)(cd74)、米妥莫单抗(gd3神经节苷脂)、莫加珠单抗(mogamulizumab)(ccr4)、莫妥莫单抗(moxetumomab pasudotox)(cd22)、他那可单抗(c242抗原)、他那莫单抗(5t4)、纳那妥单抗(namatumab)(ron)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)(egfr)、尼妥珠单抗(egfr)、纳武单抗(igg4)、奥法木单抗(cd20)、奥拉单抗(olaratumab)(pdgf-ra)、奥纳珠单抗(onartuzumab)(人分散因子受体激酶)、莫奥珠单抗(oportuzumab monatox)(epcam)、奥戈伏单抗(ca-125)、欧西鲁单抗(oxelumab)(ox-40)、帕尼单抗(egfr)、帕曲妥单抗(patritumab)(her3)、培妥莫单抗(pemtumomab)(muc1)、帕妥珠单抗(her2/neu)、平妥单抗(腺癌抗原)、普托木单抗(波形蛋白)、雷妥莫单抗(racotumomab)(n-羟乙酰神经氨酸)、雷德图单抗(radretumab)(纤连蛋白额外结构域-b)、雷韦单抗(狂犬病病毒糖蛋白)、雷莫芦单抗(vegfr2)、利妥木单抗(rilotumumab)(hgf)、利妥昔单抗(cd20)、罗妥木单抗(robatumumab)(igf-1受体)、沙玛立珠单抗(samalizumab)(cd200)、西罗珠单抗(fap)、司妥昔单抗(il-6)、他贝鲁单抗(tabalumab)(baff)、他珠单抗(甲胎蛋白)、帕他普莫单抗(cd 19)、替妥莫单抗(tenatumomab)(生腱蛋白c)、替妥木单抗(teprotumumab)(cd221)、西木单抗(ctla-4)、替加珠单抗(trail-r2)、tnx-650(il-13)、托西莫单抗(cd20)、曲妥珠单抗(her2/neu)、trbs07(gd2)、替西木单抗(ctla-4)、西莫白介素图考珠单抗(tucotuzumab celmoleukin)(epcam)、优利妥昔单抗(ublituximab)(ms4a1)、乌瑞鲁单抗(urelumab)(4-1 bb)、伏洛昔单抗(整合素α5β1)、伏妥莫单抗(肿瘤抗原ctaa 16.88)、扎妥木单抗(egfr)和扎木单抗(cd4)。
[0611]
在一个实施方案中，免疫治疗剂是pd-1轴结合拮抗剂。pd-1轴结合拮抗剂包括但不限于：pd-1结合拮抗剂、pd-l1结合拮抗剂和pd-l2结合拮抗剂。“pd-1”的替代名称包括cd279和sleb2。“pd-l1”的替代名称包括b7-h1、b7-4、cd274和b7-h。“pd-l2”的替代名称包
括b7-dc、btdc和cd273。在一些实施方案中，pd-1结合拮抗剂是抑制pd-1与其配体结合伴侣结合的分子。在一个具体方面中，pd-1配体结合伴侣是pd-l1和/或pd-l2。在另一个实施方案中，pd-l1结合拮抗剂是抑制pd-l1与其结合伴侣结合的分子。在一个具体实施方案中，pd-l1结合伴侣是pd-1和/或b7-1。在另一个实施方案中，pd-l2结合拮抗剂是抑制pd-l2与其结合伴侣结合的分子。在一个具体实施方案中，pd-l2结合伴侣是pd-1。pd-1结合拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。在一些实施方案中，pd-1结合拮抗剂是抗pd-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。抗pd-1抗体的一些实例包括但不限于mdx-1106(纳武单抗，opdivo)、merck 3475(mk-3475，派姆单抗，keytruda)、medi-0680(amp-514)、pdr001、regn2810、bgb-108和bgb-a317。
[0612]
在一个实施方案中，pd-1结合拮抗剂是免疫黏附素，其包含与恒定区融合的pd-l1或pd-l2的胞外或pd-1结合部分。在一个实施方案中，pd-1结合拮抗剂是amp-224(也称为b7-dcig，是pd-l2-fc)，其是wo2010/027827和wo2011/066342中所述的融合可溶性受体。
[0613]
在一个实施方案中，pd-1结合拮抗剂是抗pd-l1抗体，包括但不限于yw243.55.s70、mpdl3280a(阿特珠单抗)、medi4736(度伐单抗)、mdx-1105和msb0010718c(阿维单抗)。
[0614]
在一个实施方案中，免疫治疗剂是pd-1结合拮抗剂。在另一个实施方案中，pd-1结合拮抗剂是抗pd-l1抗体。在一个示例性实施方案中，抗pd-l1抗体是阿特珠单抗。
[0615]
本文中所引用的文件和研究的引证并不旨在承认任何前述内容是相关的现有技术。关于这些文件内容的所有陈述都是基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文件内容正确性的任何承认。
[0616]
呈现以下描述以使本领域普通技术人员能够制造和使用多个实施方案。对特定装置、技术和应用的描述仅作为实例提供。对本文中所述的实施例的多种修改对于本领域普通技术人员而言将是明显的，并且在不脱离多个实施方案的精神和范围的情况下，本文中定义的一般原理可应用于另一些实施例和应用。因此，多个实施方案不旨在限于本文中描述和示出的实施例，而是与符合权利要求书的范围相一致。
实施例
[0617]
实施例1至4的材料和方法
[0618]
小鼠
[0619]
从cnrs奥尔良获得人源化的hla转基因c57bl/6 a2dr1胚胎并在内部繁育。野生型c57bl/6小鼠购自charles river和envigo。在所有实验中，均使用年龄匹配的(6至12周)雌性动物。程序和实验组规模由动物福利监管机构批准。所有小鼠均根据联邦和州的动物研究政策保持在美因茨大学(university of mainz)和biontech ag。
[0620]
肿瘤细胞系
[0621]
来源于通过用hpv16 e6/e7进行永生化和逆转录病毒转导的原代肺细胞的c57bl/6 tc-1肿瘤细胞系(lin，k.y.et al.，cancer res.56，21-26(1996))与来自t.-c.wu(约翰霍普金斯大学(johns hopkins university))的萤光素酶转染的变体tc-1 luc一起获得。通过将具有完全hpv16基因组的c57bl/6小鼠胚胎细胞永生化并转染而产生的c57bl/6 c3肿瘤细胞系(feltkamp，m.c.w.et al.，eur.j.immunol.23，2242-2249(1993))是来自
s.h.van der burg(荷兰莱顿大学医学中心(leiden university medical center，the netherlands))的惠赠。细胞的重新认证以及主细胞库和工作细胞库的产生在收到之后立即进行。将第三至第九代的细胞用于肿瘤实验。
[0622]
rna构建体和体外转录
[0623]
用于体外转录编码抗原的rna的质粒模板是基于pst1-a120和pst1-mitd载体的(holtkamp，s.et al.，blood 108，4009-4017(2006))，所述载体的特征在于具有针对稳定性和蛋白质翻译经药理学优化的5’utr和3’utr以及poly(a)尾。pst1-mitd特征在于具有用于送(routing)至内质网和主要组织相容性复合体(mhc)i类跨膜和胞质结构域的信号序列，以用于改善mhc i类和ii类表位的呈递。pst1-egfp-a120(egfp)、pst1-ova-mitd(ova
257-264
)和pst1-e7-mitd载体先前已有描述(holtkamp，s.et al.，blood 108，4009-4017(2006)；kreiter，s.et al.，j.immunol.180，309-318(2007)；kranz，l.m.et al.，nature 534，396-401(2016)；kuhn，a.n.et al.，gene ther.17，961-71(2010))。pst1-ova-mitd编码h-2kb限制性免疫显性表位ova
257-264
。pst1-e7-mitd编码hpv16全长e7蛋白，以及pst1-e6-mitd编码hpv16全长e6蛋白。通过将靶序列克隆到pst1-mitd载体中来产生用于mrna体外转录的模板。体外转录和加帽β-s抗-反向帽类似物(anti-reverse cap analog，arca)(kuhn，a.n.et al.，gene ther.17，961-71(2010))如先前(holtkamp，s.et al.，blood 108，4009-4017(2006))所述进行。
[0624]
脂质体、rna-lpx制备和免疫接种
[0625]
将由阳离子脂质dotma和辅助脂质dope构成的具有阳离子净电荷的脂质体用于复合rna以形成rna-lpx。如先前所述进行脂质体制备和lpx形成(kranz，l.m.et al.，nature 534，396-401(2016))。简言之，将rna以1mg ml-1
的rna浓度储存在hepes缓冲溶液中。通过以下制备rna-lpx：将rna用h2o和1.5 m nacl溶液稀释，随后添加适当量的脂质体分散体以在150mm的最终nacl浓度下实现(+)：(-)1.3∶2的电荷比。在指定的电荷比下，rna-lpx制剂(e7、egfp和ova
257-264
rna-lpx)的颗粒尺寸为200至250nm，多分散性指数为约0.25，并且ζ电位(mv)为-20至30mv(实施例2至4)。如果没有另外提及，则用40μg rna-lpx免疫接种小鼠。对照小鼠接受编码无关蛋白的rna-lpx(egfp或ova
257-264
)或nacl。疫苗接种方案中的箭头指示免疫接种。
[0626]
肿瘤模型和处理
[0627]
对于治疗性肿瘤实验，对c57bl/6小鼠s.c.注射1
×
105个tc-1肿瘤细胞或5
×
105个c3肿瘤细胞。每三至四天用卡尺非盲地测量肿瘤尺寸以用于使用等式(a2×
b)/2(a，宽度；b，长度)计算肿瘤体积。对于原位肿瘤实验，将5
×
104个tc-1 luc肿瘤细胞接种到舌的黏膜下层。在一些实验中，每三至四天腹膜内施用200μg的pd-l1抗体(10f.9g2，bioxcell)或igg2b同种型对照(lf-2，bioxcell)。当达到预定的终点时将动物安乐死。
[0628]
生物发光成像
[0629]
使用xenogen ivis谱成像系统(perkin elmer，waltham，ma，usa)通过体内生物发光成像来评价原位tc-1 luc肿瘤生长。腹膜内注射l-萤光素水溶液(1.3mg/小鼠；bd biosciences)。在萤光素施用之后5分钟量化来自活动物的发射光子。使用ivis living image 4.0软件将目的区域(regions of interest，roi)量化为平均辐射度(光子秒-1
cm-2 sr-1
)。
[0630]
组织制备
[0631]
为了产生单细胞悬液，将肿瘤切除，切成片，并随后在包含pbs中的5μg/ml胶原酶(roche diagnostics)、500单位透明质酸酶(sigma-aldrich)和50μg/ml dna酶i(roche diagnostics)的消化缓冲液中在37℃下孵育15分钟。使用注射器的柱塞末端使肿瘤样品强制通过70μm细胞过滤器(bd falcon)，同时用pbs冲洗。将细胞在460g下离心6分钟并重悬于新鲜pbs中。将红细胞用低张电解质溶液裂解5分钟。类似地，使脾强制通过70μm细胞过滤器同时用pbs冲洗，并将红细胞用低张电解质溶液裂解。从眶窦收集外周血(50μl)以获得用于facs染色的pbmc。
[0632]
ifnγ elispot
[0633]
进行酶联免疫斑点测定(enzyme-linked immunospot assay，elispot)以检测抗原相遇时t细胞ifnγ释放。简言之，分离来自a2dr1小鼠的脾，产生单细胞悬液，并将5
×
105个脾细胞用包含e6、e7或对照蛋白(人疱疹病毒5型(human herpesvirus type 5，hhv5)蛋白pp65)的2μg/ml重叠肽合并物的培养基再刺激、在37℃下过夜。将所有样品一式三份地进行测试。使e6、e7和pp65的重叠肽合并物横跨完整的蛋白质序列(具有11个氨基酸(aa)重叠的15聚体)，并从jpt peptide technologies获得。
[0634]
流式细胞术
[0635]
对全血、肿瘤和脾单细胞悬液进行流式细胞术染色。用于胞外染色的单克隆抗体包括cd45、cd8αcd4、cd44、cd86、pd-1、nk1.1、cd11b、pd-l1、i-a/i-e(bd pharmingen)、cd3、f4/80、gr-1、(biolegend)、cd25和(ebioscience)。对于胞内染色，使用针对ifnγ、ki-67(ebioscience)、tnfα、foxp3(bd pharmingen)、颗粒酶b、inos(invitrogen)和cd206(biolegend)的抗体。如下进行流式细胞术染色：用生存力染料(ebioscience)根据制造商的说明对活细胞进行染色。将e7特异性cd8
+
t细胞用e7
49-57 h2-db限制性dextramer(immudex)在4℃下在黑暗中染色10分钟。将胞外靶标在4℃下在黑暗中染色30分钟。包含5％fcs和5mm edta的pbs用作洗涤和染色缓冲液。根据制造商的说明，对于ifnγ、tnfα和颗粒酶b的染色，用cytofix/cytoperm(bd pharmingen)将样品固定并透化，而对于inos、cd206、ki67和foxp3染色，使用foxp3固定试剂盒(ebioscience)将样品固定并透化。用mhc dextramer对全血进行染色，随后使用bd facs裂解液(bd pharmingen)裂解红细胞。通过对可生存细胞和单峰(singlet)进行预设门来限定免疫细胞群，并确定如下：nk细胞(cd45
+
cd3-nk1.1
+
)、cd8
+
t细胞(cd45
+
cd8
+
)、e7
49-57
特异性cd8
+
t细胞(cd45
+
cd8
+
e7
49-57
多聚体
+
)、cd4
+
t细胞(cd45
+
cd4
+
)、treg(cd45
+
cd4
+
foxp3
+
cd25
+
)、肿瘤相关巨噬细胞(cd45
+
cd 11b
+
f4/80
+
)。在facs canto ii或lsr fortessa流式细胞仪(二者都是bd biosciences，franklin lakes，usa)上获取流式细胞术数据，并用flowjo 7.6.5或flowjo 10.4软件(tree star)进行分析。
[0636]
fluidigm qpcr表达分析
[0637]
使用tissue lyser ii(quiagen)从冷冻保存的肿瘤中提取总rna。使用rneasy mini旋转柱在qiacube上进行初始rna净化之后，通过经典的苯酚/氯仿提取来分离rna。使用takara primescript
tm rt试剂盒(perfect real time)将rna逆转录成cdna。使用基因表达测定(pn 100-2594 a2)按照advanced development protocol 28-快速基因表达分析使cdna经历fluidigm biomark hd系统。检测6-羧基荧光
素信号、线性基线校正和自动ct阈值方法用于ct值确定。为了进行数据分析，使用内部开发的r软件包“qpcrpanel”。读取原始ct值，并将未检出的ct设置为所有ct的0.975分位数。如(pfaffl，m.w.，nucleic acids res.29，45e-45(2001))所述计算δδct值。次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase，hprt)用作参照基因以计算各数据点的δct(δct
i，j
＝ct
i，j-ct
hprt，j
)，其中i为基因并且j为样品指数。用各基因的对照样品的平均值(χ)的δct值与hprt中对照样品的平均值来校准δct
i，j
(δct
i，校准
＝χct
i，对照-χct
hprt，对照
)。假设引物效率相等并定义为δδct＝2-(-δct
i，j-δct
i，校准
)。绘制δδct值的log2倍数变化中的差异以生成热图(graphpad prism 7)。
[0638]
下一代测序(next generation sequencing，ngs)和基因表达分析
[0639]
将冷冻保存的tc-1肿瘤(液氮)用tissue lyser ii(quiagen)干燥均质化以用于rna提取。使用rneasy mini旋转柱在qiacube上进行净化过程之后，通过经典的苯酚/氯仿提取来分离rna。使用takara primescript
tm rt试剂盒(perfect real time)将rna逆转录成cdna。由castle和同事详细描述了ngs的程序(castle，j.c.et al.，bmc genomics 15，190(2014))。应用star算法(版本2.4.2)将rna-seq读段映射至小鼠基因组(dobin a et al.，bioinformatics 29(1)，15-21(2013))。为了量化转录物，使用python包“带有ucsc的htseq”(2007年7月/ncbi37)注释(anders s.et al.，bioinformatics 31(2)，166-169(2015)；hsu f.et al.，bioinformatics 22(9)，1036-1046(2006))，并将读段计数相对于每百万映射读段的每千碱基读段归一化(reads per kilobase per million mapped reads，rpkm)(mortazavi a.et al.，nat methods 5(7)，621-628(2008))。用r软件包“deseq2”(love，m.i.et al.，genome biol 15，550(2014))进行归一化和差异表达(differential expression，de)分析。选择0.01的错误发现率(false discovery rate，fdr)以及为2的log2倍数变化来检测差异表达的基因。
[0640]
统计学分析
[0641]
如果合适的话，使用校正的p值通过未配对双尾student t检验(方法)来比较个体处理和相应的对照组平均值。当比较时间和处理二者时进行双因素anova，并且当具有显著性(p＜0.05)时，使用bonferroni事后检验进行多重比较。用对数秩检验(mantel-cox)确定存活益处。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001。如果没有另外提出，则结果被描述为平均值
±
sem。所有统计分析均用graphpad prism 7进行。
[0642]
实施例1：在人源化hla转基因a2dr1小鼠中免疫接种e6和e7 rna-lpx诱导了强的e6和e7抗原特异性t细胞应答
[0643]
为了评估hpv16 e6和e7 rna-lpx的免疫原性，使用了人源化hla转基因a2dr1小鼠(pajot a.et al.，eur j immunol.34(11)，3060-3069(2004))。这些小鼠缺乏鼠mhc i类和ii类分子，携带双敲除β2m和iaβb，但表达人mhc i类和ii类分子，将这些小鼠用人hla-a2.1和hla-drr稳定转染。将a2dr1小鼠每周用e6或e7 rna-lpx进行疫苗接种，并在第4次免疫接种之后7天分离脾t细胞，以在ifnγ elispot中评估t细胞针对疫苗编码的抗原的反应性(图1a、b)。经e6 rna-lpx疫苗接种的小鼠显示出针对hpv16 e6的强烈和选择性t细胞应答(图1a)，而来自经e7 rna-lpx疫苗接种小鼠的t细胞选择性识别hpv16 e7(图1b)。
[0644]
总之，这些数据表明，hpv16 e6和e7 rna-lpx二者在人源化hla转基因a2dr1小鼠中均有效地致敏以及扩增针对疫苗编码的抗原的内源性t细胞。
[0645]
实施例2：e7 rna-lpx免疫接种介导进行性hpv16阳性肿瘤的完全缓解并建立保护性t细胞记忆
[0646]
接下来评估了e7 rna-lpx诱导的t细胞在两种hpv16抗原阳性协同小鼠肿瘤模型tc-1和c3中的抗肿瘤效力，其中tc-1与c3相比具有更高的e7表达水平(数据未显示)。
[0647]
hpv阳性恶性肿瘤通常出现在口腔或生殖器区域在黏膜中的感染部位。由于这对t细胞运输提出了特有的挑战(f.，s.et al.，cancer research(2013)；nizard，m.et al.，nat.commun.8，15221(2017))，因此我们首次在原位肿瘤环境中探索了hpv16 e7疫苗。将tc-1 luc肿瘤植入在舌基部黏膜下。在单一e7 rna-lpx免疫接种之后数天，在所有小鼠中观察到显著的肿瘤消退(图2a)。在免疫接种之后9天，发现经rna-lpx处理的小鼠的原位肿瘤病变被白细胞严重浸润(图2b)。高至42％的浸润cd8
+
t细胞是hpv 16 e7
49-57
特异性的(图2c)。原位肿瘤中的大多数hpv 16 e7
49-57
特异性t细胞针对归巢相关整合素cd49α为阳性，而血液中循环的所有抗原特异性cd8
+
t细胞均为cd49α阴性(图2d)，这进一步支持了经致敏的t细胞向位于黏膜部位的肿瘤的有效运输。
[0648]
接下来，将肿瘤细胞皮下(s.c.)植入到小鼠的胁侧中，并将小鼠用编码hpv16 e7或无关(irr.)抗原的rna-lpx进行重复i.v.给药。所有经对照处理的小鼠都经历了进行性肿瘤生长，并且必须在肿瘤攻击之后30至40天内处死(图2e、f和2h、i)。在所有荷tc-1瘤小鼠(图2e、f)和9只荷c3瘤小鼠中的6只(图2h，i)中rna-lpx免疫接种与肿瘤的快速和完全排斥相关。剩余三只荷c3瘤小鼠最初有肿瘤缩小的响应，但肿瘤生长最终有进展(图2h、i)。对e7 rna-lpx免疫接种具有完全抗肿瘤响应的所有小鼠在整个观察期内保持无肿瘤(图e、f)。用tc-1细胞再攻击的小鼠保持无肿瘤，表明针对hpv16 e7抗原的功能性记忆t细胞应答的普遍性(图2g和j)。
[0649]
总之，这些数据表明e7 rna-lpx有效地致敏t细胞，所述t细胞浸润肿瘤并在黏膜以及s.c.hpv16
+
tc-1和c3肿瘤中执行抗肿瘤活性。
[0650]
实施例3：经e7 rna-lpx免疫接种的小鼠的肿瘤具有活跃的免疫浸润、e7特异性cd8
+
t细胞和促炎性、细胞毒性和较少的免疫抑制结构
[0651]
在单e7 rna-lpx免疫接种或用无关(ova
257-264
)rna-lpx进行对照处理之后11天，通过流式细胞术分析来自荷tc-1瘤和荷c3瘤小鼠二者的肿瘤浸润细胞群。在两种肿瘤模型中，免疫接种与早期白细胞浸润(图3a)和e7特异性cd8
+
t细胞的强扩增(图3b)相关。当用e7
49-57
肽离体刺激时，免疫接种e7 rna-lpx的肿瘤浸润cd8
+
t细胞而不是经对照处理的小鼠表达高水平的ifnγ和颗粒酶b(granzyme b，gzmb)(数据未显示)。疫苗接种e7 rna-lpx的小鼠的tc-1肿瘤具有较高频率的肿瘤浸润cd8
+
和cd4
+
t细胞(图3c)，其也是高度增殖的，如通过ki-67染色所测量的(图3d)。在c3肿瘤中，针对cd8
+
t细胞群确定了该发现，而cd4
+
t细胞的频率和增殖能力不受e7疫苗的影响(图3f和g)。在两种肿瘤模型中，e7 rna-lpx与nk细胞和肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage，tam)的显著提高相关(图3c和f)。与经对照疫苗接种的小鼠相比，tam略微偏向分泌促炎inos的m1样表型，而抑制性cd206
+
m2样巨噬细胞的频率更低(图3e和h)。在任一模型中免疫接种对treg都没有影响(图3c和f)。
[0652]
经免疫接种的小鼠的大量肿瘤样品的基因表达分析确定并进一步扩展了通过流式细胞术在细胞水平上进行的观察(图3i)。e7 rna-lpx免疫接种与cd8
+
t细胞功能、吸引和th1发育的标志物的上调相关(hertweck，a.et al.，cell rep.15，2756-2770(2016))，所述
标志物包括：t细胞转录因子eomes和tbx21(t-bet)，t细胞共刺激分子cd28、cd27、icos，以及趋化因子例如ccl5、cxcl9和cxcl12以及其共受体cxcr3，其已知在cd8
+
t细胞(hickman，h.d.et al.，immunity 42，524-537(2015))和nk细胞(wendel，m.，galani，i.e.，suri-payer，e.&cerwenka，a.，cancer res.68，8437-8445(2008))上表达。促炎分子例如il-1、il-6、干扰素和ccl2提高，pd-1和inos也提高。大多数但不是所有的这些标志物在两种肿瘤模型中都上调。此外，经疫苗接种的小鼠的tc-1肿瘤而非c3肿瘤显示出以下的较高表达：dc活化标志物(例如cd86、cd40)、单核细胞/巨噬细胞募集的标志物(例如f4/80、ccl5和gm-csf)以及免疫检查点分子pd-l1和ctla-4。
[0653]
总之，疫苗接种hpv16 e7 rna-lpx与向促炎性、细胞毒性和较少免疫抑制的结构的极化显著相关，这在tc-1中比在c3肿瘤更明显。
[0654]
实施例4：e7 rna-lpx免疫接种通过使抗pd-l1难治性肿瘤响应而与检查点阻断协同作用
[0655]
e7 rna-lpx疫苗接种强烈提高肿瘤内t细胞应答并介导整体促炎基因表达变化。强炎症应答通常受到强抑制性应答的反调节，以保持免疫平衡。因此，通过基因表达分析分析了经e7 rna lpx处理的tc-1肿瘤中已知的抑制性受体的表达(图4a)。e7 rna-lpx疫苗接种诱导2463种基因的差异表达(de)(log2倍数＞1，fdr 0.01)，其中许多公知的抑制性t细胞受体例如lag3、cd274(pd-l1)、pdcd1(pd-1)、tigit、havcr2(tim-3)或代谢物例如ido1强烈上调。
[0656]
已知c3和tc-1肿瘤对pd-l1/pd-1免疫检查点抑制剂(cpi)单一治疗具有抗性(badoual，c.et al.，cancer res.(2013).doi：10.1158/0008-5472.can-12-2606；rice，a.e.et al.，cancer gene ther.(2015).doi：10.1038/cgt.2015.40；weir，g.m.et al.，j.immunother.cancer(2016).doi：10.1186/s40425-016-0169-2)。e7 rna-lpx疫苗接种显示出与肿瘤微环境中一系列免疫学上有利的变化相关，包括pd-1和pd-l1的上调(图3i、4a)，其与在表达hpv抗原的tc-1肿瘤中观察到的ifnγ诱导相关(图3i)。假设pd-l1表达的提高与较强的发炎的、非排斥和较少抑制的局部环境相联合可将针对pd-l1/pd-1阻断的难治性的肿瘤转化为易受影响的肿瘤，在小鼠中测试了疫苗和抗pd-l1(apd-l1)的组合治疗。尽管e7 rna-lpx单一治疗有效力，但为了允许治疗性窗口，使肿瘤生长至良好的晚期(肿瘤平均尺寸为120mm3)并仅施用单剂量疫苗，随后每3至4天进行apd-l1处理。
[0657]
在tc-1模型中，用单独的apd-l1处理的小鼠中的大多数必定在25天内死亡，而用e7 rna-lpx单一治疗处理的小鼠被观察到显著的存活益处(图4b和c)。组合的apd-l1进一步改善了e7 rna lpx介导的抗肿瘤响应并显著增强了总体存活。由于e7 rna-lpx疫苗与apd-l1组合治疗组之间的早期肿瘤生长动力学在很大程度上相当，因此添加apd-l1至疫苗中进一步防止了肿瘤生长。另外，在e7 rna-lpx之后抗pd-l1处理在经处理小鼠的血液中显著增强了e7特异性cd8 t细胞应答的扩增(图4d)。这些发现表明，hpv16阳性癌症患者可从所提出的共同驱动肿瘤排斥和肿瘤特异性t细胞应答的e7 rna-lpx/apd-l1的组合中极大地获益。
[0658]
实施例5至9的材料和方法
[0659]
小鼠
[0660]
雌性c57bl/6野生型小鼠购自envigo，并在所有实验中使用年龄匹配(8至10周)的
动物。将小鼠根据联邦和州动物研究政策保持在biontech ag，并且程序和实验组规模由动物福利监管机构批准。
[0661]
肿瘤细胞系
[0662]
鼠tc-1肿瘤细胞来源于通过用hpv16 e6/e7进行永生化和逆转录病毒转导的原代c57bl/6肺细胞(lin，k.y.et al.，cancer research 56，21-26(1996))并与来自t.c.wu(约翰霍普金斯大学)的萤光素酶转染的变体tc-1 luc一起获得。鼠c3肿瘤细胞系是先前通过将具有完全hpv16基因组的c57bl/6胚胎细胞永生化并转染而产生的(feltkamp，m.c.et al.，european journal of immunology 23，2242-2249(1993))，并且是s.h.van der burg(莱顿大学医学中心)的惠赠。细胞的重新认证以及主细胞库和工作细胞库的产生在收到之后立即进行。将第五至第九代的细胞用于体内肿瘤实验。为了辐照肿瘤细胞，使用正电压x射线源xrad320(precision x-ray inc.)。
[0663]
rna构建体和体外转录
[0664]
用于体外转录编码抗原的rna的质粒模板是通过将靶序列克隆到pst1-a120和pst1-mitd载体中产生的，所述载体的特征在于具有针对稳定性和蛋白质翻译经药理学优化的5’utr和3’utr以及poly(a)尾(holtkamp，s.et al.，blood 108，4009-4017(2006)；kreiter，s.et al.，journal of immunology(baltimore，md.：1950)180，309-318(2008))。pst1 mitd特征在于具有用于送至内质网和mhc i类跨膜和胞质结构域的信号序列，以用于改善mhc i类和ii类表位的呈递(kreiter，s.et al.，journal of immunology(baltimore，md.：1950)180，309-318(2008))。使用以下编码抗原的载体：e7(编码全长hpv16 e7)(grunwitz，c.et al.，oncoimmunology 8，e1629259(2019))和鸡卵清蛋白(chicken ovalbumin，ova，编码h-2kb限制性免疫显性表位ova
257-264
)(kranz，l.m.et al.，nature 534，396-401(2016))。在所有实验中，ova rna用作对照rna。如先前(kuhn，a.n.et al.，gene therapy 17，961-971(2010))所述将编码抗原的载体进行体外转录(ivt)并用β-s抗反向帽类似物(arca)加帽。
[0665]
rna-lpx制备
[0666]
rna脂质复合物(rna-lipoplex，rna-lpx)如先前所述(kranz，l.m.et al.，nature 534，396-401(2016))通过将带负电荷的ivt rna与由阳离子脂质dotma和辅助脂质dope组成的阳离子脂质体进行复合来产生。将hepes缓冲的rna(1mg ml-1
)在h2o和1.5m nacl中稀释，并添加脂质体以在150mm的最终nacl浓度下实现1.3∶2的(+)∶(-)电荷比。rna-lpx制剂的颗粒尺寸为200至250nm，多分散性指数为约0.25，并且ζ电位(mv)为-20至30mv。
[0667]
肿瘤模型和处理
[0668]
对于治疗性肿瘤实验，对c57bl/6小鼠皮下注射1
×
105个tc-1或tc-1 luc肿瘤细胞和5
×
105个c3肿瘤细胞到右胁侧。每三至四天用卡尺非盲地测量肿瘤生长，并通过(a2×
b)/2(a，宽度；b，长度)计算肿瘤体积。用40μge7或对照(ova)rna-lpx静脉内免疫接种小鼠。疫苗接种方案中的箭头指示免疫接种。在rna-lpx免疫接种之前根据小鼠的肿瘤尺寸将小鼠随机分配。正电压x射线源xrad320(precision x-ray inc.)用于肿瘤辐照，以0.47gy/分钟的剂量率用不同剂量局部辐照肿瘤。使用以下公式计算生物有效剂量：其中n为分级数目，d为剂量/分级，以及为肿瘤固有放射敏感性
(gough，m.j.，crittenden，m.r.&young，k.h.，immunotherapy 7，847-849(2015))。在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下进行肿瘤辐照。使用定制的铅屏蔽对正常组织进行屏蔽，所述铅屏蔽备有(spare)仅允许肿瘤组织暴露的孔(直径1.5cm)。对于体内brdu标记，在器官切除之前24小时腹膜内注射1mg/小鼠的brdu碱基类似物(brdu flow kit，bd bioscience)。在器官切除之前1小时静脉内注射1.2mg/小鼠的缺氧探针哌莫硝唑(hypoxyprobe inc.)。当肿瘤体积超过1500mm3时或当表现出健康受损迹象时，对动物进行安乐死。
[0669]
在一些实验中，小鼠在rna-lpx疫苗接种之后两次腹膜内(i.p.)接受80μg顺铂化学治疗剂或pbs。
[0670]
组织制备
[0671]
为了产生肿瘤单细胞悬液，使用小鼠肿瘤解离试剂盒和gentlemacs
tm
解离器(miltenyi biotec)切割和消化肿瘤。为了产生淋巴结单细胞悬液，用镊子挤压淋巴结并与1mg ml-1
胶原酶(roche diagnostics)和10μg ml-1
dna酶i(roche diagnostics)一起孵育。使用注射器的柱塞末端将肿瘤和淋巴结单细胞悬液以及整个脾强制通过70μm细胞过滤器(bd falcon)，同时用pbs冲洗。将细胞在460g下离心6分钟，并将红细胞用低张电解质溶液裂解5分钟。为了分离cd8 til，使用小鼠cd8(til)微珠(microbead)(miltenyi biotech)根据制造商的说明来磁性富集靶细胞。
[0672]
流式细胞术
[0673]
对肿瘤、肿瘤引流淋巴结和脾单细胞悬液以及富集cd8 t细胞的肿瘤单细胞悬液进行流式细胞术染色。用于胞外染色的单克隆抗体包括抗小鼠cd45、cd8α、cd4、cd44、nk1.1、pd-l1、切割的胱天蛋白酶-3、qa-1b(bd pharmingen)、pd-1、nkg2ab(invitrogen)、tim-3、fas、h-2(泛mhc i类)(biolegend)和cd25(ebioscience)。对于胞内染色，使用针对ifnγ、il-2(ebioscience)和tnfα、foxp3(bd pharmingen)的抗体。如下进行流式细胞术染色：用生存力染料(ebioscience)根据制造商的说明对活细胞进行染色。将e7特异性cd8
+
t细胞用e7
49-57 h2-db限制性dextramer(immudex)在4℃下在黑暗中染色10分钟。将胞外靶标在4℃下在黑暗中染色30分钟。包含5％fcs和5mm edta的pbs用作洗涤和染色缓冲液。根据制造商的说明，对于ifnγ、tnfα和il-2的染色，用cytofix/cytoperm(bd pharmingen)将样品固定并透化，而对于foxp3染色，使用foxp3固定试剂盒(ebioscience)将样品固定并透化。如先前(diken，m.et al.，methods in molecular biology(clifton，n.j.)1499，223-236(2017).)所述进行胞内细胞因子染色，在存在10μg/ml布雷菲德菌素a(brefeldin a)(sigma)的情况下，用经2μg/ml负载e7
49-57
(rahynivtf，jerini peptide technologies)肽的c57bl/6 bmdc在37℃下刺激cd8
+
t细胞5小时。使用bd体内brdu流式细胞术试剂盒根据制造商的说明进行体内brdu标记和染色。通过对可生存细胞和单个细胞进行预设门来限定免疫细胞群，并确定如下：nk细胞(cd45
+
nk1.1
+
)、cd8 t细胞(cd45
+
cd8
+
)、e7特异性cd8 t细胞(cd45
+
cd8
+
e7
49-57
多聚体
+
)、cd4 t细胞(cd45
+
cd4
+
)、treg(cd45
+
cd4
+
foxp3
+
cd25
+
)、肿瘤细胞(cd45-cd44
+
)。在facs canto ii或lsr fortessa(bd biosciences)上获取流式细胞术数据，并使用flowjo 10.4(tree star)进行分析。
[0674]
免疫荧光显微术
[0675]
将冷冻保存的肿瘤的8-μm切片在4％多聚甲醛(pfa)中固定10分钟，在包含0.1％triton的tris缓冲盐水(tris-buffered saline，tbs)缓冲液中透化，并在室温下在黑暗中
在补充有1％牛血清白蛋白(bovine serum albumin，bsa)、5％小鼠血清、5％大鼠血清和0.02％nonident的dpbs中封闭1小时。使用针对哌莫硝唑-硫醇加合物的经荧光标记的抗体(hydroxyprobe
tm red584，hydroxyprobe inc.)在4℃下将切片染色过夜，随后用hoechst(sigma-aldrich)对核进行染色。使用落射荧光显微镜(axio scan.z1，zeiss，oberkochen，germany)获取免疫荧光图像。
[0676]
统计学分析和数据呈现
[0677]
单一处理和对照组平均值通过未配对双尾student t检验进行比较。如果比较多于两个实验组，则进行单因素方差分析(anova)，并且当确定显著(p＜0.05)时，运行tukey多重比较检验。使用对数秩检验(mantel-cox)确定存活益处。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001。如果没有另外提出，结果被描述为平均值
±
sem。所有统计学分析均用graphpad prism 8进行。
[0678]
对于实施例9，用graphpad prism 9进行统计学分析。对于肿瘤生长分析，进行双因素方差分析(anova)，并且当确定显著(p＜0.05)时，运行tukey多重比较检验。
[0679]
实施例5：lrt与e7 rna-lpx疫苗接种协同作用以控制所建立的hpv16
+
肿瘤
[0680]
为了探索lrt和e7 rna-lpx疫苗形式的组合，在小鼠hpv16 e6/e7
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肿瘤模型tc-1中评估了不同剂量的局部放射治疗(lrt)(1.8gy、7gy或12gy)。单一和晚期施用的e7 rna-lpx疫苗接种显著促进肿瘤排斥(图5a2)和荷tc-1瘤小鼠的存活(图5b)，然而，大多数tc-1肿瘤复发。相比之下，lrt处理对肿瘤生长具有边际效应(图5a1、b)，而当与e7 rna-lpx疫苗组合时，显示出优异的治疗作用，而与测试的辐照剂量无关(图5a2、b)。令人感兴趣的是，在该肿瘤模型中，当e7 rna-lpx与高剂量12gy lrt组合时实现了最佳治疗作用，使在肿瘤接种之后长至100天100％的小鼠无肿瘤(图5b)。同时，在e7 rna-lpx之后17天在血液中监测到e7特异性cd8 t细胞的扩增，并且无论小鼠是否被辐照都被称为相等的，表明即使当与细胞毒性lrt组合时，也有效致敏rna lpx诱导的抗原特异性免疫应答(图5c)。接下来，讨论了用保持生物学有效剂量的不同lrt方案是否可实现e7 rna-lpx/lrt的相同治疗效力。当将12gy lrt分级至3
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6gy(数据未显示)时，观察到相当的抗肿瘤作用以及存活益处，表明总剂量而不是lrt剂量分级与用e7 rna-lpx实现协同作用的相关性。
[0681]
然后测试了组合的e7 rna-lpx/lrt在第二hpv16
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小鼠肿瘤模型c3中的抗肿瘤作用。与tc-1类似，e7 rna-lpx显著增强荷c3瘤小鼠的存活，而12gy lrt对c3肿瘤生长也仅具有边际效应(图5d、e)。虽然所有经lrt处理的荷c3瘤小鼠必须在肿瘤攻击之后第75天时处死，但组合的e7 rna-lpx/lrt引起荷c3瘤小鼠的显著存活益处(图5d)并且将完全响应率增强至60％(图5e)。关于荷hpv16
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tc-1瘤小鼠，组合的e7 rna-lpx/lrt介导hpv16
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c3肿瘤的优异肿瘤排斥，其优于所有其他处理组。
[0682]
实施例6：经e7 rna-lpx处理的小鼠的肿瘤被效应免疫细胞高度浸润
[0683]
为了表征在组合e7 rna-lpx/lrt之后优异肿瘤排斥的潜在细胞作用，通过流式细胞术分析了tc-1肿瘤免疫浸润(图6)。在单一e7rna-lpx疫苗接种之后12天以及在12gy lrt之后5天切除tc-1肿瘤，然而，在当单一治疗的肿瘤生长曲线相对于对照组开始偏离(diverge)时的时间点，在e7 rna-lpx/lrt治疗下的小鼠仍然显示出与经e7rna-lpx疫苗接种的小鼠类似的肿瘤尺寸(图6a)。流式细胞术数据显示出e7 rna-lpx疫苗接种使cd45
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白细胞的浸润从基线(对照rna-lpx)处的10％提高至70％，并使肿瘤细胞含量从90％降低至
lpx或e7 rna-lpx/lrt处理的荷tc-1瘤小鼠以及通过组织学分析的缺氧肿瘤区域中。组合的lrt显著且强烈地降低了经e7 rna-lpx处理的小鼠中的tc-1肿瘤缺氧(图7g)，并且令人感兴趣地与该处理组中cd8 til的最高增殖率相关(图7h)，如通过碱基类似物溴脱氧尿苷(brdu)在cd8 til而不是cd4 til中的较高并入所示。
[0689]
基于观察结果，e7 rna-lpx疫苗接种使低免疫浸润和冷tc-1肿瘤在免疫学上变热(图6b、c、d)，而组合的lrt降低肿瘤细胞含量并另外地减少肿瘤内缺氧(图7a、g)，这显示出促进了cd8的增殖能力(图7h)并允许晚期肿瘤排斥。
[0690]
实施例8：lrt使e7特异性cd8
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t细胞应答更有效和持久
[0691]
先前观察到，无论肿瘤是否被辐照，由e7 rna-lpx疫苗接种产生的e7特异性cd8 til均显示出相同的ifnγ和tnfα效应细胞因子分泌水平(图6e)，并且在该早期时间点，抗肿瘤作用类似(图6a)。
[0692]
由于组合的lrt在晚期时间点增强肿瘤排斥，因此当经e7 rna-lpx和e7 rna-lpx/lrt处理的小鼠的肿瘤生长曲线偏离时，如在lrt之后9天所出现的，则转向表征e7特异性cd8 t细胞的功能参数(图8a)。流式细胞术数据显示经e7 rna-lpx和e7 rna-lpx/lrt处理的荷tc-1瘤小鼠显示出相同频率的e7特异性cd8 t细胞(图8b)以及抑制性受体tim-3(图8c)和pd-1(图8d)的类似表达，然而，在从经e7 rna-lpx/lrt处理的小鼠中分离的cd8 til中可检出t细胞抑制性受体nkg2ab的较高表达(图8e)。重要的是，来自经组合治疗处理的小鼠的e7特异性cd8 til在抗原再刺激之后显著分泌更多的ifnγ和tnfα效应细胞因子(图8f)以及il-2(图8g)，表明疫苗诱导的e7特异性cd8 t细胞的较高的效应功能和活化状态与其在肿瘤排斥期间的较高生物学效应相关。这种较高的生物学效应伴有降低的肿瘤含量(数据未显示)和较高水平的凋亡肿瘤细胞(cc3
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，数据未显示)，而肿瘤细胞识别的其他免疫学参数，例如mhc i类、pd-l1和fas表达保持不变(数据未显示)。
[0693]
总体而言，数据表明lrt降低了tme内的肿瘤细胞含量和免疫抑制因子，并且因此，使疫苗诱导的e7特异性cd8 til应答更有效和持久，以用于增强hpv16
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肿瘤的排斥。
[0694]
实施例9：e7 rna-lpx和顺铂化学治疗协同作用以排斥hpv16
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tc-1肿瘤
[0695]
由于化学治疗是hnscc癌症患者标准护理的一部分(pmid：24273416)，因此在荷hpv16
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tc-1瘤c57bl/6小鼠中评估了最常用于hnscc患者的化学治疗顺铂化学治疗和新的e7 rna-lpx疫苗的组合，作为hpv
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hnscc患者的潜在的未来治疗方案。荷tc-1瘤小鼠在第16天用e7 rna-lpx进行处理，并在第22天和第28天接受两个剂量的顺铂化学治疗(图9)。将对照小鼠用编码不由tc-1肿瘤表达的ova的对照rna-lpx、或者与顺铂组合的对照rna-lpx进行处理。尽管所有经对照rna-lpx免疫接种的小鼠必须在第43天时处死，但e7 rna-lpx处理增强了完全应答率(图9a)、显著减缓了肿瘤生长(图9b)以及诱导了存活益处(图9c)。顺铂化学治疗仅略微改善了经对照rna-lpx免疫接种小鼠中的肿瘤生长(图9a、b)，但强烈且显著增强了e7 rna-lpx疫苗的治疗作用，其中10/12小鼠无肿瘤(图9a)。另外，组合的e7 rna-lpx和顺铂化学治疗显著降低了肿瘤生长(图9b)并介导了强烈的存活益处(图9c)，这在任何经单一治疗处理的组中均未观察到。总之，顺铂增强了e7 rna-lpx疫苗接种的抗肿瘤作用。因此，rna-lpx疫苗和基于铂的化学治疗可用作用于改善的癌症治疗的协同组合伴侣。