抑制ROR-β表达的用于诱导不对称RNAi的核酸分子的制作方法

本发明涉及一种抑制ror-β(retinoid-related orphan nuclear receptor)表达的用于诱导不对称rnai的核酸分子及其用途，具体地，涉及一种用于诱导不对称rnai的核酸分子以及用于改善或治疗视网膜疾病的药物组合物，所述用于诱导不对称rnai的核酸分子包括包含与编码ror-β的mrna互补的序列的反义链以及与所述反义链形成互补键的有义链，所述组合物包括所述用于诱导不对称rnai的核酸分子。

背景技术：

1、视网膜色素变性是一种因赋予视杆细胞特征的基因发生突变而破坏视杆细胞，并进一步破坏视锥细胞而最终导致失明的疾病。ror-β(retinoid-related orphan nuclearreceptor)是一种在视杆细胞和视锥细胞的分化中起重要作用的转录因子，其对调节向杆状细胞分化的neural retina leucine zipper(nrl)表达进行调节，并参与其它多种视网膜功能。ror-β有rorβ1和rorβ2两种同源异构体，rorβ1在nrl的上游阶段(upstream)诱导nrl表达，而rorβ2是受nrl调节的因子，其使nrl的表达得到强化。即，ror-β和nrl两个基因之间发生正反馈作用，从而稳定视杆细胞分化。(fu et al.，"feedback induction of aphotoreceptor-specific isoform of retinoid-related orphan nuclear receptorβbythe rod transcription factor nrl"journal of biological chemistry 2014nov 21；289(47):32469-80.)。特别是，以与ror-β密切相关的nrl为例，通过视网膜变性的小鼠模型观察到当用腺病毒相关病毒(aav)传递的crispr/cas9敲除时，视杆细胞获得部分视锥细胞的性质，使得视杆细胞在赋予视杆细胞特征的基因发生突变时不被破坏并得以保持，进而防止视锥细胞的损失(yu，wenhan，et al.，"nrl knockdown by aav-delivered crispr/cas9 prevents retinal degeneration in mice."nature communications 8(2017)：14716)。这种现象类似于在缺损ror-β的小鼠中视杆细胞获得视锥细胞特性的研究类似(jia et al，"retinoid-related orphan nuclear receptor rorβis an early-actingfactor in rod photoreceptor development"proceedings of the national academyof sciences of the united states of america(2009)13；106(41):17534-9.)，由此可见，nrl和ror-β在视网膜内视杆细胞和视锥细胞的分化过程中起到非常重要的作用。

2、另一方面，利用rna干扰现象治疗疾病使用的是靶向mrna并在翻译水平中调节基因表达的sirna，因此可以更加安全地治疗疾病。小干扰rna(small interfering rna；sirna)由具有与靶mrna相同序列的有义链以及具有与其互补序列的反义链组成。常规sirna具有19bp至21bp的短双链体，并且两个核苷酸从两条链的3'突出。sirna进入细胞附着于靶mrna后分解靶mrna，从而抑制靶基因的表达。由于可以通过改变寡核苷酸序列来靶向所有的mrna，因此可以抑制结构复杂的蛋白质的表达，从而使当前难以治疗的癌症、病毒感染以及遗传病等疾病得到治疗。然而，引入细胞内的sirna可能引起免疫反应的诱导、脱靶基因的抑制等副作用，其中，将sirna导入细胞内的传递系统在利用sirna的治疗药物研发中成为最关键的问题。

3、sirna因磷酸骨架而带有负电荷，其与带负电荷的细胞膜有排斥力，因此需要一个传递系统将sirna导入细胞。作为传递系统的实例，广泛使用的是利用具有正电荷的脂质体或聚合物包裹sirna来抵消负电荷，从而将其导入细胞的方法。然而，带正电荷的载体会引起各种副作用，例如附着在带负电荷的细胞膜上，表现出不需要的毒性，或者通过与细胞中各种类型的蛋白质相互作用形成不需要的复合物等。此外，由于sirna会被血液中的核酸酶快速分解，因此到达靶细胞的sirna量可能不足以显着降低靶基因的表达。因此，需要一种安全有效地将sirna传递至靶细胞的方法。

4、为此，本发明人为选择可抑制ror-β表达的靶向ror-β的sirna，并研发出无需传递物质也可传递至细胞且对核酸酶具有高抵抗力的sirna而付出努力，最终设计出靶向ror-β的sirna，通过筛选选择出最有效抑制ror-β的sirna，并证实通过修饰可以解决细胞内传递问题，以此完成了本发明。

5、本背景技术部分中描述的上述信息仅用于提高对本发明背景的理解，因此可以不包括构成本发明所属领域技术人员已知的现有技术的信息。

技术实现思路

1、技术问题

2、本发明的目的在于提供一种特异性抑制ror-β表达的用于诱导不对称rnai的核酸分子。

3、本发明的另一目的在于提供一种用于改善或治疗视网膜疾病的药物组合物或改善或治疗视网膜疾病的方法。

4、技术方案

5、为了实现上述目的，本发明提供一种用于诱导rnai的核酸分子，其特征在于包括包含与编码ror-β(retinoid-related orphan nuclear receptor)的mrna互补的序列的反义链以及与所述反义链形成互补键的有义链，并且所述反义链的5’末端和所述有义链的3’末端形成平端(blunt end)。

6、本发明另外提供一种用于改善或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包括所述用于诱导rnai的核酸分子。

7、本发明另外提供一种改善或治疗视网膜疾病的方法，其包括将所述用于诱导rnai的核酸分子施用于个体。

8、有益效果

9、根据本发明，筛选出可有效抑制在视杆细胞和视锥细胞的分化过程中起到非常重要作用的ror-β表达的不对称sirna，通过化学修饰使所述sirna在没有载体的情况下引入细胞内并对核酸酶具有抵抗力，以去除载体引起的细胞毒性，并且体内实现更加有效的基因表达抑制，从而可有效用作包括视网膜色素变性在内的视网膜疾病的治疗药物。

技术特征：

1.一种用于诱导rnai的核酸分子，其包括：反义链，其包含与编码ror-β的mrna互补的序列；以及有义链，其与所述反义链形成互补键，其中，所述反义链的5’末端和所述有义链的3’末端形成平端。

2.根据权利要求1所述的用于诱导rnai的核酸分子，其中，所述有义链具有15nt至17nt的长度，所述反义链具有18nt至23nt的长度。

3.根据权利要求1所述的用于诱导rnai的核酸分子，其中，所述有义链选自由seq idno：27、29、51、83、85、91、95、97、103、105、107、109以及115所组成的组。

4.根据权利要求3所述的用于诱导rnai的核酸分子，其中，所述有义链选自由seq idno：27、29、51以及109所组成的组。

5.根据权利要求1所述的用于诱导rnai的核酸分子，其中，所述反义链选自由seq idno：28、30、52、84、86、92、96、98、104、106、108、110以及116所组成的组。

6.根据权利要求5所述的用于诱导rnai的核酸分子，其中，所述反义链选自由seq idno：28、30、52以及110所组成的组。

7.根据权利要求1所述的用于诱导rnai的核酸分子，其中，所述用于诱导rna i的核酸分子的有义链或反义链包括选自由以下的至少一种化学修饰：

8.根据权利要求7所述的用于诱导rnai的核酸分子，其中，所述亲脂性化合物选自由胆固醇、生育酚、硬脂酸、视黄酸、dha、棕榈酸、亚油酸、亚麻酸以及具有10个或更多个碳原子的长链脂肪酸所组成的组。

9.根据权利要求7所述的用于诱导rnai的核酸分子，其中，所述有义链包括选自以下的至少一种化学修饰：

10.根据权利要求7所述的用于诱导rnai的核酸分子，其中，所述反义链包括选自以下任意一种或多种化学修饰：

11.根据权利要求7所述的用于诱导rnai的核酸分子，其中，所述用于诱导rn ai的核酸分子包括选自由以下所组成的组中的至少一种修饰：

12.根据权利要求7所述的用于诱导rnai的核酸分子，其中，所述用于诱导rn ai的核酸分子包括选自以下的任一种反义链，

13.根据权利要求7所述的用于诱导rnai的核酸分子，其中，所述用于诱导rn ai的核酸分子包括选自以下的任一种有义链，

14.根据权利要求7所述的用于诱导rnai的核酸分子，其中，所述用于诱导rn ai的核酸分子具有细胞穿透能力。

15.一种用于改善或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包括权利要求1至14中任一项所述的用于诱导rnai的核酸分子作为活性成分。

16.根据权利要15所述的药物组合物，其中，所述视网膜疾病是选自由usher综合征、stargardt病、巴尔得-别德尔综合征、贝斯特氏病、脉络膜缺损、脉络膜视网膜萎缩、视网膜色素变性、视网膜黄斑变性、先天性黑蒙、bcm、视网膜劈裂症、ml、小口氏病或雷夫叙姆病所组成的组中的任一种。

技术总结
本申请涉及一种抑制ROR‑β(RAR related orphan receptor B)表达的用于诱导不对称RNAi的核酸分子及其用途，具体地，涉及一种用于诱导不对称RNAi的核酸分子以及用于改善或治疗视网膜疾病的药物组合物，所述用于诱导不对称RNAi的核酸分子包括包含与编码ROR‑β的mRNA互补的序列的反义链以及与所述反义链形成互补键的有义链，所述组合物包括所述用于诱导不对称RNAi的核酸分子。

技术研发人员：郑蕙媛,朴峻贤,梁承惹
受保护的技术使用者：奥利克斯医药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14