一种负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒及其制备方法

一种负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性
ε-聚赖氨酸颗粒及其制备方法
技术领域
1.本发明属于属于高分子材料技术领域，具体涉及一种负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒及其制备方法。


背景技术：

2.糖尿病是一种以高血糖为主要特征的慢性疾病，全球有5.37亿糖尿病患者(国际糖尿病联盟2021年数据)。糖尿病的诱因是胰岛素分泌功能受损或完全丧失，随病情发展可还导致心脏、神经、眼、肾等的功能受损，进而威胁生命安全。施用外源性胰岛素可显著缓解糖尿病患者的高血糖症状，但治疗过程中的剂量不准确问题是导致糖尿病患者血糖控制效果不好的主要原因，其中剂量过高而导致的低血糖尤为致命。因此，既能缓解高血糖症状，又能避免低血糖问题的外源性胰岛素制剂是糖尿病治疗领域的热点。目前临床上采用长效胰岛素进行治疗，如已商业化的地特胰岛素、甘精胰岛素和德谷胰岛素等。其治疗的原理是通过降低胰岛素的释放速率来避免降血糖过程中血糖水平快速降至低血糖。但是长效胰岛素的施用剂量高时，仍会产生低血糖问题。
3.近来，利用糖敏苯硼酸基聚合物颗粒负载胰岛素的策略在糖尿病治疗领域引起广泛关注。这一类聚合物颗粒具有两亲性结构，其中疏水的苯硼酸基团可与葡萄糖结合为亲水的葡萄糖/苯硼酸复合物基团，从而诱导苯硼酸基聚合物颗粒的溶胀或溶解，进而释放出负载的胰岛素。基于这一原理，在血糖水平较高时，负载胰岛素的糖敏苯硼酸基聚合物颗粒能较快地释放胰岛素，快速缓解高血糖症状；在血糖水平正常或较低的情况下，负载胰岛素的糖敏苯硼酸基聚合物颗粒具有抑制胰岛素释放的性能，因此可以避免低血糖的发生。目前，苯硼酸基聚合物颗粒存在的问题为合成工艺复杂，规模化生产成本高。例如，li等[1]报道的聚乙二醇改性苯硼酸基聚合物颗粒合成需要至少5步，而wen等[2]报道的淀粉改性苯硼酸基聚合物颗粒合成需要3步。
[0004]
引证文件：
[0005]
[1]c.li,f.huang,y.liu,et al.nitrilotriacetic acid-functionalized glucose-responsive complex micelles for the efficient encapsulation and self-regulated release of insulin langmuir 2018,34,12116.
[0006]
[2]n.wen,s.lv,c.gao,et al.glucose-responsive zwitterionic dialdehyde starch-based micelles with potential anti-phagocytic behavior for insulin delivery chem.eng.j.2018,335,52.


技术实现要素：

[0007]
为了解决背景技术中的问题，本发明提供了一种负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒及其制备方法。采用接枝反应制备苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒，通过将苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒在胰岛素溶液中浸泡制备负载胰岛素
的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒。
[0008]
本发明采用的的技术方案如下：
[0009]
一、一种负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒
[0010]
苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸是利用接枝反应将脂肪酸和4-羧基-3氟苯硼酸接枝在ε-聚赖氨酸上得到的，苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒既可以负载胰岛素后通过皮下注射的方法进行胰岛素递送，也可以将负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒填装在聚合物微针贴中后通过透皮给药的方法进行胰岛素递送。
[0011]
所述ε-聚赖氨酸，其结构式如下：
[0012][0013]
所述苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸，其结构式如下：
[0014][0015]
其中n＝4、6、8、10、12、14、16或18。
[0016]
二、一种负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒的制备方法包括以下步骤：
[0017]
1)将脂肪酸、4-羧基-3氟苯硼酸和辅料投入溶剂中搅拌，得到混合物a。
[0018]
2)将ε-聚赖氨酸投入溶剂中搅拌，得到混合物b。
[0019]
3)将混合物a和混合物b混合搅拌，得到混合物c。
[0020]
4)将混合物c装入透析袋，装有混合物c的透析袋置于水中透析，每隔一段时间将透析水换为新鲜水。透析完毕后，将透析袋中的混合物冻干，得到产物苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸。
[0021]
5)将苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸浸泡在胰岛素溶液中，然后离心，去除上清液，收集固体并冻干，获得负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒。
[0022]
所述步骤1)中的辅料为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺中的一种或多种。
[0023]
所述步骤1)中的脂肪酸为正丁酸、正己酸、正辛酸、正癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、十六酸和十八酸中的一种或多种，优选正癸酸。
[0024]
所述步骤1)中的搅拌速率为200-600rpm，时间为1-240min，温度为常温。
[0025]
所述步骤1)与步骤2)中的溶剂为水、二甲基亚砜、n，n-二甲基甲酰胺、n，n-二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种。
[0026]
所述步骤1)中，以质量份数计，4-羧基-3氟苯硼酸为1份，脂肪酸为0.02-5份，辅料为0.2-10份，溶剂为10-300份。
[0027]
所述步骤2)中，以质量份数计，ε-聚赖氨酸为1份，溶剂为1-100份。
[0028]
所述步骤2)中的搅拌速率为200-600rpm，时间为1-240min，温度为常温。
[0029]
所述步骤1)中的羧基修饰苯硼酸和步骤2)中的ε-聚赖氨酸，以质量份数计，4-羧基-3氟苯硼酸为1份，ε-聚赖氨酸为0.1-10份。
[0030]
所述步骤3)中的搅拌速率为200-600rpm，时间为5-3000min，温度为常温。
[0031]
所述步骤4)中的透析袋截留分子量为500-3500da。
[0032]
所述步骤4)中的每次换水时间间隔为2-24h，换水次数为6-10次，透析水体积为3-5升。
[0033]
所述步骤5)中的以质量份数计，苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒为1份，胰岛素为0.01-1份。
[0034]
所述步骤5)中的胰岛素溶液的溶剂为水，胰岛素为猪胰岛素和人胰岛素中的一种或多种，胰岛素的质量浓度为0.01-10％。
[0035]
所述步骤5)中的浸泡时间为10-240min，转速为100-10000rpm，离心时间为1-60min。
[0036]
所述步骤1)至步骤3)可合并为一步，将脂肪酸、4-羧基-3氟苯硼酸、辅料、ε-聚赖氨酸和溶剂混合搅拌，得到混合物c。搅拌速率为200-600rpm，时间为5-3000min，温度为常温。以质量份数计，4-羧基-3氟苯硼酸为1份，脂肪酸为0.02-5份，辅料为0.2-10份，ε-聚赖氨酸为0.1-10份，溶剂为10-300份。
[0037]
本发明的负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒中，ε-聚赖氨酸被疏水的脂肪酸和苯硼酸修饰，自组装形成苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒，颗粒内部可通过疏水作用负载胰岛素。由于疏水的苯硼酸基团可与葡萄糖结合并转变为为亲水的葡萄糖/苯硼酸复合物基团，因此颗粒在葡萄糖的诱导下发生溶胀行为，从而释放出内部包载的胰岛素。在血糖水平较高时，负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性聚合物颗粒能较快地释放胰岛素，快速缓解高血糖症状；在血糖水平正常或较低的情况下，负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性聚合物颗粒具有抑制胰岛素释放的性能，因此可以避免低血糖的发生。本发明中负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒既可以直接皮下注射，也可将负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒填装在聚合物微针贴中制成填装有负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒的聚合物微针贴，通过透皮给药的方法进行递送，糖尿病患者可根据自身需求自由选择给药方式。
[0038]
本发明的有益效果：
[0039]
1.本发明的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸的合成工艺简单，合成反应仅需要1步，规模化生产成本低。
[0040]
2.本发明的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒可完全水解为脂肪酸、4-羧基-3-氟苯硼酸和赖氨酸小分子，有利于苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒在体内的排泄。
[0041]
3.本发明负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒对葡萄糖浓度具有刺激-响应性能，可依据葡萄糖浓度的变化自动调节所负载药物的释放速率和释放剂量，具有低胰岛素突释性能，可有效缓解高血糖症状，同时避免胰岛素过量导致的低血糖问题。
[0042]
4.本发明负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒具有适宜的疏水稳定性，可抑制正常血糖水平或较低血糖水平下的胰岛素突释行为，进而避免低血糖的产生。
附图说明
[0043]
图1为实施例4制备的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸的核磁氢谱谱图。
[0044]
图2为实施例8制备的负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒的胰岛素累积释放曲线。
[0045]
图3为实施例8中的负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒及相应对比例的低血糖持续时间。
具体实施方式
[0046]
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0047]
实施例1：
[0048]
将1.2856g 4-羧基-3-氟苯硼酸、0.2649g正丁酸、1.9120g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.1563g n-羟基丁二酰亚胺投入90g二甲基亚砜和10克水中搅拌，得到混合物a，搅拌速率为400rpm，时间为90min，温度为常温。将1.0004gε-聚赖氨酸投入10g水中搅拌，搅拌速率为400rpm，时间为10min，温度为常温，得到混合物b。将混合物a和混合物b混合搅拌，搅拌速率为500rpm，时间为2000min，温度为常温，得到混合物c。将混合物c装入透析袋，透析袋截留分子量为1000da，装有混合物c的透析袋置于水中透析，每隔一段时间将透析水换为新鲜水，每次换水时间间隔为6h，换水次数为9次，透析水体积为3升。透析完毕后，将透析袋中的混合物冻干，得到产物苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸。
[0049]
实施例2：
[0050]
将1.2705g 4-羧基-3-氟苯硼酸、0.2923g正己酸、1.7997g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.0925g n-羟基丁二酰亚胺投入50g二甲基亚砜、25g n，n-二甲基甲酰胺和25g n，n-二甲基乙酰胺中搅拌，得到混合物a，搅拌速率为400rpm，时间为90min，温度为常温。将1.0202gε-聚赖氨酸投入10g水中搅拌，搅拌速率为400rpm，时间为10min，温度为常温得到混合物b。将混合物a和混合物b混合搅拌，搅拌速率为500rpm，时间为2000min，温度为常温，得到混合物c。将混合物c装入透析袋，透析袋截留分子量为1000da，装有混合物c的透析袋置于水中透析，每隔一段时间将透析水换为新鲜水，每次换水时间间隔为6h，换水次数为9次，透析水体积为4升。透析完毕后，将透析袋中的混合物冻干，得到产物苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸。
[0051]
实施例3：
[0052]
将1.3005g 4-羧基-3-氟苯硼酸、0.3626g正辛酸、1.9001g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.0005g n-羟基丁二酰亚胺投入70g二甲基亚砜和30g四氢呋喃中搅拌，得到混合物a，搅拌速率为400rpm，时间为90min，温度为常温。将1.0006gε-聚赖氨酸投入10g水中搅拌，搅拌速率为400rpm，时间为10min，温度为常温得到混合物b。将混合物a和混合物b混合搅拌，搅拌速率为500rpm，时间为2000min，温度为常温，得到混合物c。将混合物c装入透析袋，透析袋截留分子量为1000da，装有混合物c的透析袋置于水中透析，每隔一段时间将透析水换为新鲜水，每次换水时间间隔为6h，换水次数为9次，透析水体积为3
升。透析完毕后，将透析袋中的混合物冻干，得到产物苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸。
[0053]
实施例4：
[0054]
将1.2808g 4-羧基-3-氟苯硼酸、0.3440g正癸酸、1.7253g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.0350g n-羟基丁二酰亚胺投入90g二甲基亚砜和10g三氯甲烷中搅拌，得到混合物a，搅拌速率为400rpm，时间为90min，温度为常温。将1.2006gε-聚赖氨酸投入10g水中搅拌，搅拌速率为400rpm，时间为10min，温度为常温得到混合物b。将混合物a和混合物b混合搅拌，搅拌速率为500rpm，时间为1000min，温度为常温，得到混合物c。将混合物c装入透析袋，透析袋截留分子量为1000da，装有混合物c的透析袋置于水中透析，每隔一段时间将透析水换为新鲜水，每次换水时间间隔为6h，换水次数为9次，透析水体积为3升。透析完毕后，将透析袋中的混合物冻干，得到产物苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸。
[0055]
本实施例结果如图1所示。图1为苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸的核磁氢谱谱图。经计算，4-羧基-3-氟苯硼酸接枝率为47％，正癸酸接枝率为10％。
[0056]
实施例5：
[0057]
将1.2884g 4-羧基-3-氟苯硼酸、0.6044g月桂酸、1.9172g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.1565g n-羟基丁二酰亚胺投入90g二甲基亚砜和10g二氯甲烷中搅拌，得到混合物a，搅拌速率为400rpm，时间为90min，温度为常温。将1.0009gε-聚赖氨酸投入10g水中搅拌，搅拌速率为300rpm，时间为200min，温度为常温得到混合物b。将混合物a和混合物b混合搅拌，搅拌速率为500rpm，时间为2000min，温度为常温，得到混合物c。将混合物c装入透析袋，透析袋截留分子量为1000da，装有混合物c的透析袋置于水中透析，每隔一段时间将透析水换为新鲜水，每次换水时间间隔为6h，换水次数为9次，透析水体积为3升。透析完毕后，将透析袋中的混合物冻干，得到产物苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸。
[0058]
实施例6：
[0059]
将1.2880g 4-羧基-3-氟苯硼酸、0.4050g肉豆蔻酸、0.4521g十六酸和5.0129g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐投入75g二甲基亚砜和25g三氯甲烷中搅拌，得到混合物a，搅拌速率为500rpm，时间为60min，温度为常温。将1.0009gε-聚赖氨酸投入10g水和2g二甲基亚砜中搅拌，搅拌速率为400rpm，时间为10min，温度为常温得到混合物b。将混合物a和混合物b混合搅拌，搅拌速率为500rpm，时间为2000min，温度为常温，得到混合物c。将混合物c装入透析袋，透析袋截留分子量为500da，装有混合物c的透析袋置于水中透析，每隔一段时间将透析水换为新鲜水，每次换水时间间隔为8h，换水次数为8次，透析水体积为3升。透析完毕后，将透析袋中的混合物冻干，得到产物苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸。
[0060]
实施例7：
[0061]
将1.2883g 4-羧基-3-氟苯硼酸、1.1317g十八酸、2.1121g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.2622g n-羟基丁二酰亚胺投入60g二甲基亚砜和40g二氯甲烷中搅拌，得到混合物a，搅拌速率为500rpm，时间为60min，温度为常温。将1.0012gε-聚赖氨酸投入10g水中搅拌，搅拌速率为400rpm，时间为10min，温度为常温得到混合物b。将混合物a和混合物b混合搅拌，搅拌速率为500rpm，时间为2000min，温度为常温，得到混合物c。将混合物c装入透析袋，透析袋截留分子量为1000da，装有混合物c的透析袋置于水中透析，每隔一段时间将透析水换为新鲜水，每次换水时间间隔为8h，换水次数为8次，透析水体积为3
升。透析完毕后，将透析袋中的混合物冻干，得到产物苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸。
[0062]
实施例8：
[0063]
将10.0mg实施例4所得产物苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸常温浸泡在1g 0.2％猪胰岛素水溶液中，浸泡时间为60min，搅拌速率为250rpm。然后离心，离心转速为3000rpm，离心时间为20min。去除上清液，收集固体并冻干，获得负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒，胰岛素负载量为0.151(mg胰岛素)/(mg负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒)。
[0064]
如图2所示为该负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒的胰岛素累积释放曲线，采用400mg/dl的葡萄糖浓度模拟高血糖水平，采用100mg/dl的葡萄糖浓度模拟正常血糖水平，采用0mg/dl的葡萄糖浓度作为参照。葡萄糖浓度越高，胰岛素的释放越多；在正常血糖水平下，胰岛素释放率仅占总胰岛素负载量的不到30％。0.06mg负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒通过皮下注射的方式递送进入体重200g的糖尿病sd大鼠体内，2小时内将500mg/dl的高血糖水平降至50-200mg/dl的正常血糖水平，之后正常血糖水平可维持超过12小时。
[0065]
实施例9：
[0066]
将12.1mg实施例3所得产物苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸常温浸泡在1g含0.1％人胰岛素和0.2％猪胰岛素的水溶液中，浸泡时间为90min，搅拌速率为300rpm。然后离心，离心转速为3500rpm，离心时间为15min。去除上清液，收集固体并冻干，获得负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒。
[0067]
对比例1：
[0068]
将1.0780g 4-羧基-3-氟苯硼酸、1.1245g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.6739g n-羟基丁二酰亚胺投入100ml二甲基亚砜中搅拌，得到混合物a，搅拌速率为400rpm，搅拌时间为90min，搅拌的温度为常温。将1.0001gε-聚赖氨酸投入10ml水中搅拌，搅拌速率为400rpm，搅拌时间为10min，搅拌的温度为常温，得到混合物b。将混合物a和混合物b混合搅拌，搅拌速率为500rpm，搅拌时间为2000min，搅拌的温度为30℃，得到混合物c。将混合物c装入透析袋，透析袋截留分子量为1000da，装有混合物c的透析袋置于水中透析，每隔一段时间将透析水换为新鲜水，每次换水时间间隔为6h，换水次数为9次。透析完毕后，将透析袋中的混合物冻干，得到产物苯硼酸改性ε-聚赖氨酸，苯硼酸基团接枝率为65％。将10.0mg该苯硼酸改性ε-聚赖氨酸浸泡在1ml 0.128％人胰岛素水溶液中，浸泡时间为60min，浸泡的温度为常温，搅拌速率为250rpm。然后离心，离心转速为3000rpm，离心时间为20min。去除上清液，收集固体并冻干，获得负载胰岛素的苯硼酸改性ε-聚赖氨酸颗粒，胰岛素负载量为0.102(mg胰岛素)/(mg负载胰岛素的苯硼酸基ε-聚赖氨酸颗粒)。
[0069]
对比例1中的负载胰岛素的苯硼酸改性ε-聚赖氨酸颗粒的胰岛素累积释放率平衡值为(27.8
±
1.3)％(0mg/dl)与(36.6
±
1.5)％(100mg/dl)；实施例8中的负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒，其胰岛素累积释放率平衡值为(16.0
±
3.7)％(0mg/dl)与(25.2
±
3.2)％(100mg/dl)。可见在正常血糖(100mg/dl)或更低的血糖水平条件下，负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒比负载胰岛素的苯硼酸改性ε-聚赖氨酸颗粒更弱的胰岛素释放行为，因此可以更好地避免低血糖的产生。
[0070]
图3为实施例8中的负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒及相应对
比例的低血糖持续时间。其中ins为猪胰岛素，剂量为0.06mg，效价为1.65单位；det-ins为市售的诺和平地特胰岛素，用于缓解胰岛素治疗中的低血糖症状，剂量为0.165mg地特胰岛素，效价为1.65单位；pba-pl为对比例1负载胰岛素的苯硼酸改性ε-聚赖氨酸颗粒，含有0.05mg猪胰岛素，效价为1.38单位；pba/da-pl为实施例8负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒，含有0.06mg猪胰岛素，效价为1.65单位。将四者通过皮下注射的方式递送进入体重200g的糖尿病sd大鼠体内后，负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒的低血糖(《70mg/dl)持续时间既低于市售的猪胰岛素以及市售的用于缓解低血糖症的诺和平地特胰岛素，又低于负载胰岛素的苯硼酸改性ε-聚赖氨酸颗粒，证明负载胰岛素的苯硼酸/脂肪酸双改性ε-聚赖氨酸颗粒可以有效避免胰岛素治疗中的低血糖症状。