含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液及其制备方法与流程

1.本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及硫酸妥布霉素注射液，尤其涉及含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液及其制备方法。


背景技术：

2.妥布霉素，又名妥布拉霉素，是一种从链霉菌自然产生的氨基糖苷类抗生素，在低浓度下能抑杀革兰氏阴性菌，对绿脓杆菌有很强的抑制作用，比其他氨基糖苷类抗生素强2～8倍，被称为第二代氨基糖苷类抗生素。妥布霉素碱溶液浓度为10％时，其ph值为9-11，人体血液可接受的注射液ph值在7.35-7.45。为了在临床治疗中作为人体可接受的药品使用，妥布霉素碱需加入适量硫酸，制成妥布霉素硫酸盐，即硫酸妥布霉素，以用作针剂或注射液在临床治疗中使用。
3.氨基糖苷类抗生素能够与细菌体内核糖体发生不可逆的结合，阻断翻译过程，从而抑制蛋白质合成的途径来杀死细菌。妥布霉素的药物作用机理与其他氨基糖苷类抗生素类似，能够通过作用于细菌30s核糖体亚基的受体蛋白a位点结合从而抑制细菌蛋白合成，现代生物化学和分子生物学研究表明30s核糖体亚基与trna结合对蛋白质合成起关键作用，造成核糖体翻译过程受阻，进而影响蛋白质的合成。
4.妥布霉素对于第一代氨基糖苷类抗生素无效的假单胞菌和部分耐药菌具有较强的抑制能力，因此在临床上使用越来越受到重视，主要用于敏感细菌引起的严重感染，如革兰氏阴性菌特别是绿脓杆菌、大肠杆菌及肺炎杆菌等所引起的烧伤感染、败血症、呼吸系统感染、泌尿系统感染、胆囊胆道感染以及软组织严重感染等疾病。
5.但是，现有的硫酸妥布霉素注射液多存在以下问题，制约了其的应用和发展：(1)杂质含量高；(2)稳定性低，经过长期储存后ph下降，影响质量；(3)制备、纯化工艺难度大；(4)在临床应用中易导致肾毒性等不良反应；(5)治疗细菌感染时的疗效显著性待提高。
6.因此，亟需提供一种硫酸妥布霉素注射液及其制备方法，以解决上述问题。


技术实现要素：

7.为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，提供了一种含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液及其制备方法，通过添加特定抗氧化剂及改良工艺，显著降低了杂质的产生，同时改进了妥布霉素和二磷酸烟苷的纯化方法，提高了原料的纯度；通过联合使用二磷酸烟苷和妥布霉素，辅以各种作用的助剂，提高了注射液的药物稳定性和安全性，从而完成了本发明。
8.具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：
9.第一方面，提供了含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液，所述注射液由包括以下重量配比的原料制备：
10.妥布霉素
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80重量份
11.二磷酸烟苷
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0.2～2重量份
12.抗氧化剂
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2～6重量份。
13.第二方面，提供了第一方面含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
14.步骤i，加入注射用水，搅拌、充氮气；
15.步骤ii，依次加入抗氧化剂、稳定剂、二磷酸烟苷、缓冲剂、止痛剂和妥布霉素，搅拌溶解；
16.步骤iii，对步骤ii中的混合溶液进行吸附、过滤。
17.本发明所具有的有益效果包括：
18.(1)本发明提供的含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液，有利于提高生物体细胞内的二磷酸烟苷含量，增强硫酸妥布霉素的疗效；
19.(2)本发明提供的含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液，杂质含量低，稳定性和安全性均较高；
20.(3)本发明提供的含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液，对肾脏的损伤小，肾毒性较低；
21.(4)本发明提供的含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液的制备方法，改进了妥布霉素的纯化方法，进一步提高了妥布霉素的纯度；
22.(5)本发明提供的含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液的制备方法，辅酶i的纯度较高，副产物较少；
23.(6)本发明提供的含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液的制备方法，操作简单，条件易控，制得的注射液稳定性高，易于长期储存及运输。
具体实施方式
24.下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。
25.在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
26.辅酶i(nad)，化学名为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或二磷酸烟苷，在哺乳动物体内存在氧化型(nad
+
)和还原型(nadh)两种状态，是人体氧化还原反应中重要的辅酶。其参与各类细胞功能的新陈代谢，对机体免疫能力有重要作用。在健康状态下，人体内二磷酸烟苷浓度稳定，维持各项细胞正常功能。辅酶i对机体免疫能力有重要作用，在应激氧化压力和炎症反应时，线粒体内的二磷酸烟苷可以从细胞内释放出来。在细胞压力或者炎症情况下，二磷酸烟苷会通过溶解或非溶解机制释放到细胞外。如急性炎症情况下，二磷酸烟苷会被大量释放到炎症组织，随着细胞外的二磷酸烟苷浓度升高，免疫细胞会向炎症病灶聚集。
27.本发明人研究发现，在硫酸妥布霉素注射液中添加二磷酸烟苷，有利于提高生物体细胞内的二磷酸烟苷含量，使得sirtuins(去乙酰化酶)表达增多、活性增强，发挥细胞保护作用，从而增强硫酸妥布霉素的疗效。
28.基于上述研究，本发明首先提供了一种含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液，所述注射液由包括以下重量配比的原料制备：
29.妥布霉素
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80重量份
30.二磷酸烟苷
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0.2～2重量份
31.抗氧化剂
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2～6重量份。
32.优选地，所述注射液由包括以下重量配比的原料制备：
33.妥布霉素
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80重量份
34.二磷酸烟苷
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0.5～1.5重量份
35.抗氧化剂
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2.5～5.5重量份。
36.更优选地，所述注射液由包括以下重量配比的原料制备：
37.妥布霉素
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80重量份
38.二磷酸烟苷
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0.75～1.25重量份
39.抗氧化剂
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3～5重量份。
40.例如，所述注射液由包括以下重量配比的原料制备：
41.妥布霉素
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80重量份
42.二磷酸烟苷
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1重量份
43.抗氧化剂
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4重量份。
44.本发明人研究发现，现有的妥布霉素多由黑暗链霉素经深层发酵制备，主要产物为阿泊拉霉素，6"-o-氨甲酰卡那霉素b和6"-o-氨甲酰妥布霉素，后两者经水解分别生成卡那霉素b和妥布霉素。由于发酵产生的三个主要成分阿泊拉霉素、卡那霉素b和妥布霉素的理化性质相近，尤其是卡那霉素b和妥布霉素，结构仅差一个羟基，所以妥布霉素粗品的精制过程较为复杂，制备得到的产品纯度较低。
45.因此，本发明对妥布霉素的精制工艺进行了改进，以进一步提高妥布霉素产品的纯度。
46.根据本发明一种优选的实施方式，所述妥布霉素按照包括以下步骤的方法进行精制：
47.步骤1，对妥布霉素粗品溶液进行脱色处理。
48.在本发明中，所述妥布霉素粗品溶液可以通过将市售固体粗品溶解获得，例如，可以选用重庆大新药业通过黑暗链霉菌发酵生产的妥布霉素粗品，其为淡黄色粉末，纯度为55％左右。
49.根据本发明一种优选的实施方式，采用阴离子交换树脂对妥布霉素粗品溶液进行脱色，
50.所述妥布霉素粗品溶液的浓度为2.5～3.5mg/ml，ph为5～8。
51.优选地，所述妥布霉素粗品溶液的浓度为2.8～3.2mg/ml，ph为5～7。
52.例如，妥布霉素粗品溶液的浓度为3.0mg/ml，ph为6～7。
53.本发明人研究发现，妥布霉素粗品溶液的浓度在一定程度上影响了脱色效果，在ph为5～8，优选5～7，更优选6～7范围内，树脂的脱色能力较佳。当ph低于5时，树脂的脱色能力较低；当ph高于8时，会导致粗品溶液中的妥布霉素转变成阴离子状态，使得其被树脂吸附，降低妥布霉素的纯度。
54.在进一步优选的实施方式中，所述阴离子交换树脂为强碱型阴离子交换树脂，优选选自d201树脂、d202树脂、711树脂和717树脂中的一种或多种。
55.在更进一步优选的实施方式中，所述阴离子交换树脂为711树脂。
56.其中，711树脂为强碱性苯乙烯系i型阴离子交换树脂，具有较高的工作交换容量和较强的耐渗透应力，其为常见市售可得产品。本发明人研究发现，采用其对妥布霉素粗品溶液进行脱色，能够进行有效脱色。
57.根据本发明一种优选的实施方式，所述脱色过程的上样流速为4～8bv/h，优选为5～7bv/h，例如为6bv/h。
58.其中，树脂柱内装载树脂的体积称为床容积，bv表示树脂床体积，bv/h是指柱内单位时间(h)流经单位体积树脂的平均液量。
59.本发明人研究发现，阴离子交换树脂对妥布霉素粗品溶液的脱色效果，在上样流速为4～8bv/h，优选为5～7bv/h，尤其为6bv/h时最佳。当上样流速低于4bv/h时，虽然粗品溶液中的色素成分能够与树脂进行充分交换，但会增加脱色时间，降低脱色效率，增加成本；当上样流速高于8bv/h时，粗品溶液中的额色素还没来得及与树脂进行交换便随样品一同流出，造成脱色能力下降。因此，本发明中优选选择上样流速为4～8bv/h，优选为5～7bv/h，尤其为6bv/h。
60.步骤2，对步骤1处理后的溶液进行除杂纯化。
61.优选地，步骤2包括以下子步骤：
62.步骤2-1，将步骤1处理后的溶液用离子交换树脂进行吸附。
63.根据本发明一种优选的实施方式，采用混合离子交换树脂对溶液进行吸附，所述混合离子交换树脂选自d101树脂、d152树脂、d113树脂、d115树脂、hz-3c树脂、732树脂和hz-3b树脂中的两种或多种。
64.在进一步优选的实施方式中，所述混合离子交换树脂选自d152树脂、d113树脂、hz-3c树脂和hz-3b树脂中的两种或多种。
65.在更进一步优选的实施方式中，所述混合离子交换树脂由d113树脂和hz-3b树脂组成。
66.根据本发明一种优选的实施方式，所述d113树脂与hz-3b树脂的体积比为(1～4)：4，优选为(1～3)：4，更优选为1:4或2:4。
67.本发明人研究发现，将d113树脂与hz-3b树脂混合使用，相比于单独使用，对妥布霉素的吸附量和解析量均有不同程度的提高，说明二者混合使用产生了协同效应。
68.根据本发明一种优选的实施方式，在用离子交换树脂进行吸附之前，先调整步骤1处理后的溶液的ph。
69.在进一步优选的实施方式中，将溶液的ph调整至8～10，优选为8.5～9.5，更优选为9.0。
70.在调整好溶液的ph值后，用上述的离子交换树脂静态吸附至饱和。
71.在更进一步优选的实施方式中，所述上样流速为3～6bv/h，优选为3～5bv/h，例如可以为4bv/h。
72.本发明人研究发现，采用上述的流速进行上样，能够提高获得的妥布霉素的纯度。
73.步骤2-2，洗涤除去杂质。
74.根据本发明一种优选的实施方式，采用去离子水洗涤除去杂质，所述去离子水的体积为3～6bv，优选为3～5bv，如4bv。、
75.在本发明中，通过去离子水除去未发生离子交换的残留液和吸附力较弱的杂质。
76.步骤2-3，进行洗脱，并收集洗脱液。
77.根据本发明一种优选的实施方式，采用氨水进行洗脱，所述氨水的浓度为0.5～1.5mol/l，优选为0.8～1.2mol/l。
78.在进一步优选的实施方式中，所述洗脱为用氨水进行梯度洗脱。
79.其中，氨水属于较温和的碱性洗脱剂，利用妥布霉素在碱性条件下能够从正离子转变为游离碱，从而不带电荷，与弱酸树脂的功能基团羧基结合能力变弱，有利于妥布霉素的洗脱；同时，妥布霉素属弱碱性物质，使用氨水洗脱，避免了使用酸洗脱造成ph的波动，从而保护样品。
80.本发明人研究发现，采用浓度为0.5～1.5mol/l，优选为0.8～1.2mol/l的氨水进行梯度洗脱，能够显著提高妥布霉素的纯度。
81.在更进一步优选的实施方式中，所述洗脱体积为8～12bv，优选为10bv。
82.优选地，洗脱流速为1～3bv/h。
83.步骤2-4，对洗脱液进行处理，获得妥布霉素。
84.根据本发明一种优选的实施方式，所述对洗脱液进行处理包括对洗脱液进行回收溶剂、浓缩和干燥，
85.其中，在-0.05～-0.090mpa下进行上述处理。
86.在进一步优选的实施方式中，上述处理在50～70℃下进行，优选在55～65℃下进行。
87.在本发明中，所述浓缩为真空浓缩，干燥为喷雾干燥，本发明不对浓缩和干燥的工艺参数做特别限定，可以采用本领域常用的参数，本领域技术人员可以实现即可。
88.本发明人研究发现，现有的二磷酸烟苷(辅酶i)的分离纯化工艺较为复杂，得到的辅酶i的保存性能不佳，易发生变质，降低纯度，限定了其的广泛应用。因此，本发明中对辅酶i的纯化工艺进行了改善，提供了包括下述步骤的二磷酸烟苷的纯化方法：
89.步骤i，获取二磷酸烟苷粗品溶液。
90.在本发明中，所述辅酶i(二磷酸烟苷)的粗品可以市售获得，也可以由鲜酵母制备获得。
91.优选地，按照下述步骤获得：
92.首先，将鲜酵母加入盐酸溶液中，边搅拌边加入，加料完毕，加热至一定温度，保温一段时间，再降温，得酵母细胞破壁液；
93.然后，将酵母细胞破壁液进行过滤、沉淀、离心，得到辅酶i粗品溶液。
94.其中，在获得酵母细胞破壁液的步骤中，加入盐酸溶液的浓度为0.6～0.8mol/l，体积为鲜酵母的2～4倍；加热至55～60℃，保温12～18min，再降温至15～20℃。
95.在酵母细胞破壁液进行过滤、沉淀、离心前，先调整其ph至等电点3.0，蛋白质分子呈等电状态，菌体与核苷酸分离沉淀，除去蛋白质分子的水膜，则蛋白质分子互相凝聚、沉淀析出，经12000r/min高速离心分离后，制成辅酶i粗品溶液。
96.步骤ii，对二磷酸烟苷粗品溶液进行过滤。
97.根据本发明一种优选的实施方式，所述过滤为依次对粗品溶液进行微滤、超滤和纳滤。
98.在进一步优选的实施方式中，所述微滤采用陶瓷膜进行，陶瓷膜的孔径为110～
150nm，优选为120～140nm，例如130nm。
99.在更进一步优选的实施方式中，进行超滤的超滤膜截留分子量为2000d～2500d，优选为2100d～2400d，如2300d；
100.进行纳滤的纳滤膜截留分子量为280～400d，优选为310～380d，更优选为350d。
101.在本发明中，所述辅酶i粗品溶液经过上述的微滤、超滤和纳滤操作，得到含有辅酶i的细胞过滤液。
102.步骤iii，采用树脂对步骤ii中的过滤液进行层析分离。
103.优选地，步骤iii包括一下子步骤：
104.步骤iii-1，将步骤ii中的过滤液上柱进行树脂交换。
105.根据本发明一种优选的实施方式，所述树脂为hz816大孔树脂。
106.在进一步优选的实施方式中，所述过滤液的上样流速为30～40ml/min，优选为30～35ml/min，如32ml/min。
107.步骤iii-2，对树脂柱进行洗涤。
108.根据本发明一种优选的实施方式，采用去离子水对树脂柱进行洗涤。
109.在进一步优选的实施方式中，所述去离子水的洗涤速度为30～50ml/min，优选为35～45ml/min，如40ml/min。
110.在更进一步优选的实施方式中，所述去离子水的用量为4～6bv，优选为4.5～5.5bv，如5bv。
111.步骤iii-3，对树脂柱进行洗脱。
112.根据本发明一种优选的实施方式，所述洗脱为采用乙醇溶液洗脱，乙醇的浓度为9～15％，优选为11％～14％，更优选为12％。
113.在进一步优选的实施方式中，所述洗脱的速度为25～35ml/min，优选为25～30ml/min，更优选为28ml/min。
114.在本发明中，优选洗脱完成后，将洗脱液按照现有技术常用的方法将洗脱液进行沉淀、干燥，获得辅酶i。
115.本发明人研究发现，采用上述方法进行层析分离，有利于提高辅酶i的纯度，且能够降低副产物的生成。
116.一般情况下，硫酸妥布霉素注射液中溶解的微量的氧会降解妥布霉素，使得注射液的有效成分含量降低，造成品质不稳定，影响药效，因此，需要在注释液中添加抗氧化剂。
117.根据本发明一种优选的实施方式，所述抗氧化剂选自半胱氨酸、植酸、组氨酸二肽、亚硫酸钠、羟苯磺酸钙、亚硫酸氢钠、茶多酚和维生素c中的一种或多种。
118.在进一步优选的实施方式中，所述抗氧化剂选自半胱氨酸、植酸、羟苯磺酸钙、亚硫酸氢钠和维生素c中的一种或多种。
119.在更进一步优选的实施方式中，所述抗氧化剂为半胱氨酸、亚硫酸氢钠和羟苯磺酸钙的混合物。
120.优选地，所述半胱氨酸、亚硫酸氢钠和羟苯磺酸钙三者的重量比为1：(0.5～1.5)：(1～3)，优选为1：(0.8～1.2)：(1.5～2.5)，更优选为1：1：2。
121.其中，半胱氨酸为一种常见的氨基酸，安全性高，具有还原性，可以减缓妥布霉素的氧化降解，提高注射液的稳定性；同时，其氧化产物为胱氨酸，安全性也较高。
122.羟苯磺酸钙是一种强抗氧化剂，在减缓妥布霉素氧化的同时能够抑制因自由基产生酶活性增加而产生的氧化应激，减轻血管内皮损伤，抑制炎症反应，从而提高体内sod水平，保护肾小管和肾小球的功能，预防和降低肾脏损害，降低妥布霉素施用过程中的肾毒性。
123.本发明人研究发现，将上述三种抗氧化剂按照特定的比例(重量比为1：(0.5～1.5)：(1～3)，优选为1：(0.8～1.2)：(1.5～2.5)，更优选为1：1：2)混合使用，相对于单独使用，抗氧化能力显著增加，制备得到的硫酸妥布霉素注射液的稳定性显著提高。
124.根据本发明一种优选的实施方式，所述含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液的制备原料还包括稳定剂和缓冲剂；
125.其中，所述稳定剂选自乙二胺四乙酸二钠、甘露醇、聚乙二醇200和丙二醇中的一种或多种；
126.缓冲剂选自枸橼酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸二氢钾和磷酸二氢钠中的一种或多种。
127.在进一步优选的实施方式中，所述稳定剂选自乙二胺四乙酸二钠、聚乙二醇200和丙二醇中的一种或多种；
128.ph调节剂选自枸橼酸钠、磷酸二氢钾和磷酸二氢钠中的一种或多种。
129.优选地，所述稳定剂为乙二胺四乙酸二钠，缓冲剂为枸橼酸钠。
130.在更进一步优选的实施方式中，基于80重量份的妥布霉素，稳定剂的添加量为1～3重量份，优选为1.5～2.5重量份，更优选为2重量份；
131.基于80重量份的妥布霉素，缓冲剂的添加量为0.2～1.0重量份，优选为0.4～0.8重量份，更优选为0.6重量份。
132.本发明人研究发现，在硫酸妥布霉素注射液的应用过程中，会对注射部位造成局部刺激，患者疼痛感明显，因此，优选在注射液中加入止痛剂，以减轻疼痛，促进用药。
133.根据本发明一种优选的实施方式，所述止痛剂选自苯甲醇、三氯叔丁醇、盐酸普鲁卡因和利多卡因中的一种或多种。
134.在进一步优选的实施方式中，所述止痛剂为苯甲醇和/或盐酸普鲁卡因，优选为苯甲醇。
135.在更进一步优选的实施方式中，基于80重量份的妥布霉素，止痛剂的添加量为1～4重量份，优选为1.5～3重量份，更优选为2.5重量份。
136.根据本发明一种优选的实施方式，所述含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液的制备原料还包括ph调节剂，
137.所述ph调节剂包括硫酸溶液和氢氧化钠溶液。
138.在进一步优选的实施方式中，所述硫酸溶液的浓度为7％～15％，优选为8％～12％，例如10％；
139.所述氢氧化钠溶液的浓度为5％～15％，优选为7％～13％，例如10％。
140.本发明所述的含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液，杂质含量低，药物稳定性高。
141.本发明还提供了一种含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液的制备方法，所述方法包括以下步骤：
142.步骤i，加入注射用水，搅拌、充氮气。
143.根据本发明一种优选的实施方式，加入的注射用水的量为注射液总量的50～70％，优选为60％。
144.在进一步优选的实施方式中，所述充氮气的时间为10～20min，优选为15min。
145.步骤ii，依次加入抗氧化剂、稳定剂、二磷酸烟苷、缓冲剂、止痛剂和妥布霉素，搅拌溶解。
146.根据本发明一种优选的实施方式，所述抗氧化剂选自半胱氨酸、植酸、组氨酸二肽、亚硫酸钠、羟苯磺酸钙、亚硫酸氢钠、茶多酚和维生素c中的一种或多种。
147.在进一步优选的实施方式中，所述抗氧化剂选自半胱氨酸、植酸、羟苯磺酸钙、亚硫酸氢钠和维生素c中的一种或多种。
148.在更进一步优选的实施方式中，所述抗氧化剂为半胱氨酸、亚硫酸氢钠和羟苯磺酸钙的混合物。
149.优选地，所述半胱氨酸、亚硫酸氢钠和羟苯磺酸钙三者的重量比为1：(0.5～1.5)：(1～3)，优选为1：(0.8～1.2)：(1.5～2.5)，更优选为1：1：2。
150.根据本发明一种优选的实施方式，所述稳定剂选自乙二胺四乙酸二钠、甘露醇、聚乙二醇200和丙二醇中的一种或多种；
151.缓冲剂选自枸橼酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸二氢钾和磷酸二氢钠中的一种或多种。
152.在进一步优选的实施方式中，所述稳定剂选自乙二胺四乙酸二钠、聚乙二醇200和丙二醇中的一种或多种；
153.ph调节剂选自枸橼酸钠、磷酸二氢钾和磷酸二氢钠中的一种或多种。
154.优选地，所述稳定剂为乙二胺四乙酸二钠，缓冲剂为枸橼酸钠。
155.基于80重量份的妥布霉素，稳定剂的添加量为1～3重量份，优选为1.5～2.5重量份，更优选为2重量份；
156.基于80重量份的妥布霉素，缓冲剂的添加量为0.2～1.0重量份，优选为0.4～0.8重量份，更优选为0.6重量份。
157.根据本发明一种优选的实施方式，所述止痛剂选自苯甲醇、三氯叔丁醇、盐酸普鲁卡因和利多卡因中的一种或多种。
158.在进一步优选的实施方式中，所述止痛剂为苯甲醇和/或盐酸普鲁卡因，优选为苯甲醇。
159.在更进一步优选的实施方式中，基于80重量份的妥布霉素，止痛剂的添加量为1～4重量份，优选为1.5～3重量份，更优选为2.5重量份。
160.在本发明中，所述二磷酸烟苷和妥布霉素可以采用市售商品，也可以按照前述方法制备得到，优选采用前述方法制备得到。
161.基于80重量份的妥布霉素，二磷酸烟苷的添加量为0.2～2重量份，抗氧化剂的添加量为2～6重量份；
162.优选地，基于80重量份的妥布霉素，二磷酸烟苷的添加量为0.5～1.5重量份，抗氧化剂的添加量为2.5～5.5重量份；
163.更优选地，基于80重量份的妥布霉素，二磷酸烟苷的添加量为0.75～1.25重量份，抗氧化剂的添加量为3～5重量份；
164.例如，基于80重量份的妥布霉素，二磷酸烟苷的添加量为1重量份，抗氧化剂的添加量为4重量份。
165.本发明人研究发现，按照上述顺序依次加入特定比例范围的各个原料，实现了原料的分别溶解，显著降低了注射液的杂质含量，且提高了药物稳定性和安全性。
166.步骤iii，对步骤ii中的混合溶液进行吸附、过滤。
167.去除内毒素是注射液制备过程中的重要步骤，内毒素是由磷脂、脂多糖和蛋白质所组成的复合物，其中，脂多糖是内毒素的主要成分，具有特别强的热原活性。内毒素因其耐热性、滤过性、水溶性、不挥发性等特性，一般较难去除。
168.本发明经过大量研究，通过联合使用吸附、过滤的操作，显著提升了注射液中内毒素及有关物质的去除率，优选包括以下子步骤：
169.步骤iii-1，向溶液中加入活性炭进行吸附。
170.根据本发明一种优选的实施方式，基于100体积份的溶液，加入的进行吸附的活性炭为0.05～0.2重量份，优选为0.08～0.12重量份，更优选为0.1重量份。
171.其中，1体积份为1ml，1重量份为1g。
172.在进一步优选的实施方式中，加入活性炭后，采用ph调节剂调节ph值至4.1～4.5。
173.优选地，所述ph调节剂为10％的硫酸。
174.其中，加入硫酸是使妥布霉素成为硫酸妥布霉素的成盐过程。
175.步骤iii-2，粗滤除去活性炭。
176.根据本发明一种优选的实施方式，采用1μm钛棒过滤器过滤除去活性炭。
177.在进一步优选的实施方式中，待溶液澄清后，再依次用0.45μm过滤器过滤和0.22μm过滤器过滤至储液罐中。
178.步骤iii-3，采用滤膜进一步处理步骤iii-2处理后的溶液。
179.本发明人研究发现，内毒素在溶液中尺寸一般不会超过0.1μm，0.22μm的除菌滤膜对内毒素的去除效果不显著。因此，本发明中优选采用滤膜对溶液进一步处理。
180.根据本发明一种优选的实施方式，所述滤膜为超滤膜，优选为复合超滤膜。
181.在进一步优选的实施方式中，所述复合超滤膜由聚醚砜与聚偏氟乙烯复合得到。
182.在更进一步优选的实施方式中，所述复合超滤膜按照包括以下步骤的方法制备：
183.步骤iii-3-1，将聚醚砜与聚偏氟乙烯混合，制备共混溶液。
184.根据本发明一种优选的实施方式，所述聚醚砜与聚偏氟乙烯以二甲基乙酰胺为溶剂。
185.在进一步优选的实施方式中，所述聚偏氟乙烯与聚醚砜的重量比为5：(1～4)，优选为5：(1.5～3)，更优选为5:1.8。
186.本发明人研究发现，按照上述比例混合聚偏氟乙烯与聚醚砜，制备得到的复合超滤膜，截留率较高，能够显著降低细菌内毒素的含量。
187.在更进一步优选的实施方式中，所述混合的过程中还需添加添加剂，所述添加剂为聚乙烯吡咯烷酮，基于5重量份的聚偏氟乙烯，聚乙烯吡咯烷酮的添加量为6～10重量份，优选为7～9重量份，例如8重量份。
188.根据本发明一种优选的实施方式，所述混合条件为先初步加热搅拌，再升温搅拌至溶解。
189.在进一步优选的是实施方式中，所述初步加热为加热至30～50℃，保持25～50min，优选为加热至35～45℃，保持30～40min，更优选为加热至39～43℃，保持33～38min，例如加热至42℃，保持35min。
190.在更进一步优选的实施方式中，在初步加热过程中，搅拌速度为150～300r/min，优选为210～280r/min，更优选为250r/min。
191.本发明人研究发现，在上述温度范围内加热，且保持特定范围的搅拌速率，有助于聚偏氟乙烯与聚醚砜充分溶胀。
192.根据本发明一种优选的实施方式，所述升温达到的温度为70～85℃，优选为76～80℃，更优选为78℃。
193.在进一步优选的实施方式中，搅拌的转速为250～450r/min，优选为300～380r/min，更优选为320～360r/min，例如340r/min；
194.搅拌的时间为7～11h，优选为7.5～10h，更优选为8～9h，如8.5h。
195.在本发明中，经过上述的搅拌，有利于促进聚合物充分溶解，提高共混效果。
196.优选地，待上述聚合物充分溶解后，将得到的共混溶液在55～65℃下静置脱泡，优选在60℃下静置脱泡。
197.步骤iii-3-2，利用共混溶液制备复合超滤膜。
198.在本发明中，优选地，将玻璃板和刮刀洗净擦干，并与共混溶液的温度保持一致，将共混溶液倒在玻璃板的一端，用刮刀使其形成一层均匀的液膜，在25℃，相对湿度65％的条件下，预蒸发30s后，浸入水中；待初生膜从玻璃板上漂浮上来以后，用蒸馏水充分洗涤、浸泡，直至溶剂清洗干净。
199.根据本发明一种优选的实施方式，将洗干净的膜浸到丙三醇水溶液中处理，再烘干。
200.在进一步优选的实施方式中，所述丙三醇溶液中丙三醇与水的体积比为2：(2～5)，优选为2：(2～4)，更优选为2:3。
201.在更进一步优选的实施方式中，所述膜在丙三醇溶液中处理的时间为6～11h，优选为7～10h，更优选为8～9h；
202.所述烘干为在40～60℃下烘干，优选为在45～55℃下烘干，更优选为在52℃下烘干。
203.经过包括上述步骤的方法，制备得到复合超滤膜，以进一步处理药液。
204.本发明人研究发现，经过活性炭与复合超滤膜联合使用，可以显著提高对注射液中细菌内毒素的去除率。
205.步骤iv，对步骤iii中的溶液进行精滤、灌装和灭菌。
206.在本发明中，将步骤iii处理后的注射液，加入注射用水至全量，同时用ph调节剂调节ph为4.1～4.5，使妥布霉素充分成盐。
207.优选地，在步骤i～步骤iv的过程中，持续充氮气。
208.根据本发明一种优选的实施方式，所述精滤为将上述处理好的注射液用0.22μm的过滤器过滤，得到滤液。
209.在进一步优选的实施方式中，所述灌装为将滤液灌装于处理后的安瓿瓶中，然后熔封。
210.优选地，所述安瓿瓶的处理步骤为：依次使用循环水、清洁水、循环水、洁净压缩空气、降级水、洁净压缩空气、注射用水、洁净压缩空气对安瓿瓶进行清洗，然后再进行干燥灭菌。
211.在更进一步优选的实施方式中，所述灌装后的灭菌为115℃下灭菌20～40min，优选30min。
212.优选地，在灭菌后对安瓿瓶进行降温。
213.本发明人研究发现，高温长时间灭菌会影响硫酸妥布霉素的稳定性，因此，在灭菌完成后及时进行降温。
214.在灭菌完成后，按照本领域常规技术进行检漏、灯检，得到含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液。
215.本发明提供的含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液的制备方法，从源头上对原料药进行质量控制，在制备过程中对工艺调整优化，防止氧化，提高了注射液的稳定性，显著降低了杂质含量。同时，采用活性炭与滤膜联用的方法去除细菌内毒素，进一步提高了注射液的安全性，可操作性强。
216.实施例
217.以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
218.实施例1妥布霉素的制备
219.按照下述步骤制备妥布霉素：
220.(1)将妥布霉素粗品(重庆大新药业通过黑暗链霉菌发酵生产的妥布霉素粗品，其为淡黄色粉末，纯度为56.7％)制备为浓度为3.0mg/ml，ph为6～7的粗品溶液；
221.采用711树脂对其脱色，上样流速为6bv/h。
222.(2)将d113树脂与hz-3b树脂按体积比为1:4进行混合装柱，调整脱色后溶液的ph值至9.0，上样进行吸附，上样流速为4bv/h；
223.采用0.8～1.2mol/l的氨水进行梯度洗脱，洗脱体积为10bv，洗脱流速为2bv/h；
[0224]-0.05～-0.090mpa，60℃下，进行真空浓缩、喷雾干燥，获得妥布霉素。
[0225]
所述711树脂、d113树脂、hz-3b树脂购自上海华震科技有限公司。
[0226]
实施例2二磷酸烟苷的制备
[0227]
按照下述步骤制备二磷酸烟苷(辅酶i)：
[0228]
(1)将鲜酵母加入0.7mol/l的盐酸溶液中(盐酸溶液体积为鲜酵母的3倍)，边搅拌边加入，然后加热至58℃左右，保温15min，再降温至18℃，获得酵母细胞破壁液；
[0229]
将酵母细胞破壁液调整ph至等电点3.0，待沉淀析出后置于高速离心机离心(转速为12000r/min)，获得辅酶i粗品。
[0230]
(2)依次对粗品溶液进行微滤、超滤和纳滤，得到含有辅酶i的细胞过滤液；
[0231]
微滤采用陶瓷膜进行，陶瓷膜的孔径为130nm；超滤膜截留分子量为2300d，纳滤膜截留分子量为350d。
[0232]
(3)对细胞过滤液进行层析分离：
[0233]
将细胞过滤液上柱进行树脂交换，树脂为hz816大孔树脂，上样流速为32ml/min；
[0234]
采用去离子水对树脂柱进行洗涤，洗涤速度为40ml/min，用量为5bv；
[0235]
采用浓度为12％的乙醇进行洗脱，洗脱的速度为28ml/min。
[0236]
将洗脱液浓缩、干燥，得到二磷酸烟苷。
[0237]
hz816树脂购自上海华震科技有限公司。
[0238]
实施例3含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液的制备
[0239]
按照下述步骤制备含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液：
[0240]
(1)在储液罐中加入占总量60％的注射用水(1200ml)，开启搅拌，充氮气15min。
[0241]
(2)向储液罐中依次加入4g抗氧化剂(1g半胱氨酸、1g亚硫酸氢钠和2g羟苯磺酸钙的混合物)、2g乙二胺四乙酸二钠、1g二磷酸烟苷、0.6g枸橼酸钠、2.5g苯甲醇、80g妥布霉素，搅拌溶解。
[0242]
其中，妥布霉素由实施例1制备得到，二磷酸烟苷由实施例2制备得到。
[0243]
(3)向上述溶液中加入1.2g活性炭进行吸附，搅拌均匀，用10％的硫酸调节ph值至4.1～4.5；
[0244]
采用1μm钛棒过滤器过滤除去活性炭，待溶液澄清后，再依次用0.45μm过滤器过滤和0.22μm过滤器过滤；
[0245]
采用复合超滤膜进一步过滤，所述复合超滤膜按照以下步骤制备：
[0246]
将聚偏氟乙烯与聚醚砜按照重量比为5:1.8溶解在二甲基乙酰胺，再按照聚偏氟乙烯：聚乙烯吡咯烷酮的重量比为5:8添加聚乙烯吡咯烷酮，将上述混合体系加热至42℃，保持35min，搅拌速度为250r/min，使聚合物充分溶胀；
[0247]
然后，加热升温至78℃，转速设置为340r/min，充分搅拌8.5h使聚合物溶解；
[0248]
待上述聚合物充分溶解后，将得到的共混溶液在60℃下静置脱泡；
[0249]
将玻璃板和刮刀洗净擦干，并与共混溶液的温度保持一致，将共混溶液倒在玻璃板的一端，用刮刀使其形成一层均匀的液膜，在25℃，相对湿度65％的条件下，预蒸发30s后，浸入水中；待初生膜从玻璃板上漂浮上来以后，用蒸馏水充分洗涤、浸泡，直至溶剂清洗干净；
[0250]
将洗干净的膜浸到丙三醇溶液(丙三醇与水的体积比为2:3)中处理9h，然后在52℃下烘干。
[0251]
其中，聚偏氟乙烯、聚醚砜、二甲基乙酰胺和聚乙烯吡咯烷酮均购自山东英朗化工有限公司。
[0252]
(4)向上述处理后的注射液中，加入注释用水至2000ml，期间调节ph为4.1～4.5，然后用0.22μm的过滤器过滤；
[0253]
将上述滤液灌装于1000支安瓿瓶中，然后熔封、灭菌、检漏、灯检，得到注射液；
[0254]
其中，安瓿瓶的处理步骤为：依次使用循环水、清洁水、循环水、洁净压缩空气、降级水、洁净压缩空气、注射用水、洁净压缩空气对安瓿瓶进行清洗，然后再进行干燥灭菌；
[0255]
灌装后的灭菌为115℃下灭菌30min，然后对安瓿瓶降温。
[0256]
实施例4妥布霉素的制备
[0257]
本实施例中制备妥布霉素的方法与实施例1的方法相似，区别在于：步骤(2)中，d113树脂与hz-3b树脂的体积比为2:4。
[0258]
实施例5妥布霉素的制备
[0259]
本实施例中制备妥布霉素的方法与实施例1的方法相似，区别在于：步骤(2)中，上
样流速为3bv/h。
[0260]
实施例6妥布霉素的制备
[0261]
本实施例中制备妥布霉素的方法与实施例1的方法相似，区别在于：步骤(2)中，洗脱流速为3bv/h。
[0262]
实施例7二磷酸烟苷的制备
[0263]
本实施例中制备二磷酸烟苷的方法与实施例2的方法相似，区别在于：步骤(3)中，过滤液的上样流速为35ml/min。
[0264]
实施例8二磷酸烟苷的制备
[0265]
本实施例中制备二磷酸烟苷的方法与实施例2的方法相似，区别在于：步骤(3)中，过滤液的上样流速为35ml/min。
[0266]
实施例9二磷酸烟苷的制备
[0267]
本实施例中制备二磷酸烟苷的方法与实施例2的方法相似，区别在于：步骤(3)中，洗脱速度为25ml/min。
[0268]
实施例10含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液的制备
[0269]
本实施例中制备含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液的方法与实施例3中的方法相似，区别在于：步骤(2)中，向储液罐中依次加入6g抗氧化剂(1.5g半胱氨酸、1.5g亚硫酸氢钠和3g羟苯磺酸钙的混合物)、2.5g乙二胺四乙酸二钠、1.5g二磷酸烟苷、0.8g枸橼酸钠、2.5g苯甲醇、80g妥布霉素，搅拌溶解。
[0270]
实施例11含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液的制备
[0271]
本实施例中制备含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液的方法与实施例3中的方法相似，区别在于：步骤(3)中，复合超滤膜的制备过程中，将聚偏氟乙烯与聚醚砜按照重量比为5:3溶解在二甲基乙酰胺，再按照聚偏氟乙烯：聚乙烯吡咯烷酮的重量比为5:9添加聚乙烯吡咯烷酮。
[0272]
对比例
[0273]
对比例1硫酸妥布霉素注射液的制备
[0274]
本对比例中硫酸妥布霉素注射液的制备方法与实施例3中的方法相似，区别在于：不添加二磷酸烟苷。
[0275]
实验例
[0276]
实验例1妥布霉素的质量检测
[0277]
采用hplc柱前衍生化法测定实施例1、4～6中制备的妥布霉素的纯度，其中，
[0278]
衍生化条件为：2,4二硝基氟苯(10mg/l)10ml、tris缓冲液10ml和样品5ml置于50ml锥形瓶中，60℃水浴反应50min。
[0279]
色谱条件：色谱柱为gracesmart c
18
(4.6*250mm，5μm)；流动相：乙腈：0.25％三羟甲基氨基甲烷(67:33，v:v)；检测波长：365nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：20μl；时间：30min。
[0280]
检测结果如表1所示：
[0281]
表1
[0282]
样品实施例1实施例4实施例5实施例6纯度99.32％99.19％99.24％99.08％
[0283]
实验例2二磷酸烟苷的质量检测
[0284]
采用高效液相色谱法测定制备的辅酶i的含量，色谱条件如下：
[0285]
流动相：流动相a为乙腈，流动相b为0.2mol/l乙酸铵溶液；
[0286]
检测波长：254nm；
[0287]
流速：1ml/min；
[0288]
进样量：20μl；
[0289]
柱温：25℃；
[0290]
梯度洗脱如下：0min，100％b+0％a；20min，90％b+10％a；30min，35％b+65％a；45min，100％b+0％a；45.1min，结束。
[0291]
检测结果如表2所示：
[0292]
表2
[0293]
样品实施例2实施例7实施例8实施例9纯度98.79％98.66％98.57％98.13％
[0294]
实验例3含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液的稳定性检测
[0295]
取本发明实施例3、10、11的样品，以市售的硫酸妥布霉素注射液为对照样品，在室温，相对湿度60％条件下，分别于0、1、2、3、6、12月取样，测定含量、有关物质及细菌内毒素。
[0296]
含量测定、有关物质测定照中国药典2020版二部硫酸妥布霉素注射液的方法测定，含量测定的限度为90.0％～110.0％，有关物质单个杂质不得过1.5％，总杂质不得过2.0％。
[0297]
检测结果如表3所示，
[0298]
表3
[0299][0300]
由表3可知，与市售硫酸妥布霉素注射液相比，本发明实施例3、10和11的样品中有关物质的含量显著降低，且稳定性良好，适宜长期储存。
[0301]
实验例4含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液的细菌内毒素检测
[0302]
于12月取实施例3、10、11制备的样品，按照中国药典2020年版四部通则1143细菌
内毒素检查法进行细菌内毒素检测，结果如表4所示。
[0303]
表4
[0304]
样品实施例3实施例10实施例1112月＜2.0eu/mg＜2.0eu/mg＜2.0eu/mg
[0305]
由表4可以看出，本发明实施例所述方法制备的硫酸妥布霉素注射液，细菌内毒素含量较低，且经过长期的储存，仍然具有较高的质量，稳定性和安全性良好。
[0306]
实验例5含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液的肌肉刺激性实验
[0307]
取健康家兔8只，每只家兔左侧股四头肌内注射实施例3的注射液的生理盐水稀释液1ml，右侧注射同体积生理盐水。注射后观察注射部位肌肉有无充血、水肿等反应，半数家兔48h后放血处死，纵向切开皮肤，肉眼观察两侧注射部位有无充血、水肿等反应，并取其组织做病理检查。然后按下表5中的标准评价该注射液的刺激反应，剩余家兔继续观察14天，于第18天放血处死后重复上述操作。
[0308]
表5
[0309][0310][0311]
结果显示，家兔注射实施例3的注射液后，刺激反应为0级，肉眼观察注射部位肌肉无充血、水肿等反应，病理组织检测亦未见组织变性或坏死等明显性刺激反应，与生理盐水侧相比无显著差异。
[0312]
实验例6硫酸妥布霉素注射液的肾毒性检测
[0313]
选择普通级8周的雄性健康大鼠30只，体重210～230g。
[0314]
采用随机数字表法将30只大鼠分为a、b、c三组，a组每天腹腔注射实施例3制备的注射液，140mg/kg，注射7天；b组每天腹腔注射市售硫酸妥布霉素注射液(上海禾丰制药有限公司)，140mg/kg，注射7天；c组每天腹腔注射生理盐水3ml/kg，注射7天。
[0315]
各组大鼠在注射前取尿留样，并在第7天注射和灌胃结束后，分别放入代谢笼中留24小时取尿，测尿n-乙酰-d-氨基葡萄糖苷水平(nag)。
[0316]
各组大鼠在第8天取尾静脉血样检测scr(血清肌酐)和bun(尿素氮)，然后麻醉处死大鼠，取右肾制成10％肾皮质匀浆，测定超氧化物歧化酶(sod)和丙二醛(mda)。
[0317]
其中，尿nag使用n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶检测试剂盒(比色法)；scr测定使用血清肌酐测定试剂盒(酶终点法)；bun测定使用尿素氮测定试剂盒；sod活性变化使用超氧化物歧化酶测定试剂盒；mda测定使用丙二醛含量监测试剂盒。
[0318]
检测结果如表6和7所示。
[0319]
表6
[0320][0321]
表7
[0322]
组别sod(nu/mg)mda(nmol/mg)a组4.861.42b组3.042.06c组6.030.87
[0323]
由表6可以看出，a组的scr和bun水平显著低于b组，说明实施例3制备的注射液对肾脏具有保护作用；由表7可以看出，实施例3制备的注射液的施加，增强了sod的表达，减少mda的表达，减轻了肾毒性。
[0324]
实验例7硫酸妥布霉素注射液的杀菌效果检测
[0325]
采用实施例3和对比例1的样品进行铜绿假单胞菌杀灭效果检测，以生理盐水为对照。
[0326]
选择清洁级6～8周的雄性健康大鼠90只，随机分为3组，每组30只。
[0327]
将大鼠称重后，麻醉并固定于专用手术台，自颈部正中消毒，切开皮肤，钝性分离至暴露气管，用1ml注射器将0.2ml铜绿假单孢菌悬液(8*108cfu/ml)经气管缓慢注入后，将大鼠直立摇晃4min，使细菌尽量均匀分布于两肺。
[0328]
于接种4小时后，分别每24小时给药。第1组注射实施例3制备的含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液，第2组注射对比例1制备的硫酸妥布霉素注射液，第3组注射等量的生理盐水。
[0329]
分布于治疗后1、3、5、7天将大鼠处死后重复放血，取双肺，将左肺用冰生理盐水冲洗3次，置于玻璃匀浆器中加入2ml生理盐水研磨15min，制成肺组织匀浆，10倍比稀释肺组织匀浆，依次取各浓度100μl接种于mh琼脂培养基上，32℃孵育24h，选取菌落在30～300个之间的平板进行菌落计数，结果如表8所示。
[0330]
表8
[0331][0332]
由表6可知，第1组注射实施例制备注射液的杀菌效果优于第2组和第3组，表明本发明制备的含二磷酸烟苷的硫酸妥布霉素注射液在治疗细菌感染时，效果明显优于不含二磷酸烟苷的注射液，说明添加二磷酸烟苷能够显著增强硫酸妥布霉素的杀菌效果。
[0333]
以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。