具有三层核壳结构的复合材料及其制备方法和补钙制剂

1.本发明属于新材料技术领域，尤其涉及一种药物制剂，具体涉及一种具有三层核壳结构的复合材料及其制备方法和补钙制剂。


背景技术：

2.随着人口老龄化程度的加深，中老年人群中的骨质疏松患者也在逐渐增多，因钙摄入不足和流失加快而导致的骨质问题愈发突出，给社会带来沉重负担。在如今膳食钙摄入量普遍不足的当下，钙制剂便发挥了重要的作用，可以有效预防和治疗各种急慢性骨质疾病。目前市场上补钙制剂根据类型主要包括三类产品：无机钙盐、有机酸钙盐和有机钙盐。
3.无机钙盐主要有碳酸钙、磷酸氢钙、氢氧化钙、氯化钙等，这类补钙剂对胃酸分泌量少或有胃酸分泌障碍的人群具有较强的刺激作用，长期服用易产生便秘、结石等不适症状，因此不能盲目使用该类补钙剂，需要根据特定的人群进行选择。有机酸钙盐是有机酸与无机钙盐通过一系列反应制备的产物，如葡萄糖酸钙、乳酸钙、丙酮酸钙、枸橼酸钙、醋酸钙等，这类补钙剂的缺点是钙含量比较低，需要大量服用才能达到一定的提高骨密度效果。有机钙盐也叫螯合钙，是指氨基酸或多肽通过离子键、配位键或吸附作用等与钙离子进行螯合反应，生成氨基酸螯合钙或多肽螯合钙，多肽虽有利于促进钙的吸收，但可螯合于钙表面的多肽有限 (如图1所示)。因此，多肽螯合钙中多肽促进钙吸收的作用并不明显，相同钙含量情况下，服用螯合钙的剂量仍需较大。
4.因此，亟需研发一种更有利于促进钙吸收，补钙效果更佳，并适用于长期服用的健康补钙新材料。


技术实现要素：

5.本发明提出一种具有三层核壳结构的复合材料及其制备方法和补钙制剂，以解决现有技术中存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。
6.为克服上述技术问题，本发明的第一方面提供了一种复合材料。
7.具体的，所述复合材料具有三层核壳结构，其中：核心层为纳米碳酸钙，中间层为黄烷-3-醇聚合物，外壳层为多肽；所述黄烷-3-醇聚合物为桥键，接合所述纳米碳酸钙和所述多肽。
8.纳米碳酸钙具有成本低、安全、良好的生物相容性、ph敏感性以及生物降解性慢的特点，在生物医学研究上常被用作药物纳米载体。同时，纳米碳酸钙还可以被m细胞通过内吞作用而高效内化，使细胞内ca
2+
水平显著上升，且纳米碳酸钙颗粒可诱导成骨细胞分化，对成骨细胞增殖具有一定的促进作用。多肽则有利于促进骨矿物质元素，如钙、磷、锌等的吸收和在骨骼中的沉着以及促进骨细胞的活性。因此，从理论上分析，多肽能够通过配位反应与钙离子形成配位化合物，这也是大量的“多肽螯合钙”、“氨基酸螯合钙”合成过程的反应基础。以此申请人以鱼胶多肽和纳米碳酸钙直接反应，发现在纳米碳酸钙表面并未观察
到明显的多肽层(参见对比例1和图1所示)。同时，申请人将对比例1制得的鱼胶多肽-纳米碳酸钙的产物，进行水解处理后，使用hplc检测其中的游离氨基酸含量，结果发现产物中氨基酸的含量也较少，仅为0.27mg/g(参见表6所示)，从而进一步说明直接以鱼胶多肽和纳米碳酸钙制备的多肽螯合钙，其多肽与钙的接合效果并不理想。
9.基于此，本发明以纳米碳酸钙为核心层，黄烷-3-醇聚合物为中间层，多肽为外壳层，利用黄烷-3-醇聚合物为桥键，用于连接纳米碳酸钙与多肽，形成具有三层核壳结构的复合材料。研究发现：通过黄烷-3-醇聚合物对纳米碳酸钙进行表面改性，再接入多肽，相比于以多肽和纳米碳酸钙直接反应，可更有效的提高多肽在纳米碳酸钙表面的接合，从而更有利于促进钙离子的吸收效果，提高纳米碳酸钙的骨密度增强能力。
10.究其原因，主要是由于黄烷-3-醇聚合物是一种具有大量酚羟基的天然产物，广泛地分布于植物的根、茎、叶、果实中。研究发现，黄烷-3-醇聚合物中含有大量的酚羟基和苯环，且酚羟基主要是以邻苯二酚和联苯三酚的形式存在，因此，可同时与金属离子形成配位化合物，并与多肽相结合。具体反应过程如下：
11.(1)黄烷-3-醇聚合物与金属离子的配位反应
12.黄烷-3-醇聚合物具有大量的邻位酚羟基，这些邻位酚羟基解离后，能够和绝大多数金属离子通过离子键的形式键合，最终形成配位化合物，其反应过程如下：
[0013][0014]
其中：me
n+
表示金属离子。
[0015]
(2)黄烷-3-醇聚合物与多肽的结合反应
[0016]
黄烷-3-醇聚合物上既有大量的酚羟基(亲水)，又有大量的苯环(疏水)。酚羟基能够同多肽分子上的氨基(谷氨酸、天门冬氨酸)、羧基(赖氨酸、羟赖氨酸)侧键，形成氢键；苯环则能够同疏水性氨基酸形成疏水作用力。这种氢键
ꢀ‑
疏水作用力协同作用的方式，使黄烷-3-醇聚合物能够与大量的多肽发生牢固的结合，其反应示意图如图9所示。
[0017]
本发明正是利用黄烷-3-醇聚合物的以上两种化学反应特性，利用黄烷-3-醇聚合物在纳米碳酸钙与多肽间形成桥键，使纳米碳酸钙与多肽具有良好的接合效果。
[0018]
作为上述方案的进一步改进，所述复合材料的平均粒径为110-230nm，小粒径的复合材料，更有利于提高钙离子的吸收。
[0019]
作为上述方案的进一步改进，所述复合材料中氨基酸的含量为 33.89
±
0.11-104.21
±
1.00mg/g，高含量的氨基酸含量更有利补充骨胶原，提高骨骼的力学性能和机械性能。
[0020]
作为上述方案的进一步改进，所述黄烷-3-醇聚合物选自茶黄烷-3-醇聚合物、葡萄籽黄烷-3-醇聚合物、啤酒花黄烷-3-醇聚合物、苹果黄烷-3-醇聚合物、可可黄烷-3-醇聚合物中的至少一种。
[0021]
上述黄烷-3-醇聚合物的分子结构特点如图2所示，其中：图2-a为茶黄烷-3
‑ꢀ
醇聚合物的
13
cnmr图谱；图2-b为苹果黄烷-3-醇聚合物的
13
cnmr图谱；图 2-c为可可黄烷-3-醇
聚合物的
13
cnmr图谱；图2-d为葡萄籽黄烷-3-醇聚合物的
13
cnmr图谱；图2-e为啤酒花黄烷-3-醇聚合物的
13
cnmr图谱；图2-f为黄烷-3-醇c骨架标号。通过对图2的
13
cnmr信号进行归属，发现这些黄烷-3
‑ꢀ
醇聚合物具有相似的黄烷-3-醇特有的c6-c3-c6结构骨架(如图2-f)，各c信号归属结果如表1所示。
[0022]
表1：不同植物来源的黄烷-3-醇聚合物的
13
cnmr信号归属
[0023]
植物c4c3c2c6c8茶26.170.077.999.7107.2苹果37.072.976.696.597.9可可36.972.276.496.6100.5葡萄籽37.072.576.796.4100.8啤酒花56.070.777.2102.397.9植物c4-ac2’c5’c6’c1’茶110.6115.1116.5121.1130.6苹果100.5115.9116.7118.8131.9可可112.8115.7116.7118.0131.9葡萄籽102.7115.7116.7118.5131.8啤酒花107.6115.3116.2119.4132.6植物c3’c4’c8ac7c5茶133.0139.2156.2156.2156.4苹果132.4144.8154.5155.4156.4可可132.4144.8154.4155.3155.7葡萄籽132.4144.8154.5155.4155.7啤酒花132.6145.9155.1156.7156.7
[0024]
同时，使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof ms)分析了上述黄烷-3-醇聚合物的结构单元类型，进一步确定这些黄烷-3-醇聚合物的分子结构特点，结果如图3所示。其中：图3-a为茶黄烷-3-醇聚合物的maldi-tofms图谱；图3-b为苹果黄烷-3-醇聚合物的maldi-tof ms图谱；图3-c为可可黄烷-3-醇聚合物的maldi-tof ms图谱；图3-d为葡萄籽黄烷-3-醇聚合物的 maldi-tof ms图谱；图3-e为啤酒花黄烷-3-醇聚合物的maldi-tof ms图谱。
[0025]
由图3可以看出：茶黄烷-3-醇聚合物在m/z＝2050u、2338u、2625u、2912u、 3200u、3486u、3774u处，出现了离子峰，各峰之间等距间隔288u，说明茶黄烷
ꢀ‑
3-醇聚合物是以(表)儿茶素为结构单元的黄烷-3-醇聚合物。苹果黄烷-3-醇聚合物在m/z＝2049u、2338u、2625u、2913u、3199u、3490u、3791u，各峰之间间隔约为288u的质量数差异，说明苹果黄烷-3-醇聚合物是以(表)儿茶素(288u) 为结构单元的黄烷-3-醇聚合物。可可黄烷-3-醇聚合物在m/z＝601u、753u、889u、 1041u、1177u、1329u、1464u、1617u、1753u、1905u、2041u、2193u处出现了离子峰，各峰之间间隔152u质量数差异，说明可可多酚是以(表)棓儿茶素 (152u+152u＝304u)为结构单元的黄烷-3-醇聚合物。葡萄籽黄烷-3-醇聚合物在 m/z＝601u、753u、889u、1041u、1177u、1329u、1464u、1617u、1753u、1905u、 2041u、2193u处出现离子峰，各峰之间间隔288u质量数差异，说明葡萄籽和可可黄烷-3-醇聚合物具有高度相似的
分子结构，是以(表)棓儿茶素(152u+152u ＝304u)为结构单元的黄烷-3-醇聚合物。啤酒花多酚在m/z＝889u、1177u、1465u、 1753u、2041u处出现离子峰，各峰之间间隔288u的质量数差异，说明啤酒花多酚是以(表)儿茶素(288u)为结构单元的黄烷-3-醇聚合物。由
13
cnmr和 maldi-tof ms测试结果，可以推断出这些黄烷-3-醇聚合物的典型结构式如下：
[0026][0027]
由上述黄烷-3-醇聚合物的典型结构式可知：这些黄烷-3-醇聚合物具有大量的酚羟基和苯环，且酚羟基主要是以邻苯二酚和联苯三酚的形式存在。
[0028]
作为上述方案的进一步改进，所述多肽为鱼胶多肽，所述鱼胶多肽选自赤嘴鳘鱼胶多肽、黄姑鱼胶多肽、犬牙石首鱼胶多肽、斜纹大棘鱼胶多肽中的至少一种。这些多肽的分子量均小于20kda，为小分子肽，具有良好的促进钙吸收效果。
[0029]
本发明的第二方面提供了一种复合材料的制备方法。
[0030]
具体的，一种复合材料的制备方法，所述制备方法用于制备本发明所述的复合材料，包括以下步骤：
[0031]
(1)将纳米碳酸钙分散于水中，加入黄烷-3-醇聚合物搅拌反应，然后采用第一溶剂进行洗涤，得负载黄烷-3-醇聚合物的纳米碳酸钙；
[0032]
(2)将步骤(1)制得的负载黄烷-3-醇聚合物的纳米碳酸钙在所述第一溶剂中分散后，加入多肽，然后采用所述第一溶剂进行洗涤，得所述复合材料。
[0033]
作为上述方案的进一步改进，所述纳米碳酸钙和所述黄烷-3-醇聚合物的质量比为1：(1-200)；所述负载黄烷-3-醇聚合物的纳米碳酸钙与所述多肽的质量比为1：(1-30)。
[0034]
作为上述方案的进一步改进，所述复合材料的制备方法，包括以下步骤：
[0035]
(1)将1质量份纳米碳酸钙在5-2000质量份水中分散，加入1-200质量份黄烷-3-醇
聚合物，搅拌反应20-120min，然后采用第一溶剂进行洗涤，得负载黄烷-3-醇聚合物的纳米碳酸钙；
[0036]
(2)取1质量份步骤(1)制得的负载黄烷-3-醇聚合物的纳米碳酸钙在1-400 质量份的第一溶剂中充分分散，加入1-30质量份的多肽，然后采用第一溶剂进行洗涤，得所述复合材料。
[0037]
作为上述方案的进一步改进，所述纳米碳酸钙的制备过程为：
[0038]
将1质量份的氯化钙溶解于50-1500质量份的第二溶剂中，得氯化钙溶液；在10质量份的所述氯化钙溶液中加入0.2-3.8质量份的表面活性剂，经超声波处理后，得改性氯化钙溶液；
[0039]
将1质量份的碳酸盐溶解于10-1200质量份的第三溶剂中，得碳酸盐溶液；
[0040]
在所述改性氯化钙溶液中滴加1-150质量份的所述碳酸盐溶液，置于微波场中搅拌后进行离心处理，收集沉淀物并采用第四溶剂洗涤，然后在温度为750-850℃条件下进行加热干燥，得所述纳米碳酸钙。
[0041]
优选的，所述超声波处理的工艺参数为：频率为10-30khz、功率为100-140w，处理时间为20-40min。
[0042]
优选的，所述微波场的工艺参数为：频率为2000-3000mhz、功率为80-120w，温度为20-30℃，处理时间为12-90min。
[0043]
优选的，所述离心处理的工艺参数为：离心力为7000-9000g，温度为0-20℃，时间为20-40min。
[0044]
优选的，所述表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠、脂肪醇醚硫酸钠、仲烷基磺酸钠中的至少一种。
[0045]
优选的，所述碳酸盐选自碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾中的至少一种。
[0046]
优选的，所述第一溶剂和第四溶剂选自甲醇、丙酮、乙醇、乙腈中的至少一种。
[0047]
进一步优选的，所述第一溶剂选自20wt％甲醇水溶液、5wt％丙酮水溶液、 30wt％乙醇水溶液、20wt％乙腈水溶液中的至少一种。
[0048]
优选的，所述第二溶剂选自乙二醇、聚乙二醇(缩写：peg)-200、peg-400、 peg-600、peg-1450、peg-3350、peg-4000、peg-8000中的至少一种。
[0049]
进一步优选的，所述第二溶剂选自乙二醇、peg-200(40wt％水溶液)、 peg-400(40wt％水溶液)、peg-600(40wt％水溶液)、peg-1450(40wt％水溶液)、peg-3350(40wt％水溶液)、peg-4000(20wt％水溶液)、peg-8000 (10wt％水溶液)中的至少一种。
[0050]
优选的，所述第三溶剂选自聚丁二酸丁二醇酯(缩写：pbs)缓冲液、3-(n
‑ꢀ
吗啉)丙磺酸(缩写：mops)缓冲液中的至少一种。
[0051]
进一步优选的，所述第三溶剂选自pbs缓冲液(0.8m)、mops缓冲液(1.0m) 中的至少一种。
[0052]
本发明的第三方面提供了一种复合材料的应用。
[0053]
具体的，一种补钙制剂，所述补钙制剂中含有本发明所述的复合材料。
[0054]
本发明的上述技术方案相对于现有技术，至少具有如下技术效果或优点：
[0055]
本发明的复合材料具有三层核壳结构，其中：纳米碳酸钙为核心层，黄烷-3
‑ꢀ
醇聚合物为中间层，多肽为外壳层；利用黄烷-3-醇聚合物中含有的大量酚羟基和苯环，且酚羟
基主要以邻苯二酚和联苯三酚的形式存在，可在纳米碳酸钙与多肽间形成桥键，用于连接纳米碳酸钙与多肽，以有效提高多肽在纳米碳酸钙表面的接合，从而促进钙离子的吸收效果，提高纳米碳酸钙的骨密度增强能力。本发明所制备的复合材料，其粒径为110-230nm，氨基酸的含量为 33.89
±
0.11-104.21
±
1.00mg/g；作为补钙制剂时，可明显提高骨骼的力学性能和机械性能，具有良好的补钙效果。
附图说明
[0056]
图1为对比例1制得的纳米碳酸钙-鱼胶多肽的tem图；
[0057]
图2为黄烷-3-醇聚合物的
13
cnmr图谱以及黄烷-3-醇c骨架标号；
[0058]
图3为黄烷-3-醇聚合物的maldi-tof ms图谱；
[0059]
图4为实施例1制得的纳米碳酸钙-黄烷-3-醇聚合物-鱼胶多肽的tem图；
[0060]
图5为实施例1制得的纳米碳酸钙-黄烷-3-醇聚合物-鱼胶多肽的xrd图；
[0061]
图6为实施例1制备纳米碳酸钙-黄烷-3-醇聚合物-鱼胶多肽的合成反应路径和对应的sem图、tem-元素能谱分析结果；
[0062]
图7为服用实施例1和对比例1-4的样品的大鼠股骨的生物力学性能图；
[0063]
图8为服用实施例1和对比例1-4的样品的大鼠股骨的micro-ct检测结果；
[0064]
图9黄烷-3-醇聚合物与多肽的结合反应示意图。
具体实施方式
[0065]
下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。
[0066]
实施例1
[0067]
一种复合材料，具有三层核壳结构，其中：核心层为纳米碳酸钙，中间层为茶黄烷-3-醇聚合物，外壳层为赤嘴鳘鱼胶多肽；茶黄烷-3-醇聚合物为桥键，接合纳米碳酸钙和赤嘴鳘鱼胶多肽。
[0068]
一种复合材料的制备方法，包括以下步骤：
[0069]
(1)将1质量份氯化钙溶解于50质量份乙二醇中，得氯化钙溶液；
[0070]
(2)将1质量份碳酸钠溶解于10质量份pbs缓冲液(0.8m)中，得碳酸钠溶液；
[0071]
(3)将步骤(1)制得的氯化钙溶液10质量份与0.2质量份的十二烷基苯磺酸钠混合，在20khz、120w功率的超声波场中处理30min；然后向其中滴加 1质量份步骤(2)制得的碳酸钠溶液，置于2450mhz、100w功率、25℃的微波场中搅拌反应12min，在离心力1000g，0℃条件下离心处理30min，收集沉淀并使用甲醇洗涤3次，转移至800℃马弗炉中加热干燥，得纳米碳酸钙；
[0072]
(4)将1质量份步骤(3)制得的纳米碳酸钙在5质量份水中分散，加入1 质量份茶黄烷-3-醇聚合物，搅拌反应20min；然后使用20wt％甲醇水溶液洗涤，洗涤结束后，获得表面
负载黄烷-3-醇聚合物的纳米碳酸钙；
[0073]
(5)将1质量份步骤(4)制得的表面负载黄烷-3-醇聚合物的纳米碳酸钙在1质量份20wt％甲醇水溶液中充分分散，加入5质量份赤嘴鳘鱼胶多肽，利用 20wt％甲醇水溶液洗涤，获得本实施例的纳米碳酸钙-黄烷-3-醇聚合物-鱼胶多肽复合材料。
[0074]
实施例1制得的纳米碳酸钙-黄烷-3-醇聚合物-鱼胶多肽复合材料的tem图如图4所示，其合成反应路径和对应的sem图、tem-元素能谱分析结果如图6 所示。由图4和6可以看出，实施例1制得的复合材料的最外层具有明显的多肽层，中间接合部分为黄烷-3-醇聚合物；且所制得的复合材料中钙元素的质量占比为21.08％，氮元素的质量占比为1.88％，氧元素的质量占比为25.18％，碳元素的质量占比为43.09％。
[0075]
实施例2-15
[0076]
实施例2-15与实施例1的区别在于：复合材料的制备工艺参数、各原料的具体选择与用量不同，具体如表2-3所示。
[0077]
表2：实施例2-15的纳米碳酸钙的制备条件
[0078]
[0079][0080]
表3：实施例2-15的复合材料的制备条件
[0081]
[0082][0083]
对比例1
[0084]
一种复合材料的制备方法，包括以下步骤：
[0085]
(1)将1质量份氯化钙溶解于50质量份乙二醇中，得氯化钙溶液；
[0086]
(2)将1质量份碳酸钠溶解于10质量份pbs缓冲液(0.8m)中，得碳酸钠溶液；
[0087]
(3)将步骤(1)制得的氯化钙溶液10质量份与0.2质量份的十二烷基苯磺酸钠混合，在20khz、120w功率的超声波场中处理30min；然后向其中滴加 1质量份步骤(2)制得的碳酸钠溶液，置于2450mhz、100w功率、25℃的微波场中搅拌反应12min，在离心力1000g，0℃条件下离心处理30min，收集沉淀并使用甲醇洗涤3次，转移至800℃马弗炉中加热干燥，得纳米碳酸钙；
[0088]
(4)将1质量份步骤(3)制得的纳米碳酸钙在1质量份20wt％甲醇水溶液中充分分散，加入5质量份赤嘴鳘鱼胶多肽，利用20wt％甲醇水溶液洗涤，获得本对比例的纳米碳酸钙-鱼胶多肽复合材料。
[0089]
对比例1与实施例1的区别仅在于：对比例1以鱼胶多肽和纳米碳酸钙直接反应，未添加茶黄烷-3-醇聚合物。
[0090]
对比例1制得的纳米碳酸钙-鱼胶多肽复合材料的tem图如图1所示，由图 1可知，纳米碳酸钙表面并未观察到明显的多肽层。
[0091]
对比例2
[0092]
对比例2为实施例1制得的纳米碳酸钙。
[0093]
对比例3
[0094]
对比例3为市售的碳酸钙。
[0095]
对比例4
[0096]
对比例4为空白组水。
[0097]
性能测试
[0098]
1.粒径和衍射峰位置
[0099]
利用xrd分析了实施例1-15所制得的纳米碳酸钙-黄烷-3-醇聚合物-鱼胶多肽复合材料样品的衍射峰位置，其中：实施例1的样品的xrd图如图5所示，由图5可知，样品的衍射峰说明晶面结构与球霰石晶面一致；并采用动态光散射 (dls)测试了样品的颗粒大小(平均粒径)，测试结果如表4所示。
[0100]
表4：实施例1-15的样品的平均粒径和xrd衍射峰
[0101][0102][0103]
2.氨基酸含量
[0104]
将实施例1-15和对比例1制得的样品，采用酸降解-hplc分析，测试了其中的氨基酸含量，结果如表5所示。
[0105]
表5：实施例1-15和对比例1制得的样品中氨基酸含量
[0106]
样品氨基酸总含量(mg/g)实施例133.89
±
0.11实施例244.26
±
1.24
实施例353.18
±
3.12实施例455.21
±
1.28实施例556.73
±
0.11实施例663.22
±
0.41实施例761.45
±
0.33实施例866.81
±
0.47实施例972.64
±
0.35实施例1083.11
±
2.71实施例1189.68
±
1.99实施例1294.04
±
1.63实施例13100.08
±
2.56实施例14100.02
±
1.42实施例15104.21
±
1.00对比例10.27
±
0.00
[0107]
由表5可知，实施例1-15制得的纳米碳酸钙-黄烷-3-醇聚合物-鱼胶多肽复合材料中的氨基酸含量为33.89
±
0.11-104.21
±
1.00mg/g，远远高于对比例1制得的鱼胶多肽-纳米碳酸钙中的氨基酸含量0.27mg/g。由此可知，利用黄烷-3-醇聚合物为桥键，连接纳米碳酸钙与多肽，能够有效的提高多肽在纳米碳酸钙表面的接合效果。
[0108]
此外，实施例1与对比例1中每种氨基酸的具体含量如下表6所示。
[0109]
表6：实施例1和对比例1制得的样品中氨基酸的具体含量
[0110][0111]
补钙效果实验：
[0112]
以实施例1和对比例1-4所制得的样品为补钙制剂，对12周的sd大鼠进行灌胃8周处理，灌胃量为300mg/kg体重/天，每天一次，灌胃结束后，对sd 大鼠进行股骨的生物力学测试和股骨的micro-ct分析，具体方法如下：
[0113]
(1)股骨生物力学测试
[0114]
取脱脂烘干后的左股骨，采用万能试验机的三点弯曲模式测试大鼠股骨的生物力学性能。参照标准弯曲力学性能实验方法yb/t 5349-2014，将万能试验机的中心压头向下行进速率设置为1mm/min；跨距设置为10mm，直到骨头断裂为止，记录压头位移以及过程中的压力变化，其力学性能测试结果如图7和表7所示。
[0115]
表7：灌胃实施例1与对比例1-4的样品的大鼠的股骨物理机械性能
[0116]
样品最大载荷(n)弯曲模量(mpa)弯曲强度(mpa)实施例182.02
±
0.23a555.0
±
28.30a61.2
±
4.25a对比例149.39
±
5.57b384.5
±
23.30c27.7
±
0.85c对比例295.32
±
1.63a547.0
±
15.60
ab
50.35
±
4.31
ab
对比例383.70
±
6.37a442.5
±
43.10
bc
31.60
±
2.96c对比例463.14
±
0.32b426.5
±
0.71c46.22
±
4.40b[0117]
(2)股骨的micro-ct分析
[0118]
取新鲜剥离的右股骨，清理干净，以4％多聚甲醛溶液固定1周后，使用 micro-ct系统对股骨干骺端进行三维重建扫描，观察区域选取股骨的骨松质区域，计算该区域的骨密度(bmd，g/cm3)和骨微观结构参数：骨体积分数 (bv/tv，％)、骨小梁数目(tb.n，1/mm)，测试结果如图8和表8所示。
[0119]
表8：灌胃实施例1与对比例1-4的样品的大鼠骨密度性能
[0120]
样品骨体积分数bv/tv(％)骨小梁数目(tb.n)实施例123.442.48对比例120.142.30对比例219.782.39对比例319.131.80对比例416.631.86
[0121]
由图7和图8及表7和表8可以看出，利用实施例1所获得的样品灌胃大鼠，其股骨物理机械性能明显优异于其它样品，在相同位移条件下，荷载力最大，说明股骨最为“结实”。利用micro-ct发现，实施例1样品灌胃后，大鼠的骨体积分数和骨小梁数目，明显大于其它样品，说明实施例1具有比碳酸钙、纳米碳酸钙、葡萄糖酸钙更强的补钙效果。
[0122]
对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下还可以做出若干简单推演或替换，而不必经过创造性的劳动。因此，本领域技术人员根据本发明的揭示，对本发明做出的简单改进都应该在本发明的保护范围之内。上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。