体外修饰的血小板对于血管损伤的治疗作用的制作方法

本发明属于医药，具体涉及体外修饰的血小板对于血管损伤的治疗作用。

背景技术：

1、血管内膜增生是动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病的共同病理特征，也是导致血管重建手术再狭窄的首要原因。近年来，经皮冠状动脉介入治疗(percutaneouscoronary intervention,pci)已广泛用于治疗血管壁粥样硬化引起的冠状动脉狭窄。然而，有相当一部分患者术后发生病变处血管的再狭窄，从而降低了pci的疗效，也大大增加再发急性心血管事件的风险。尽管采用药物洗脱支架取代裸金属支架并联合抗血小板和他汀类药物已明显降低不良心血管事件发生率，患者术后5年血管畅通率仍低于50％。因此，如何有效抑制血管内膜增生是当前心血管领域亟待解决的重要问题。研究表明，血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,vsmcs)去分化引起的增殖、迁移及细胞外基质分泌是新生内膜增生最显著特征。因此，如何有效抑制vsmc增殖引起的血管内膜增生是血管增生疾病防治的重要途径。

2、自体移植以其免疫原性低、寿命长、结合特异性好等特点，目前被广泛认为是较好的治疗药物载体。血小板作为巨核细胞释放的囊泡样无核细胞，在外周血中含量最高。由于其寿命相对较短，大约8到10天，机体每天产生数十亿新的血小板以维持血小板的正常数量。较外泌体等囊泡而言，血小板的体积和表面积相对大，更有利于药物的高效装载。根据血小板的特性，在血管损伤部位，血小板能特异性聚集到损伤部位。此外，根据申请人前期研究发现，血小板能将自身mirna转移至血管平滑肌细胞，通过调控细胞内靶基因的表达，而影响细胞功能，调控血管稳态。这提示，通过体外修饰的方式，使血小板特异性负载药物或者某些mirna，可能是血管损伤修复更为有效的治疗方式。

3、目前，制备负载药物的血小板，主要通过体外对巨核细胞(mks)进行基因修饰，从而获得负载药物的血小板(10.1021/acs.nanolett.8b02321)。该方法虽然能产生大量负载药物的类血小板，然而这些类血小板的活性和功能与体内血小板存在明显差异。因此，如何高效获得负载mirna的血小板是目前亟待解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于为血管损伤修复，提供新的，更为有效的靶向治疗药物。

2、本发明所采取的技术方案是：

3、本发明的第一方面，提供一种组合物，包括mir-223类似物和血小板。

4、在本发明的一些实施方式中，所述mir-223类似物的浓度为100～400nm。

5、在本发明的一些实施方式中，所述血小板的浓度为1×106～1×109个/ml。

6、在本发明的一些实施方式中，所述mir-223类似物为agomir-223和/或mirna-223mimics。

7、本发明的第二方面，提供本发明第一方面所述组合物的制备方法，通过将血小板和mir-223类似物混合孵育，即可使血小板负载高水平的目标mirna。

8、孵育过程中，在不影响血小板功能情况下，游离的mir-223类似物就能进入血小板，且无需添加任何辅助转染试剂。

9、在本发明的一些实施方式中，所述血小板的制备方法为：首先用缓冲液稀释全血，离心后收集上清液中的血小板，加入前列腺素e1，离心收集沉淀。

10、在本发明的一些实施方式中，所述离心后收集上清液中的血小板的条件为：1100～1300rpm离心15～20min。

11、在本发明的一些实施方式中，所述加入前列腺素e1后离心的条件为：2500～3500rpm离心4～6min。

12、在本发明的一些实施方式中，孵育的时间为：4h～8h；若孵育时间过短，则孵育效果不好，若孵育时间过长，会导致血小板形态明显发生变化。

13、本发明的第三方面，提供本发明第一方面所述的血小板或本发明第二方面所述的制备方法制得的组合物在制备产品中的应用。

14、在本发明的一些实施方式中，所述产品的功能为如下任一种：

15、(1)逆转平滑肌细胞过度增殖；

16、(2)防治内膜增生性血管疾病；

17、(3)血管损伤修复；

18、(4)作为靶向药物载体。

19、在本发明的一些实施方式中，所述血管损伤具体为动脉血管损伤。

20、在本发明的一些实施方式中，所述产品为药物。

21、本发明的第四方面，提供一种产品，包含本发明第一方面所述的组合物。

22、在本发明的一些实施方式中，所述产品为药物。

23、在本发明的一些实施方式中，所述药物中还可以包含一种或多种药学上可接受的辅料。

24、在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型可以为注射剂、散剂、胶囊剂、片剂、口服剂、丸剂、滴剂、混悬剂、颗粒剂、冲剂、滴剂、丹剂、粉剂、溶液剂等常见的药物剂型。

25、本发明的有益效果是：

26、本发明通过将血小板与agomir-223体外共培养，实现短期，且不影响血小板功能情况下，对血小板内容物——mirna体外修饰的良好方式；该方法可以在4-8h内完成，简单快捷，达到很好的体外修饰效果；通过实验发现，体外修饰的血小板能够明显在短期内明显逆转平滑肌细胞过度增殖，达到较好的治疗效果，说明mirna体外修饰的血小板有望作为内膜增生性血管疾病较好的靶向治疗药物，为血管损伤修复提供良好的治疗方案。

技术特征：

1.一种组合物，包括mir-223类似物和血小板。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述mir-223类似物为agomir-223和/或mirna-223mimics。

3.根据权利要求1～2任一项所述的组合物，其特征在于，所述mir-223类似物的浓度为100～400nm。

4.根据权利要求1～2任一项所述的组合物，其特征在于，所述血小板的浓度为1×106～1×109个/ml。

5.权利要求1～4任一项所述的组合物的制备方法，通过将血小板和mir-223类似物混合。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述血小板的制备方法为：首先用缓冲液稀释全血，离心后收集上清液中的血小板，加入前列腺素e1，离心收集沉淀。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述混合的方式为共孵育；所述孵育的时间优选为4～8h。

8.权利要求1～4任一项所述的组合物或权利要求5～7任一项所述的制备方法制得的组合物在制备产品中的应用；优选地，所述产品的功能为如下任一种：

9.一种产品，包含权利要求1～4任一项所述的组合物。

10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述产品还包含一种或多种药学上可接受的辅料。

技术总结
本发明公开了体外修饰的血小板对于血管损伤的治疗作用，本发明通过将血小板与AgomiR‑agomiR‑223体外共培养，实现短期，且不影响血小板功能的血小板miRNA体外修饰的良好方式；该方法可以在4‑8h内完成，简单快捷，达到很好的体外修饰效果；通过实验发现，体外修饰的血小板能够明显在短期内明显逆转平滑肌细胞过度增殖，达到较好的治疗效果，说明miRNA体外修饰的血小板有望作为内膜增生性血管疾病较好的靶向治疗药物，为血管损伤修复提供良好的治疗方案。

技术研发人员：邓伟豪,张媛,贾翠萍,郭漫丽,陈乾
受保护的技术使用者：广州市妇女儿童医疗中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12