能够同时抗白细胞介素1和肿瘤坏死因子炎症的纳米材料及其制备方法与应用

本发明涉及一种能够同时抗白细胞介素1和肿瘤坏死因子炎症的纳米材料及其制备方法与应用，属于医药。

背景技术：

1、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，ra)属于自身免疫性疾病，是一种慢性炎症性疾病，可以引起关节发炎、滑膜增生、血管翳形成、骨骼和软骨破坏等。严重者会引发心血管、肺、心理和骨骼疾病。目前类风湿性关节炎治疗的临床用药主要有非甾体抗炎药、糖皮质激素和改善病情抗风湿药。改善病情抗风湿药包括传统的改善病情抗风湿药、免疫抑制剂和生物类改善病情抗风湿药。生物制剂以抑制类风湿性关节炎炎症进程相关的细胞因子为主，可有效抑制类风湿性关节炎发病过程中的炎症反应。

2、类风湿性关节炎发作过程中，关节处的白细胞介素1(il-1)含量明显升高，并进一步引发局部的炎症反应。通过白细胞介素1受体拮抗剂(il1ra)抑制il-1受体与il-1的结合，可抑制il-1导致的炎症反应，有效减缓病情发展。肿瘤坏死因子-α(tnf-α)是一种多功能细胞因子，在类风湿性关节炎中起关键作用。在类风湿性关节炎发展过程中，1型辅助性t细胞和巨噬细胞分泌的tnf-α激活滑膜成纤维细胞，促进表皮增生，募集炎症细胞。tnf-α抑制剂是现有证据较为充分、应用较为广泛的治疗ra的生物类dmards。

3、然而，有些患者对单一的一种生物制剂尤其是tnf、il-1抗体治疗会产生严重的耐受性。且游离的il-1ra和stnfri在体内半衰期短，血液循环时间普遍很短，还存在在炎症关节富集量低，疗效较差的缺陷。

4、纳米药物一般以纳米为载体装载各种药物。纳米材料不仅便于合成，而且大部分材料在体内具有很好的可降解性。聚乙二醇(polyethylene glycol,peg)具有良好的水溶性和生物相容性，是目前已知的蛋白和细胞吸附水平最低的合成高分子材料。peg经代谢会直接被排出体外，经peg修饰的聚合物材料应用到载药微球、胶束等时，能有效避免被res系统吞噬从而实现在体内的长循环。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolicacid,plga)是由两种单体乳酸(la)和羟基乙酸(ga)随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物。plga水解以后的产物是乳酸和羟基乙酸，可参与人体的新陈代谢，最终形成二氧化碳和水被排出体外。美国食品药品监督管理局(fda)已经认定plga具有良好的生物相容性和安全性，被广泛应用于人类的临床医学研究。

5、有研究者使用聚乙二醇化可溶性肿瘤坏死因子受体i型(peg-stnfri)治疗慢性炎症性疾病。并且他们的临床i/ii期和早期iii期数据表明peg-stnfri是非免疫原性的，每周使用该药物可以缓解类风湿性关节炎患者的关节痛和关节肿胀。peg-stnfri的其他临床试验正在进行中，以确定最佳剂量和时间，并进一步评估peg-stnfri的疗效、安全性和潜在免疫原性。

6、虽然目前已经成功设计出许多运输蛋白的策略，但也经常受到蛋白活性降低的限制，因此在设计新疗法时应仔细考虑生物材料融合对受体结合亲和力的影响。目前，国内外均无专利或文献报道将il-1ra和stnfri进行整合的产品和方法。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种同时连接il-1ra和stnfri的纳米材料，增强其药效，减少患者的耐受性。

2、本发明的第一个目的是提供一种能够同时抗白细胞介素1和肿瘤坏死因子炎症的纳米材料，所述的纳米材料是将人可溶性肿瘤坏死因子受体i胞外段蛋白hs-stnfri和人白介素1受体拮抗剂hs-il1ra连接至plga-peg-nhs纳米颗粒上得到。

3、进一步地，所述的人可溶性肿瘤坏死因子受体i胞外段蛋白hs-stnfri和人白介素1受体拮抗剂hs-il1ra通过酯交联反应与plga-peg-nhs纳米颗粒连接。

4、进一步地，所述的人可溶性肿瘤坏死因子受体i胞外段蛋白hs-stnfri的氨基酸序列如seq id no.1所示。

5、lvphlgdrekrdsvcpqgkyihpqnnsicctkchkgtylyndcpgpgqdtdcrecesgsftasenhlrhclscskcrkemgqveissctvdrdtvcgcrknqyrhywsenlfqcfncslclngtvhlscqekqntvctchagfflrenecvscsnckkslectklclpqienvkgtedsgtt

6、进一步地，所述的人白介素1受体拮抗剂hs-il1ra的氨基酸序列如seq id no.2所示。rpsgrksskmqafriwdvnqktfylrnnqlvagylqgpnvnleekidvvpiephalflgihggkmclscvksgdetrlqleavnitdlsenrkqdkrfafirsdsgpttsfesaacpgwflctameadqpvsltnmpdegvmvtkfyfqede

7、本发明的第二个目的是提供所述的纳米材料的制备方法，包括如下步骤：

8、s1、将plga-peg-nhs粉末溶解在有机溶剂中，在缓冲液中进行透析，透析后去除有机溶剂，得到plga-peg-nhs纳米颗粒溶液；

9、s2、向s1步骤得到的plga-peg-nhs纳米颗粒溶液中加入人可溶性肿瘤坏死因子受体i胞外段蛋白hs-stnfri和人白介素1受体拮抗剂hs-il1ra进行酯交联反应，反应后进行超滤离心去除未结合的蛋白，得到所述的纳米材料。

10、进一步地，在s2步骤中，plga-peg-nhs纳米颗粒溶液中plga-peg-nhs纳米颗粒的浓度为10～20mg/ml。

11、进一步地，在s2步骤中，人可溶性肿瘤坏死因子受体i胞外段蛋白hs-stnfri按照终浓度为1～2mg/ml加入，人白介素1受体拮抗剂hs-il1ra按照终浓度为1～2mg/ml加入。

12、进一步地，所述的有机溶剂为四氢呋喃、dmso、二氯甲烷、丙酮中的一种或多种。

13、进一步地，所述的缓冲液为hepes缓冲液、磷酸盐、碳酸盐-碳酸氢盐或硼酸盐缓冲液。

14、进一步地，所述的酯交联反应是在0～30℃下，在ph 7.2～8.5的缓冲液中反应0.5～4小时。

15、本发明的第三个目的是提供所述的纳米材料在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。

16、本发明的有益效果是：

17、本发明采用的纳米材料具有比表面积大，同时偶联il-1ra和stnfri两种药物，载药能力高的优势，延长蛋白药物在体内的滞留时间，提高蛋白药物在炎症处的靶向性，并且能够增强蛋白药物的药效，减少患者的耐受性。通过细胞实验证明本发明中涉及到的交联反应没有破坏蛋白stnfri和il1ra的活性，因此我们制备的纳米颗粒既能维持stnfri和tnf-α结合的生物学活性，也能维持il1ra和il-1β结合的生物学活性。

技术特征：

1.一种能够同时抗白细胞介素1和肿瘤坏死因子炎症的纳米材料，其特征在于，所述的纳米材料是将人可溶性肿瘤坏死因子受体i胞外段蛋白hs-stnfri和人白介素1受体拮抗剂hs-il1ra连接至plga-peg-nhs纳米颗粒上得到。

2.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，所述的人可溶性肿瘤坏死因子受体i胞外段蛋白hs-stnfri和人白介素1受体拮抗剂hs-il1ra通过酯交联反应与plga-peg-nhs纳米颗粒连接。

3.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，所述的人可溶性肿瘤坏死因子受体i胞外段蛋白hs-stnfri的氨基酸序列如seq id no.1所示。

4.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，所述的人白介素1受体拮抗剂hs-il1ra的氨基酸序列如seq id no.2所示。

5.一种权利要求1～4任一项所述的纳米材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在s2步骤中，plga-peg-nhs纳米颗粒溶液中plga-peg-nhs纳米颗粒的浓度为10～20mg/ml，人可溶性肿瘤坏死因子受体i胞外段蛋白hs-stnfri按照终浓度为1～2mg/ml加入，人白介素1受体拮抗剂hs-il1ra按照终浓度为1～2mg/ml加入。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂为四氢呋喃、dmso、二氯甲烷、丙酮中的一种或多种。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的缓冲液为hepes缓冲液、磷酸盐、碳酸盐-碳酸氢盐或硼酸盐缓冲液。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的酯交联反应是在0～30℃下，在ph 7.2～8.5的缓冲液中反应0.5～4小时。

10.权利要求1～4任一项所述的纳米材料在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种能够同时抗白细胞介素1和肿瘤坏死因子炎症的纳米材料及其制备方法与应用。本发明采用的纳米材料具有比表面积大，同时偶联IL‑1Ra和sTNFRI两种药物，载药能力高的优势，延长蛋白药物在体内的滞留时间，提高蛋白药物在炎症处的靶向性，并且能够增强蛋白药物的药效，在CIA(胶原诱导的类风湿性关节炎)小鼠体内取得了较好的治疗效果，这为类风湿性关节炎的治疗提供了潜在的方法和策略。

技术研发人员：张进平,杨燚,高秀,邵玉
受保护的技术使用者：苏州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13