一种猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症的二联亚单位疫苗及其制备方法和应用与流程

本发明属于兽用生物制品，具体涉及一种猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症的二联亚单位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：

1、猫传染性鼻气管炎又称为猫鼻支，是一种以急性上呼吸道症状为特征的高度接触性传染病。猫鼻支的病原为猫疱疹病毒1型(felid herpesvirus 1，fhv-1)，fhv-1属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科，水痘病毒属。疱疹病毒1型主要由核心、衣壳、间层及囊膜四部分组成。病毒衣壳为立体对称的正二十面体，外观呈六角形。fhv-1基因组编码多种蛋白质，已报道了17种病毒特异性蛋白和3种具有免疫原性的糖蛋白。其中的gb是主要免疫原性蛋白，在哺乳动物细胞中表达，引起细胞融合和多核体形成，是病毒复制所必需的；gd在病毒与细胞牢固吸附中起主要作用，在机体免疫中是主要的中和抗体。gc是一种重要的囊膜糖蛋白，通过和宿主细胞表面的硫酸乙酰肝素受体结合，实现fhv-1对细胞的粘附。gc还有免疫抑制的功能，能够结合补体，抑制补体介导的细胞杀伤作用。此外，gc也是fhv-1重要的免疫原性蛋白，能够诱导细胞免疫和中和抗体。

2、猫泛白细胞减少症又称猫瘟热，猫传染性肠炎，是由猫细小病毒(felinepanleukopenia virus，fpv)引起的一种急性高度接触性传染病。fpv是一种无囊膜的单链dna病毒，属细小病毒科、细小病毒属。fpv基因组两端含有发卡结构，中间部分编码两种蛋白：非结构蛋白(ns1、ns2)和结构蛋白(vp1、vp2)。通过对fpv衣壳蛋白分子结构的x射线晶体衍射技术测定发现：病毒粒子成二十面体对称，60个vp1和vp2蛋白分子构成病毒粒子衣壳蛋白，其中vp1分子5～6个，vp2分子54～56个。vp2蛋白是fpv衣壳的主要成分，暴露在衣壳蛋白表面，在没有vp1的存在下，vp2可自我组装病毒样颗粒。vp2作为fpv的主要免疫保护性抗原蛋白，能诱导机体产生中和抗体，是研究fpv亚单位疫苗的首选对象。

3、目前，我国尚无自主研发的fhv-1疫苗，主要依靠接种进口疫苗防治猫鼻支。现有技术尽管存在有关于猫泛白细胞减少症疫苗或与其他猫疾病疫苗复合的二联、三联疫苗的相关研究，但是现有的猫疾病相关的二联及多联疫苗多为分别表达定量后混合，不能保证产品产量的均一性，如二联疫苗或二联亚单位疫苗时常存在两种病毒蛋白此多彼少的情况，无法实现两种蛋白等摩尔比混合。另外，现有的用于防治猫疾病相关疾病的二联疫苗或二联亚单位疫苗还存在使用两个蛋白的病毒同时感染昆虫细胞，致使表达各蛋白的病毒的感染效率不同，蛋白产量不可控。细胞被多个杆状病毒感染时还会发生高频重组，从而导致有缺陷的病毒产生而无法表达预期的多蛋白产物。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症的二联亚单位疫苗及其制备方法和应用，该方法创新地实现了一次表达纯化过程即可同时生产两种病毒亚单位疫苗的方法，且纯化填料和酶切用酶均可重复使用，纯化过程简单，生产成本低。所述二联亚单位疫苗中二聚体形式的猫疱疹病毒1型gc蛋白和vlps形式的猫细小病毒vp2蛋白的摩尔比为1：1，疫苗抗原纯度高，免疫原性更强，成本更低。

2、本发明提供了一种猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症的二联亚单位疫苗，所述二联亚单位疫苗包括sf9-gc-vp2；

3、编码所述sf9-gc-vp2的基因为重组sf9-gc-vp2基因，所述重组sf9-gc-vp2基因包括编码家蚕免疫球蛋白信号肽的核苷酸序列、fhv-1gc基因、猫igg fc序列、tev酶切基序和fpvvp2基因。

4、优选的，所述sf9-gc-vp2的氨基酸序列如seq id no.7所示。

5、优选的，所述重组sf9-gc-vp2基因的核苷酸序列如seq id no.6所示。

6、优选的，所述编码家蚕免疫球蛋白信号肽的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述fhv-1gc基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述猫igg fc的核苷酸序列如seq idno.3所示，所述tev酶切基序的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述fpvvp2基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。

7、本发明还提供了一种猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症的二联亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：将包括上述技术方案所述的重组sf9-gc-vp2基因或上述技术方案所述的重组sf9-gc-vp2基因的重组杆状病毒感染细胞，获得细胞感染物上清液；

8、将所述细胞感染物上清液纯化获得纯化的目的蛋白；

9、将所述纯化的目的蛋白进行酶切获得酶切蛋白；

10、将所述酶切蛋白进行病毒样颗粒自组装后与佐剂混合，得到所述二联亚单位疫苗。

11、优选的，将所述纯化的目的蛋白进行酶切时使用的蛋白酶为tev蛋白酶。

12、优选的，用于制备所述重组杆状病毒的表达载体包括pfastbac1载体。

13、优选的，所述细胞包括昆虫细胞。

14、优选的，所述昆虫细胞包括sf9细胞或high five细胞。

15、有益效果：

16、本发明提供了一种猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症的二联亚单位疫苗，所述二联亚单位疫苗包括sf9-gc-vp2，所述sf9-gc-vp2中包括截短的fhv-1gc基因序列，删除n端和c端的跨膜区、胞内区；同时，加入fc标签，使猫疱疹病毒gc蛋白以二聚体形式表达，延长蛋白的半衰期，促进抗原递呈，便于下游纯化；

17、同时，通过在所述sf9-h-vp2中加入tev蛋白酶酶切基序，经tev蛋白酶酶切产生的猫细小病毒vp2蛋白，最接近天然病毒序列，仅在n端多一个甘氨酸，不影响vlps的形成。

18、再者，本发明所述二联亚单位疫苗中包括二聚体形式的猫疱疹病毒1型gc蛋白和vlps形式的猫细小病毒vp2蛋白，一次表达纯化过程，得到包括两种病毒的亚单位疫苗，保证二联亚单位疫苗中二聚体形式的猫疱疹病毒1型gc蛋白和vlps形式的猫细小病毒vp2蛋白的摩尔比为1：1，免疫原性更强，成本更低。

19、本发明还提供了一种猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症二联亚单位疫苗的制备方法，所述制备方法中采用商品化proteina填料纯化蛋白，且纯化填料和酶切用酶均可重复使用，纯化过程简单，不需要蛋白复性、离子交换层析等复杂工艺。同时，制备过程中采用的蛋白酶可回收，重复用于下次生产，节约成本。

技术特征：

1.一种猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症的二联亚单位疫苗，其特征在于，所述二联亚单位疫苗包括sf9-gc-vp2；

2.根据权利要求1所述的二联亚单位疫苗，其特征在于，所述sf9-gc-vp2的氨基酸序列如seq id no.7所示。

3.根据权利要求1或2所述的二联亚单位疫苗，其特征在于，所述重组sf9-gc-vp2基因的核苷酸序列如seq id no.6所示。

4.根据权利要求3所述的二联亚单位疫苗，其特征在于，所述编码家蚕免疫球蛋白信号肽的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述fhv-1gc基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述猫igg fc的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述tev酶切基序的核苷酸序列如seq idno.4所示，所述fpvvp2基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。

5.一种猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症的二联亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将包括权利要求1～4任一项所述的重组sf9-gc-vp2基因的重组杆状病毒感染细胞，获得细胞感染物上清液；

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，将所述纯化的目的蛋白进行酶切时使用的蛋白酶为tev蛋白酶。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，用于制备所述重组杆状病毒的表达载体包括pfastbac1载体。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述细胞包括昆虫细胞。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述昆虫细胞包括sf9细胞或highfive细胞。

技术总结
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症的二联亚单位疫苗。本发明创新地实现了一次表达纯化过程即可同时生产两种病毒亚单位疫苗的方法，纯化过程简单，生产用酶可回收再利用，降低生产成本。所述二联亚单位疫苗中包括二聚体形式的猫疱疹病毒1型gC蛋白和VLPs形式的猫细小病毒VP2蛋白摩尔比为1：1，提高疫苗抗原纯度，免疫原性更强，成本更低。

技术研发人员：康斌,李雪峰,张金龙,武玉梅,董鹏,赵炳武,朱国坡,王家福
受保护的技术使用者：金河佑本生物制品有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11