兔球虫重组蛋白在防控兔球虫病中的应用

本发明涉及生物，具体涉及兔球虫重组蛋白在防控兔球虫病中的应用。

背景技术：

1、兔球虫病(rabbitcoccidiosis)是由艾美耳属的多种球虫寄生于家兔的肠道和肝脏所引起的一种原虫性疾病，是家兔的一种常见、多发性疾病。

2、大型艾美耳球虫(eimeria magna)是最常见的兔球虫之一，具有中等致病力。流行病学调查发现，其在养兔场中具有检出率高且卵囊排出量大的特点。大型艾美耳球虫寄生于家兔回肠及空肠上皮细胞内，感染后可使家兔出现生长迟缓和饲料转化率降低等症状，从而对养兔业的经济效益产生影响。此外，在亚临床状况下，肠球虫的感染可使家兔免疫力降低，从而继发其他疾病。传统的球虫防治严重依赖于化学药物的添加，从而导致了耐药性和药物残留等问题。因此，疫苗预防已成为预防兔球虫病的首选解决方案。

3、但目前对于兔球虫疫苗的研究有限，且活疫苗造价昂贵并且存在返毒风险。因此，发展如亚单位疫苗这样的新型控制策略具有十分重要的意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了兔球虫重组蛋白在防控兔球虫病中的应用。

2、本发明提供了兔球虫重组蛋白在防控兔球虫病中的应用。remgam56和remrop17可以刺激家兔产生显著的细胞和体液免疫，并且表现出良好的抗大型艾美耳球虫感染效果，remrop17在减少卵囊排出量方面表现更好。二者均可以作为大型艾美耳球虫重组亚单位疫苗的候选抗原。本发明为兔大型艾美耳球虫重组亚单位疫苗的研究奠定了基础。

3、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

4、本发明提供了大型艾美耳球虫重组蛋白在制备如下任意项中的应用：

5、(ⅰ)、预防和/或治疗兔球虫病的重组亚单位疫苗；和/或

6、(ⅱ)、预防和/或治疗兔球虫病的疫苗抗原；

7、所述大型艾美耳球虫重组蛋白包括remgam56和/或remrop17。

8、在本发明的一些具体实施方案中，所述预防和/或治疗兔球虫病包括诱导细胞免疫和/或体液免疫。

9、在本发明的一些具体实施方案中，所述预防和/或治疗兔球虫病包括减少卵囊排出。

10、在本发明的一些具体实施方案中，所述预防和/或治疗兔球虫病包括提高增重率。

11、在本发明的一些具体实施方案中，所述预防和/或治疗兔球虫病包括降低料肉比。

12、在本发明的一些具体实施方案中，所述预防和/或治疗兔球虫病包括提高抗体水平。

13、在本发明的一些具体实施方案中，所述抗体包括特异性抗体；所述特异性抗体包括igg。

14、在本发明的一些具体实施方案中，所述预防和/或治疗兔球虫病包括提高细胞因子水平。

15、在本发明的一些具体实施方案中，所述细胞因子包括il-2、ifn-γ或il-17中的一种或多种。

16、本发明还提供了重组亚单位疫苗，其抗原蛋白包括remgam56和/或remrop17。

17、在本发明的一些具体实施方案中，所述remgam56的工作浓度包括0.94μg/well；

18、所述remrop17的工作浓度包括1.13μg/well。

19、在本发明的一些具体实施方案中，所述重组亚单位疫苗还包括其他抗原成分。

20、在本发明的一些具体实施方案中，所述重组亚单位疫苗还包括可接受的佐剂。

21、在本发明的一些具体实施方案中，所述重组亚单位疫苗的佐剂包括皂素quil-a。

22、在本发明的一些具体实施方案中，基于所述remgam56和/或remrop17检测兔血清特异性抗体水平的方法包括间接elisa。

23、在本发明的一些具体实施方案中，所述血清最佳稀释度为1：160。

24、在上述实验过程中，本发明还提供了引物组，其包括：扩增emgam56的引物组1和/或扩增emrop17的引物组2：

25、所述引物组1包括：

26、(ⅰ)、上游引物具有如seq no:1所示的核苷酸序列；和

27、(ⅱ)、下游引物具有如seq no:2所示的核苷酸序列；或

28、(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

29、(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

30、(ⅴ)、与(ⅰ)～(ⅳ)任一项所述核苷酸序列具有至少89.44％序列同源性的核苷酸序列；

31、所述引物组2包括：

32、(ⅵ)、上游引物具有如seq no:3所示的核苷酸序列；和

33、(ⅶ)、下游引物具有如seq no:4所示的核苷酸序列；或

34、(ⅷ)、与(ⅵ)或(ⅶ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅵ)或(ⅶ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

35、(ⅸ)、与(ⅵ)～(ⅷ)任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅵ)～(ⅷ)任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

36、(ⅹ)、与(ⅵ)～(ⅸ)任一项所述核苷酸序列具有至少66.96％序列同源性的核苷酸序列。

37、在本发明的一些具体实施方案中，本发明还提供了所述引物组在制备扩增和/或检测emgam56和/或emrop17试剂盒中的应用。

38、基于上述研究，本发明还提供了试剂盒，包括所述引物组以及可接受的助剂或载体。

39、此外，本发明还提供了用于获得所述大型艾美耳球虫重组蛋白remgam56和/或remrop17的重组质粒的构建方法，包括如下步骤：

40、(ⅰ)、以大型艾美耳球虫的cdna为模板；

41、(ⅱ)、使用所述引物组或所述试剂盒扩增。

42、本发明提供了兔球虫重组蛋白在防控兔球虫病中的应用。remgam56和remrop17可以刺激家兔产生显著的细胞和体液免疫，并且表现出良好的抗大型艾美耳球虫感染效果，remrop17在减少卵囊排出量方面表现更好。二者均可以作为大型艾美耳球虫重组亚单位疫苗的候选抗原。本发明为兔大型艾美耳球虫重组亚单位疫苗的研究奠定了基础。

技术特征：

1.大型艾美耳球虫重组蛋白在制备如下任意项中的应用：

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗兔球虫病包括诱导细胞免疫和/或体液免疫。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗兔球虫病包括减少卵囊排出和/或提高增重率。

4.如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗兔球虫病包括降低料肉比。

5.如权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗兔球虫病包括提高抗体水平。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗体包括特异性抗体；

7.如权利要求1至6任一项所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗兔球虫病包括提高细胞因子水平；

8.重组亚单位疫苗，其特征在于，其抗原蛋白包括remgam56和/或remrop17。

9.引物组，其特征在于，其包括：扩增emgam56的引物组1和/或扩增emrop17的引物组2：

10.大型艾美耳球虫重组蛋白remgam56和/或remrop17的重组质粒的构建方法，包括如下步骤：

技术总结
本发明涉及生物技术领域，具体涉及兔球虫重组蛋白在防控兔球虫病中的应用。本发明中从首次测定的兔大型艾美耳球虫转录组数据中扩增得到EmGAM56和EmROP17基因，将二者克隆到原核载体pET32a(+)中并在大肠杆菌感受态细胞中表达，获得重组蛋白GAM56(rEmGAM56)和ROP17(rEmROP17)。随后以皂素Quil‑A为佐剂进行疫苗试验，对二者的免疫保护效果进行初步评估，同时测定重组蛋白rEmGAM56和rEmROP17对机体体液免疫和细胞免疫反应的刺激作用。本发明为兔大型艾美耳球虫重组亚单位疫苗的研究奠定了基础。

技术研发人员：杨光友,肖洁
受保护的技术使用者：四川农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13