腺病毒辅助质粒的制作方法

背景技术：

1、腺相关病毒(aav)技术已经迅速成为遗传疾病基因治疗的主要形式。aav可以在多种宿主细胞系统，包括哺乳动物细胞，诸如hek293细胞中大规模生产。传统上，哺乳动物细胞中的aav生产涉及将多个质粒引入宿主细胞，这些质粒编码例如一个或多个所关注的人类基因，以及对病毒复制和包装至关重要的各种病毒基因。由于正确复制所需的基因数量，这些基因传统上在两个或三个单独的质粒上递送。

2、一种此类质粒，称为“腺病毒辅助”质粒，含有对宿主细胞产生aav至关重要的基因。含有e2a、va rna和e4基因的腺病毒辅助质粒已被证明对促进哺乳动物宿主细胞系统中aav的产生至关重要。

3、尽管在过去的二十年里取得了很大进步，但对aav生产的成本和安全性的担忧继续限制了aav技术的治疗潜力。这些担忧部分是由于许多辅助质粒的大尺寸，这是由于在单个辅助质粒上提供大量基因来支持aav的产生。安全性问题部分是由于aav复制所不需要的潜在细胞毒性和/或炎性病毒蛋白的产生，尽管水平较低。

技术实现思路

1、在一些实施方案中，本公开尤其提供了腺病毒辅助质粒。在一些实施方案中，本公开提供了相对于本领域已知的那些具有减小的尺寸的腺病毒辅助质粒。在一些实施方案中，本公开提供了包含编码e2a、va rna、e4；和l4区域的核苷酸序列的腺病毒辅助质粒。在一些实施方案中，如本文所述的腺病毒辅助质粒包含编码来自其他病毒的蛋白质的核苷酸序列。在一些实施方案中，如本文所述的腺病毒辅助质粒包含编码来自其他病毒(包括hsv-1ul30、hsv-1ul42和/或hsv-1ul29)的蛋白质的核苷酸序列。

2、在一些实施方案中，本公开提供了一种腺病毒辅助质粒，其不包含编码以下项中的一者或多者的一个或多个核苷酸序列：纤毛(fiber)蛋白；l1-52/55k(包装蛋白3)、外周六邻体相关蛋白和l4区域。在一些实施方案中，本公开提供了一种腺病毒辅助质粒，其包含e2a蛋白、va rna、e4、l1-52/55k(包装蛋白3)、外周六邻体相关蛋白和l4区域的片段、部分或部分形式。在一些实施方案中，本公开提供了一种腺病毒辅助质粒，其不包含编码六邻体相关前体(l4 pviii)蛋白、dna末端蛋白和23kda内切蛋白酶中的一者或多者的一个或多个核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开提供了一种腺病毒辅助质粒，其不包含编码e4orf1和e4orf2中的一者或多者的一个或多个核苷酸序列。在一些实施方案中，本文提供的腺病毒辅助质粒包含卡那霉素抗性基因。

3、在一些实施方案中，本公开提供了一种腺病毒辅助质粒，其中e2a蛋白的表达在e2a启动子、鸡β-肌动蛋白启动子和sv40启动子中的一者或多者的控制下。在一些实施方案中，本公开提供了一种腺病毒辅助质粒，其中e4开放阅读框(orf)的表达在鸡β-肌动蛋白启动子和sv40启动子中的一者或多者的控制下。

4、在一些实施方案中，本公开提供了一种腺病毒辅助质粒，其包含与seq id no:1-3、5、7、9、11-12、14-20、22、24、26-29、31、33、35-37、39-70、72、74、76、78或80具有至少80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开提供了一种腺病毒辅助质粒，其包含编码与seq id no:4、6、8、10、13、21、23、25、30、32、34、38、71、73、75、77、79或81具有至少80％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开提供了一种腺病毒辅助质粒，其包含与seq id no:41-66中的任一者具有至少80％同一性的核苷酸序列。

1.一种腺病毒辅助质粒，其包含编码以下项的核苷酸序列：

2.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述va rna区域包含与seq id no:14具有至少80％同一性的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的腺病毒辅助质粒，其中所述va rna区域包含：

4.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述va rna区域包含与seq id no:15具有至少80％同一性的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的腺病毒辅助质粒，其中所述va rna区域包含：

6.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述l4区域包含编码l4(六邻体装配)蛋白的核苷酸序列，所述l4蛋白具有与seq id:no.4具有至少80％同一性的氨基酸序列。

7.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述l4区域包含编码部分l4(六邻体装配)蛋白的核苷酸序列，所述部分l4蛋白具有与seq id:no.6具有至少80％同一性的氨基酸序列。

8.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述l4区域包含编码部分六邻体相关前体(l4 pviii)蛋白的核苷酸序列，所述部分六邻体相关前体蛋白具有与seq id no:13具有至少80％同一性的氨基酸序列。

9.如权利要求7所述的腺病毒辅助质粒，其中所述编码部分l4(六邻体装配)蛋白的核苷酸序列包含e2a启动子区域。

10.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒包含编码部分dna末端蛋白的核苷酸序列，所述部分dna末端蛋白具有与seq id:no 21具有至少80％同一性的氨基酸序列。

11.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒不包含编码dna末端蛋白的核苷酸序列。

12.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒包含编码部分23kda内切蛋白酶的核苷酸序列，所述部分23kda内切蛋白酶具有与seq id no:23具有至少80％同一性的氨基酸序列。

13.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒不包含编码23kda内切蛋白酶的核苷酸序列。

14.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中e2a蛋白的表达在e2a启动子的控制下。

15.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中e2a蛋白的表达在e2a启动子和鸡β-肌动蛋白启动子的控制下，其中所述鸡β-肌动蛋白启动子在所述e2a启动子的上游。

16.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中e2a蛋白的表达在所述鸡β-肌动蛋白启动子的控制下。

17.如权利要求15或16所述的腺病毒辅助质粒，其中所述鸡β-肌动蛋白启动子具有与seq id.no:26具有至少80％同一性的核苷酸序列。

18.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒包含e2a下游的e2a聚腺苷酸化信号。

19.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒含有e2a下游的sv40聚腺苷酸化信号。

20.如权利要求18所述的腺病毒辅助质粒，其中所述sv40聚腺苷酸化信号在e2a聚腺苷酸化信号的下游。

21.如权利要求19或20所述的腺病毒辅助质粒，其中所述sv40聚腺苷酸化信号具有与seq id.no:28具有至少80％同一性的序列。

22.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其还包含编码hsv-1ul30和hsv-1ul42的核苷酸序列，

23.如权利要求22所述的腺病毒辅助质粒，其中ul30和ul42的表达在所述质粒的ef-1α启动子的控制下。

24.如权利要求23所述的腺病毒辅助质粒，其中所述ef-1α启动子具有与seq id no:35具有至少80％同一性的核苷酸序列。

25.如权利要求22所述的腺病毒辅助质粒，其还包含ul42下游的β-珠蛋白聚腺苷酸化信号，其中所述β-珠蛋白聚腺苷酸化信号具有与seq id no:36具有至少80％同一性的核苷酸序列。

26.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其还包含编码hsv-1ul29的核苷酸序列，

27.如权利要求26所述的腺病毒辅助质粒，其中ul29的表达在所述质粒的hsv tk启动子的控制下。

28.如权利要求27所述的腺病毒辅助质粒，其中所述hsv tk启动子具有与seq id no:39具有至少80％同一性的核苷酸序列。

29.如权利要求26所述的腺病毒辅助质粒，其还包含ul29下游的hsv tk聚腺苷酸化信号，其中所述hsv tk聚腺苷酸化信号具有与seq id no:40具有至少80％同一性的核苷酸序列。

30.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述e4区域不包含e4orf1，并且其中所述e4区域不包含e4orf2。

31.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述e4区域可操作地连接到e4迷你启动子，其中所述e4迷你启动子具有与seq id no:1具有至少80％同一性的核苷酸序列。

32.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述e4区域可操作地连接到sv40启动子，其中所述sv40启动子具有与seq id no:2具有至少80％同一性的核苷酸序列。

33.一种腺病毒辅助质粒，其包含以下腺病毒dna序列或区域：

34.一种腺病毒辅助质粒，其与seq id no:41-66中的任一者具有80％序列同一性。

35.一种生产重组腺病毒相关病毒载体的方法，其包括：

36.如权利要求35所述的方法，其中所述aav载体质粒包含aav反向末端重复序列(itr)和所关注的转基因。

37.一种生产重组腺病毒相关病毒载体的方法，其包括：

38.如权利要求37所述的方法，其中所述aav载体质粒包含aav反向末端重复序列(itr)和所关注的转基因。

39.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述l4区域包含与seq id no:3具有至少80％同一性的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码l4(六邻体装配)蛋白。

40.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述l4区域包含与seq id no:5具有至少80％同一性的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码部分l4(六邻体装配)蛋白。

41.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述l4区域包含与seq id no:12具有至少80％同一性的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码部分六邻体相关前体(l4 pviii)蛋白。

42.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒包含与seq id no:20具有至少80％同一性的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码部分dna末端蛋白。

43.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒包含与seq id no:22具有至少80％同一性的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码部分23kda内切蛋白酶。

44.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒还包含编码hsv-1ul30和hsv-1ul42的核苷酸序列，

45.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒还包含编码hsv-1ul29的核苷酸序列，

46.如前述权利要求中任一项所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒包含抗性基因。

47.如权利要求46所述的腺病毒辅助质粒，其中抗性盒是卡那霉素抗性基因。