靶向负载AIE及万古霉素的脂质体微泡复合物制备方法及应用

本发明涉及医疗，具体来说是一种靶向负载aie及万古霉素的脂质体微泡复合物制备方法。

背景技术：

1、随着抗生素的大量使用，使得耐药性细菌的发展，万古霉素作为仅对革兰阳性菌发挥强大杀伤作用的窄谱抗菌药物，已被专家共识推荐为治疗mrsa的一线用药。但万古霉素的水溶液性质不稳定，导致万古霉素的有效浓度降低，通过口服给药，生物利用率较低；倘若通过静脉给药，为了使局部药物浓度达到治疗浓度，所需的给药浓度已超过人体所能承受的极限，会加大耳肾毒性和“红人综合征”的发生。为了提高万古霉素的稳定性和药物的有效浓度，已有研究者对万古霉素的剂型进行研究，fan等提出制备明胶/氧化的salecan水凝胶作为载体，用于递送万古霉素，结果发现所得水凝胶表现出优异的抗菌能力和可变特性。此外，该水凝胶显示出理想的药物释放动力学和机制，并成功应用于万古霉素的控释，实现了万古霉素浓度稳定保持。但该物质受ph值影响较大，将其应用于体内，由于体内ph值处于一个动态变化的过程，可能对其性质及作用造成影响，并且水凝胶的孔隙大小和其结构也是决定水凝胶在组织中发挥效能的关键因素，孔隙大小会影响其对周围细胞或组织的附着力，因此将明胶/氧化的salecan水凝胶作为载体负载万古霉素作用于体内，其不可控因素太多。有许多研究者提出运用脂质体作为载体，负载万古霉素可能是较好的选择。已有脂质体作为载体递送药物用于疾病治疗，在保证安全的前提下，对疾病的治疗效果也较显著，申请号为201811105558的发明专利公开了一种万古霉素纳米脂质体组合物及其制备方法，该方法使得万古霉素稳定性显著增强，并且显著降低了注射时万古霉素的静脉刺激性。但将该物质应用于临床人工关节置换术后假体周围感染(periprosthetic jointinfection,pji)的治疗，其效果并不显著，主要因为pji发生过程中病原菌可以形成生物膜，生物膜主要由多糖、蛋白质、核酸和脂质组成，它们相互结合，形成一个紧密的三维聚合物网络结构，并与生物膜内的细菌相互连接，具有良好的机械稳定性。生物膜的物理特性阻碍了万古霉素纳米脂质体的进入，使得万古霉素无法达到生物膜深层，发挥杀菌效能，降低了治疗效果。微泡在超声介导下，会发生空化效应和声孔效应，促使其周围细胞或血管的通透性增强，促进药物的渗透，更好的发挥治疗作用。唐本忠院士团队研发出一种聚焦诱导发光材料(aie)，能很好的识别病原菌的类别，对细菌具有靶向性，并且该物质在近红外光的照射下聚集发挥氧化应激(ros)反应，破坏靶向识别的细菌细胞膜，使细菌裂解死亡，发挥靶向杀灭细菌的作用。

2、基于以上，提出制备靶向负载aie及万古霉素的脂质体微泡复合物，该药物递送方式已经运用于癌症等疾病的治疗，具有较好的应用前景。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种靶向负载aie及万古霉素的脂质体微泡复合物制备方法及应用。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：靶向负载aie及万古霉素的脂质体微泡复合物制备方法，步骤包括：

3、a、制备生物素化aie及万古霉素的脂质体：分别称取适量的dppc、胆固醇、dspe-peg2000-生物素、聚集诱导发光材料和万古霉素分别充分溶解于丙酮中，充分溶解后混合，然后通过聚碳酸酯脂质膜过滤器挤压数次，得到生物素化负载aie及万古霉素的脂质体；

4、b、制备生物素化微泡；

5、c、洗涤孵育：所得微泡在注射器中用磷酸盐缓冲盐水在桶式离心机中洗涤三次，室温下轻轻摇晃孵育30min后，加入生物素化负载aie及万古霉素的脂质体，在室温下孵育30min，获得负载aie及万古霉素的脂质体微泡复合物。

6、进一步的，生物素化微泡的制备方法包括：

7、b1按比例称取二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)和生物素二棕榈酰磷脂酰胆碱(dspe-peg2000-生物素)分别溶于氯仿中，两种溶液分别放于温水中使其充分溶解；

8、b2将两种溶液充分混匀于一只试管内并置于试管架上，向混合溶液中通入惰性气流使其蒸发并在试管壁上形成一层薄膜，然后再将试管放置于真空泵中真空干燥得到脂质膜；

9、b3脂质膜加入tris液中进行重悬，然后放置于超声震荡仪中震荡使脂质膜完全溶解于tris液中，然后按1ml/瓶分装于小西林瓶内；

10、b4密封盖子后再将盖子打开，用封口膜进行封口，再把封装的小西林瓶与注射器相连，放置注射器的铁架两头相通，一头全氟丙烷(c3f8)，一头连接真空泵，先关闭气体的阀门，打开与真空泵相连的阀门，抽真空45min后，关闭此阀门，打开气体相连的阀门，保持10s，再一次关闭气体阀门，打开真空阀门，重复操作6-8次，最后关闭与真空泵相连的阀门，打开与气体相连的阀门，保持充入气体10s后，将小西林瓶从注射器上移除，最后用封口膜进行封口；

11、b5将制备的溶液用银汞胶囊调合器震荡30s，获得生物素化微泡。

12、进一步的，步骤a中，所述dppc、胆固醇、dspe-peg2000-生物素、聚集诱导发光材料与万古霉素的摩尔比与质量比为60-70：25-35：3.5-4.5：0.8-1.2：0.8-1.2；优先的摩尔比与质量比为65：30：4：1：1。

13、进一步的，步骤a中，所述过滤器挤压次数≥11。

14、进一步的，步骤a中，所述聚碳酸酯脂质膜孔径为200nm。

15、进一步的，步骤b1中，所述dspc和dspe-peg2000用量为：12份、3.6份。

16、进一步的，步骤b3中，所述tris液由甘油：丙二醇：0.1m三缓冲盐水溶液以1：1：8的比例配制而成。

17、本发明方法制备的靶向负载aie及万古霉素的脂质体微泡复合物，该物质的包封率为83.22％，平均粒径为(165.07±4.01)nm，分散性指数为0.33±0.04。

18、本发明制备的脂质体具有缓释功能，其内部aie及万古霉素从脂质体内部释放，到其周围，aie靶向识别细菌并结合，再通过近红外光照射后，aie聚集发挥氧化应激(ros)反应，破坏细菌细胞膜，促进细菌死亡，同时释放的万古霉素也发挥杀菌效能，进一步增大对细菌的杀伤作用。与微泡通过生物膜连接后，构成脂质体微泡复合物，该物质通过超声辐射后，微泡发生收缩、膨胀、破裂，发挥空化效应和声孔效应，使得其周围血管和细胞通透性增强，促进局部药物渗透进细胞内部，提高局部药物浓度，提升药物效能。

技术特征：

1.靶向负载aie及万古霉素的脂质体微泡复合物制备方法，其特征在于，步骤包括：

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤b中，生物素化微泡的制备方法包括：

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤a中，所述dppc、胆固醇、dspe-peg2000-生物素、聚集诱导发光材料与万古霉素的摩尔比与质量比为60-70：25-35：3.5-4.5：0.8-1.2：0.8-1.2。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤a中，所述dppc、胆固醇、dspe-peg2000-生物素、聚集诱导发光材料与万古霉素的摩尔比与质量比为65：30：4：1：1。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤a中，所述过滤器挤压次数≥11。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤a中，所述聚碳酸酯脂质膜孔径为200nm。

7.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤b1中，所述dspc和dspe-peg2000用量为：12mg、3.6mg。

8.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤b3中，所述tris液由甘油：丙二醇：0.1m三缓冲盐水溶液以1：1：8的比例配制而成。

9.根据权利要求1-8任一项所述方法制备的靶向负载aie及万古霉素的脂质体微泡复合物。

10.根据权利要求9所述靶向负载aie及万古霉素的脂质体微泡复合物在假体周围感染治疗中的应用。

技术总结
本发明公开一种靶向负载AIE及万古霉素的脂质体微泡复合物制备方法，制备生物素化AIE、万古霉素的脂质体和生物素化微泡；用缓冲盐水洗涤后的生物素化微泡在室温下孵育后，加入生物素化负载AIE及万古霉素的脂质体再孵育后获得脂质体微泡复合物。本发明脂质体具有缓释功能，其内部AIE及万古霉素从脂质体内部释放到其周围，AIE靶向识别细菌并结合，发挥ROS反应破坏细菌细胞膜，促进细菌死亡，同时万古霉素也发挥杀菌效能，进一步增大对细菌的杀伤能力。与微泡通过生物素连接后，构成脂质体微泡复合物，该物质通过超声辐射后，微泡发生收缩、膨胀、破裂，发挥空化效应和声孔效应，使得其周围血管和细胞通透性增强，提高局部药物浓度，提升药物效能。

技术研发人员：曹力,穆文博,姚粝芹,杨建华,穆玉明,张晓岗,胥伯勇,李国庆,郭文涛
受保护的技术使用者：新疆医科大学第一附属医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11