酪氨酸酶和咖啡酸联合半乳甘露聚糖交联屋尘螨减轻过敏性哮喘的方法

本发明涉及抗过敏，更具体的说是涉及酪氨酸酶和咖啡酸联合半乳甘露聚糖交联屋尘螨(hdm)减轻过敏性哮喘的方法。

背景技术：

1、过敏性哮喘是最常见的慢性呼吸道疾病之一，哮喘涉及呼吸系统的喘息、呼吸急促、胸闷以及咳嗽等一系列症状，并常伴有多器官过敏和非过敏性疾病，严重影响人类的健康和生活。哮喘通常由花粉、霉菌、尘螨等过敏性刺激和冷空气等非过敏性诱因诱发，其中，屋尘螨(hdm)是哮喘的主要危险因素。皮质类固醇、长效β2-肾上腺素受体激动剂、长效毒蕈碱拮抗剂、白三烯受体拮抗剂等药物，虽能缓解哮喘的症状，但易复发、难治愈以及伴随多种并发症的特点依然给人们造成了严重的精神压力和经济压力。

2、因此，提供一种安全有效的制剂减轻过敏性哮喘的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的是开发一种降低hdm过敏原性的技术，提供一种低过敏性高分子量hdm来减轻过敏性哮喘，具体是提供酪氨酸酶和咖啡酸联合半乳甘露聚糖交联hdm减轻过敏性哮喘的方法，使经改造后的过敏原产品可使用更高的免疫治疗起始剂量，并且对过敏性哮喘起到预防和治疗的效果。

2、酪氨酸酶(tyr)和咖啡酸(ca)联合半乳甘露聚糖(man)交联屋尘螨(hdm)减轻过敏性哮喘的方法，具体步骤如下：

3、(1)制备hdm悬浊液：采用pbs溶液溶解hdm，获得50～400mg/ml的hdm悬浊液；

4、(2)将步骤(1)制备的hdm悬浊液在冰浴环境下研磨成细颗粒，并进一步用pbs溶液稀释获得2～20mg/ml的hdm溶液；

5、(3)将步骤(2)制备的hdm溶液在85～100℃下加热处理15～30分钟以松散hdm的蛋白质结构；

6、(4)采用pbs溶液溶解man，获得0.5～4.0mg/ml的man溶液；按2：1的体积比添加到步骤(3)所得hdm溶液中；

7、(5)采用pbs溶液溶解酪氨酸酶，获得活性水平为0.2～0.8u/mg的酪氨酸酶溶液；按100：1的体积比添加到步骤(4)所得溶液中；

8、(6)在步骤(5)的交联反应液中继续加入0.5～1.5mmca提高交联效率；

9、(7)将步骤(6)获得的溶液置于无菌容器中，在35-39℃下连续搅拌孵育12-24小时；所述容器大小为所盛装溶液体积的40～60倍，且在孵育过程中每间隔8小时在无菌环境下开盖更换新鲜空气一次；

10、(8)孵育结束后，85～100℃加热10～30分钟，通过失活酶促反应终止反应；获得低过敏性交联高分子量hdm。

11、作为优选的技术方案，所述pbs溶液浓度为0.2～2mm。

12、作为优选的技术方案，步骤(1)体系的ph值为6.0～9.0。

13、作为优选的技术方案，步骤(6)孵育时搅拌转速为250～500rpm。

14、作为优选的技术方案，步骤(8)所得低过敏性交联高分子量hdm，在-20℃保存。

15、本发明的另一目的是，提供上述的低过敏性交联高分子量hdm在制备治疗脱敏制剂中的应用。

16、酪氨酸酶具有催化单酚邻位羟基化生成邻二酚的能力，邻二酚氧化后进一步转化为同源邻醌。蛋白质的酪氨酸侧链在酪氨酸酶的催化形成醌，由于醌的高反应性，可进一步与不同的基团如胺、酪氨酸、巯基、酰胺和/或彼此反应，建立分子间和/或分子内交联。此外，咖啡酸除了通过提供羟基官能团来增强酪氨酸酶的交联效果，还可以起到交联介质的作用，克服球状蛋白质在酪氨酸酶中的转化能力很差的缺点，从而更有助于改变其致敏潜能。

17、本发明首次开发了一种基于酪氨酸酶催化交联并联合半乳甘露聚糖的聚合低过敏性hdm衍生物，可以影响t细胞介导的免疫反应。这种新的免疫治疗产品，通过减少嗜酸性气道炎症和恢复正常的th1/th2免疫平衡来减轻过敏性疾病的严重程度，可以作为一个潜在的抗原特异性免疫治疗(asit)候选分子来治疗过敏性疾病。

18、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了酪氨酸酶和咖啡酸联合半乳甘露聚糖交联hdm减轻过敏性哮喘的方法，首次通过酪氨酸酶和咖啡酸催化的交联与半乳甘露聚糖偶联，改变hdm蛋白质的构象结构和致敏潜能。酪氨酸酶交联的hdm与半乳甘露聚糖偶联可以定位特异性连接糖与蛋白质，改善其功能特性，降低hdm的致敏性。

19、同时，包含多个过敏原聚合物的表面积比相同数量的过敏原单体更小，跟肥大细胞ige交联的暴露表位更少。高分子量过敏原向致敏肥大细胞的扩散比过敏原单体更慢，此过程更可能被组织中的抗原递呈细胞干扰，从而进一步减少与致敏肥大细胞反应的机会。这些特性有助于降低交联产品的过敏原性，从而产生更快速的治疗反应。

20、本发明方法比以前用物理和化学方法来降低hdm的抗原性和过敏原性的效率高很多。酪氨酸酶和咖啡酸交联过敏原的免疫治疗具有更高的安全性，因此比非修饰过敏原更快更简单地给药。

技术特征：

1.酪氨酸酶(tyr)和咖啡酸(ca)联合半乳甘露聚糖(man)交联屋尘螨(hdm)减轻过敏性哮喘的方法，其特征在于，具体步骤如下：

2.根据权利要求1所述的酪氨酸酶(tyr)和咖啡酸(ca)联合半乳甘露聚糖(man)交联屋尘螨(hdm)减轻过敏性哮喘的方法，其特征在于，所述pbs溶液浓度为0.2～2mm。

3.根据权利要求1所述的酪氨酸酶(tyr)和咖啡酸(ca)联合半乳甘露聚糖(man)交联屋尘螨(hdm)减轻过敏性哮喘的方法，其特征在于，步骤(1)体系的ph值为6.0～9.0。

4.根据权利要求1所述的酪氨酸酶(tyr)和咖啡酸(ca)联合半乳甘露聚糖(man)交联屋尘螨(hdm)减轻过敏性哮喘的方法，其特征在于，步骤(6)孵育时搅拌转速为250～500rpm。

5.根据权利要求1所述的酪氨酸酶(tyr)和咖啡酸(ca)联合半乳甘露聚糖(man)交联屋尘螨(hdm)减轻过敏性哮喘的方法，其特征在于，步骤(8)所得低过敏性交联高分子量hdm，在-20℃保存。

6.权利要求1-5任一所述的低过敏性交联高分子量hdm在制备治疗脱敏制剂中的应用。

技术总结
本发明公开了酪氨酸酶(Tyr)和咖啡酸(CA)联合半乳甘露聚糖(Man)交联屋尘螨(HDM)减轻过敏性哮喘的方法，属于抗过敏技术领域。本发明公开酪氨酸酶和咖啡酸联合半乳甘露聚糖交联HDM减轻过敏性哮喘的方法，通过酪氨酸酶和咖啡酸催化HDM与半乳甘露聚糖交联，改变HDM的构象结构和致敏能力。本发明公开的低过敏性交联高分子量HDM，可以影响T细胞介导的免疫反应。这种新的免疫治疗产品，通过减少嗜酸性气道炎症和恢复正常的1型辅助型T细胞(Th1)/Th2免疫平衡来减轻过敏性疾病的严重程度，可以作为一个潜在的抗原特异性免疫治疗(ASIT)候选分子来治疗过敏性疾病。

技术研发人员：黄功华,邓家琦,郑婷婷
受保护的技术使用者：广东医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13