一种结核分枝杆菌的重组DNA疫苗及其制备方法

本发明涉及基因工程和重组dna疫苗开发，具体涉及一种结核分枝杆菌的重组dna疫苗及其制备方法。

背景技术：

1、结核病(tb)是由结核分枝杆菌(mtb)引起的一种严重的呼吸道传染病。虽然多种类型的新型疫苗已被广泛研究，包括重组bcg疫苗、营养缺陷型结核分枝杆菌疫苗、蛋白质多肽疫苗、dna疫苗、以病毒为载体的结核亚单位疫苗等，但现有疫苗或多或少存在缺陷，例如卡介苗(bcg)虽然可以有效预防粟粒型结核和结核性脑膜炎。但是其对成人保护效果有限，复种无效。且卡介苗为预防性疫苗，不能对潜伏感染的个体提供有效保护，因此，研制新型结核疫苗迫在眉睫。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种结核分枝杆菌的重组dna疫苗及其制备方法，该疫苗可补充市售卡介苗性能，控制结核病潜伏感染，有望用于卡介苗初始免疫后的加强免疫用疫苗；控制潜伏感染的治疗性疫苗；与药物联用控制结核病的治疗性疫苗。

2、本发明中，选取标准株h37rv中完整的ag85b，rv2029c和rv1738，通过酶切连接于表达载体；其中，重组的rv1738(285bp,1965657..1965941)，rv2029c(1020bp,2275405..2276424)可以用于潜伏期结核病的血清学检测，ag85b(978bp，2134897..2135874)可以用于急性感染期的血清学检测，因此这些基因都可以作为疫苗的候选基因，本发明将上述基因重组于载体pvax1，作为dna疫苗。本发明的技术方案具体介绍如下。

3、一种结核分枝杆菌的重组dna疫苗，其通过将基因ag85b、rv2029c和rv1738重组入表达质粒获得。优选的，表达质粒为pvax1，重组疫苗为ag85b-rv2029c-rv1738-pvax1(简称为b21)。

4、本发明进一步提供一种上述的结核分枝杆菌的重组dna疫苗的制备方法，包括以下步骤：

5、(1)扩增ag85b、rv2029c和rv1738基因；

6、(2)分别用双酶切ag85b基因和表达质粒，胶回收连接获得重组质粒；

7、(3)将步骤(2)获得的重组质粒转化、扩增并表达；

8、(4)分别用双酶切步骤(3)获得的重组质粒和rv2029c基因，胶回收连接形成重组质粒；

9、(5)将步骤(4)获得的重组质粒转化、扩增并表达；

10、(6)分别用双酶切步骤(5)获得的重组质粒和rv1738基因，胶回收连接形成重组质粒；

11、(7)将步骤(6)获得的重组质粒转化、扩增并表达，即得到重组dna疫苗。

12、优选的，步骤(2)中，表达质粒是pvax1。

13、优选的，步骤(2)中，双酶切使用的酶是nhe i和hindⅲ；步骤(4)中，双酶切使用的酶是hindⅲ和ecorⅰ；步骤(6)中，双酶切使用的酶是ecorⅰ和notⅰ。

14、优选的，步骤(3)、步骤(5)和步骤(7)中，重组质粒在大肠杆菌中转化、扩增并表达。

15、和现有技术相比，本发明的有益效果在于：

16、本发明的疫苗中，使用美国fda认可的核酸疫苗载体pvax1，能够在哺乳动物细胞中表达蛋白。

17、dna疫苗ag85b-rv2029c-rv1738-pvax1使用核酸疫苗载体pvax1融合表达结核杆菌抗原ag85b，rv2029c和rv1738，该疫苗转染巨噬细胞后，融合蛋白ag85b-rv2029c-rv1738可以在巨噬细胞中表达，并有效激活巨噬细胞，提高il-6，tnf-α的分泌水平。

18、本发明研究发现，免疫6-8周龄c57bl/6雌性小鼠2周后，该dna疫苗ag85b-rv2029c-rv1738-pvax1可以显著提高小鼠外周血中cd4+，cd8+t淋巴细胞的比例，cd4+，cd8+t淋巴细胞在抗结核免疫过程中均有重要作用。

19、本发明研究发现，免疫6～8周龄c57bl/6雌性小鼠18周后，采用尾静脉注射5×106cfu bcg/只感染小鼠后4周，脾淋巴细胞在ag85b，rv2029c和rv1738特异性抗原刺激后th1型细胞因子il-2，ifn-γ，tnf-α的分泌升高，而且疫苗免疫组中小鼠肺、脾的bcg计数显著降低，提示dna疫苗可以有效控制结核分枝杆菌等在小鼠体内的生长繁殖，用于结核分枝杆菌感染的预防和治疗。

20、本发明研究用dna疫苗ag85b-rv3425-rv1813c-pvax1(b31)作对照，发现该发明的dna疫苗(b21)相比b31能更有效的激活巨噬细胞并提高th1型细胞免疫反应。

技术特征：

1.ag85b基因、rv2029c基因和rv1738基因在制备治疗结核病的重组dna疫苗中的应用。

2.ag85b基因、rv2029c基因和rv1738基因在制备诱导巨噬细胞分泌il-6和tnf-α的重组dna疫苗中的应用。

3.ag85b基因、rv2029c基因和rv1738基因在制备诱导淋巴细胞分泌il-2，ifn-γ和tnf-α的重组dna疫苗中的应用。

4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述重组dna疫苗通过将ag85b基因、rv2029c基因和rv1738基因重组入真核表达载体获得。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述真核表达载体为pvax1，重组dna疫苗为ag85b-rv2029c-rv1738-pvax1。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述重组dna疫苗的制备方法，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，双酶切使用的酶是nheⅰ和hindⅲ；步骤(4)中，双酶切使用的酶是hindⅲ和ecorⅰ；步骤(6)中，双酶切使用的酶是ecorⅰ和notⅰ。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(3)、步骤(5)和步骤(7)中，重组质粒在大肠杆菌中转化、扩增并表达。

技术总结
本发明公开了一种结核分枝杆菌的重组DNA疫苗及其制备方法。本发明的重组DNA疫苗通过将基因Ag85B、Rv2029c和Rv1738重组入真核表达载体获得。本发明研究发现，免疫6～8周龄C57BL/6雌性小鼠后，DNA疫苗Ag85B‑Rv2029c‑Rv1738‑pVAX1可以显著提高小鼠外周血中CD4+，CD8+T淋巴细胞的比例，增加小鼠脾淋巴细胞抗原特异性Th1型细胞因子IL‑2，IFN‑γ，TNF‑α的分泌，降低小鼠肺、脾的BCG细菌计数，提示该重组DNA疫苗可以有效控制分枝杆菌在小鼠体内的生长繁殖。因此，本发明的重组DNA疫苗可用于结核分枝杆菌感染的预防和治疗。

技术研发人员：徐颖,翁术锋,王洪海,赵雅敏,张天然,章金怡
受保护的技术使用者：复旦大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11