一种用于斑马鱼幼鱼血红细胞测速的装置及其实现方法

本申请涉及斑马鱼实验，更具体地说，是涉及一种用于斑马鱼幼鱼血红细胞测速的装置及其实现方法。

背景技术：

1、斑马鱼作为较低等的脊椎动物，斑马鱼架起了以果蝇、线虫为代表的无脊椎动物(小模式生物)和小鼠为代表的哺乳动物(大模式生物)之间的桥梁。因此，斑马鱼的动物模型经常被用于各种医用领域的研究。但是斑马鱼的模型取得成功之后，如何对斑马鱼的活体进行固定和拍摄以获取更高质量的图像，这个问题尚未得到很好的解决。现有的固定方法多是使用麻醉剂将鱼麻醉或使用琼脂糖将鱼固定，这些方法容易导致斑马鱼死亡，并且操作起来较为困难。

2、专利cn113425447a(申请号：202110608483.3)公开了一种斑马鱼幼鱼固定装置及其固定方法，该专利利用孔板作为基底，在其中设有固定槽。通过在固定槽中加入鱼麻醉剂和粘着剂来实现对斑马鱼的固定。虽然能实现固定，但是其中的药物对于斑马鱼幼鱼的损伤不可逆的，并且操作流程过于复杂。

技术实现思路

1、本申请的目的是提供一种用于斑马鱼幼鱼血红细胞测速的装置及其实现方法，本申请能够实现对斑马鱼幼鱼在无损伤条件下测定血红细胞流速，以便于后续采用同一条鱼完成一系列实验的目的，对于探究斑马鱼这类模式动物的生长发育和对药物的反应等领域都有重要意义。

2、第一方面，本申请实施例提供了一种用于斑马鱼幼鱼血红细胞测速的装置，包括固定组件、成像组件和控制器，固定组件包括固定板和盖板，固定孔设于固定板上，盖板盖设于固定孔上，固定孔用于容纳胶原蛋白层和斑马鱼层，成像组件能够采集斑马鱼层的图像，成像组件与控制器电连接。

3、在第一方面一种可能的实现方式中，成像组件包括倒置荧光显微镜、光源和ccd相机，光源设于倒置荧光显微镜的载物台上方，倒置荧光显微镜的物镜设于载物台下方，ccd相机设于倒置荧光显微镜的目镜端，倒置荧光显微镜的物镜倍数为20倍。

4、在第一方面另一种可能的实现方式中，ccd相机的拍摄帧率为100至150fps，ccd相机的分辨率为5472×3648像素，曝光时间为5ms。

5、在第一方面另一种可能的实现方式中，固定孔呈圆柱形，固定孔直径为1至6mm，固定孔的深度为1至8mm。

6、在第一方面另一种可能的实现方式中，盖板包括定位板和延伸板，延伸板连接于定位板的底部，定位板能够覆盖固定孔，定位板能够伸入固定孔内，延伸板呈圆形。

7、在第一方面另一种可能的实现方式中，延伸板通过聚二甲基硅氧烷一体成型制成。

8、第二方面，本申请实施例还提供了一种用于斑马鱼幼鱼血红细胞测速的实现方法，使用如第一方面中任一项所述的用于斑马鱼幼鱼血红细胞测速的装置进行，方法包括：

9、将胶原蛋白与碳酸氢钠以15：2的质量比混合后得到胶原蛋白溶液，在固定孔中加入120ul的胶原蛋白溶液，放入37℃的孵箱中固化处理1小时，得到固化胶原蛋白；

10、用胶头滴管吸取一条斑马鱼幼鱼加入到固定孔中，并向固定孔中足够斑马鱼幼鱼游动的水；

11、将盖板盖设到固定孔上，使得固化胶原蛋白和延伸板共同对斑马鱼幼苗进行定位；

12、使用成像组件采集斑马鱼幼苗的原始图像；

13、根据原始图像，确定斑马鱼幼鱼的血红细胞流速。

14、在第二方面另一种可能的实现方式中，根据原始图像，确定斑马鱼幼鱼的血红细胞流速，包括：

15、对原始图像进行灰度处理，得到灰度图像；

16、在相邻帧的灰度图像中，将每个像素点对应的灰度值的相减处理，得到每个像素点对应的灰度变化值，如果灰度变化值大于预设阈值，则判定灰度变化值对应的像素点为运动像素点，并保留运动像素点对应的灰度值，如果灰度变化值小于预设阈值，则判定灰度变化值对应的像素点为背景像素点，并将背景像素点的灰度值设置为255，得到输出图像；

17、对输出图像进行二值化处理，并采用中值滤波去除噪点，得到二值图像；

18、对二值图像进行高斯平滑处理；

19、根据相邻帧的二值图像，利用光流法确定血红细胞的流速。

20、在第二方面另一种可能的实现方式中，利用如下公式确定血红细胞的流速：

21、

22、

23、其中，x方向为水平方向，y方向为竖直方向，t表示时间值，n表示帧数值，根据x方向和y方向建立坐标系，u表示像素移动的水平分速度，v表示像素移动的竖直分速度，vs表示血红细胞的流速值，灰度图像上的某个像素点i的坐标表示为i(x,y)，表示图像中像素点i的灰度值沿x方向的位移相对于时间的偏导数,表示图像中像素点i的灰度值沿y方向的位移相对于时间的偏导数,表示图像中像素点i的灰度值相对于时间t的偏导数，表示第n帧对应的图像中所有像素移动速度u的平均值，表示第n帧对应的图像中所有像素移动速度u的平均值，λ表示权重系数。

24、在第二方面另一种可能的实现方式中，胶原蛋白为牛来源1型胶原蛋白，胶原蛋白溶液的浓度为1-3mg/ml，胶原蛋白溶液的ph值为2.1至3。

25、本申请实施例与现有技术相比存在的有益效果是：

26、通过胶原蛋白层对斑马鱼幼鱼进行固定，由于胶原蛋白层为软质结构，使得斑马鱼幼鱼能够稳定地定位，且软质的胶原蛋白层不会对斑马鱼幼鱼造成损伤，使得斑马鱼幼鱼中的血液流速能够方便测定，并且斑马鱼幼鱼能够在后续实验程序中继续进行实验，提高了利用斑马鱼幼鱼的实验效果。

技术特征：

1.一种用于斑马鱼幼鱼血红细胞测速的装置，其特征在于，包括固定组件(100)、成像组件(200)和控制器(300)，所述固定组件(100)包括固定板(110)和盖板(120)，所述固定孔(111)设于所述固定板(110)上，所述盖板(120)盖设于所述固定孔(111)上，所述固定孔(111)用于容纳胶原蛋白层(130)和斑马鱼层(140)，所述成像组件(200)能够采集所述斑马鱼层(140)的图像，所述成像组件(200)与所述控制器(300)电连接。

2.如权利要求1所述的用于斑马鱼幼鱼血红细胞测速的装置，其特征在于，所述成像组件(200)包括倒置荧光显微镜(210)、光源(220)和ccd相机(230)，所述光源(220)设于所述倒置荧光显微镜(210)的载物台(211)上方，所述倒置荧光显微镜(210)的物镜(212)设于所述载物台(211)下方，所述ccd相机(230)设于所述倒置荧光显微镜(210)的目镜端，所述倒置荧光显微镜(210)的物镜倍数为20倍。

3.如权利要求2所述的用于斑马鱼幼鱼血红细胞测速的装置，其特征在于，所述ccd相机(230)的拍摄帧率为100至150fps，所述ccd相机(230)的分辨率为5472×3648像素，曝光时间为5ms。

4.如权利要求3所述的用于斑马鱼幼鱼血红细胞测速的装置，其特征在于，所述固定孔(111)呈圆柱形，所述固定孔(111)直径为1至6mm，所述固定孔(111)的深度为1至8mm。

5.如权利要求4所述的用于斑马鱼幼鱼血红细胞测速的装置，其特征在于，所述盖板(120)包括定位板(121)和延伸板(122)，所述延伸板(122)连接于所述定位板(121)的底部，所述定位板(121)能够覆盖所述固定孔(111)，所述定位板(121)能够伸入所述固定孔(111)内，所述延伸板(122)呈圆形。

6.如权利要求5所述的用于斑马鱼幼鱼血红细胞测速的装置，其特征在于，所述延伸板(122)通过聚二甲基硅氧烷一体成型制成。

7.一种用于斑马鱼幼鱼血红细胞测速的实现方法，其特征在于，使用如权利要求6中所述的用于斑马鱼幼鱼血红细胞测速的装置进行，所述方法包括：

8.如权利要求7所述的用于斑马鱼幼鱼血红细胞测速的实现方法，其特征在于，所述根据所述原始图像，确定所述斑马鱼幼鱼的血红细胞流速，包括：

9.如权利要求8所述的用于斑马鱼幼鱼血红细胞测速的实现方法，其特征在于，利用如下公式确定所述血红细胞的流速：

10.如权利要求7所述的用于斑马鱼幼鱼血红细胞测速的实现方法，其特征在于，所述胶原蛋白为牛来源1型胶原蛋白，所述胶原蛋白溶液的浓度为1-3mg/ml，所述胶原蛋白溶液的ph值为2.1至3。

技术总结
本申请涉及斑马鱼实验技术领域，公开了一种用于斑马鱼幼鱼血红细胞测速的装置，包括固定组件、成像组件和控制器，所述固定组件包括固定板和盖板，所述固定孔设于所述固定板上，所述盖板盖设于所述固定孔上，所述固定孔用于容纳胶原蛋白层和斑马鱼层，所述成像组件能够采集所述斑马鱼层的图像，所述成像组件与所述控制器电连接。本申请还提供了一种用于斑马鱼幼鱼血红细胞测速的实现方法。本申请能够实现对斑马鱼幼鱼在无损伤条件下测定血红细胞流速，以便于后续采用同一条鱼完成一系列实验的目的，对于探究斑马鱼这类模式动物的生长发育和对药物的反应等领域都有重要意义。

技术研发人员：李凯,张策,孙聃
受保护的技术使用者：西北大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13