一种脂质体酶纳米反应器及制备方法和抗肿瘤治疗的应用

本发明属于生物纳米医学，具体涉及一种脂质体酶纳米反应器及制备方法和抗肿瘤治疗的应用。

背景技术：

1、酶通过降低活化能并显著提高化学反应速率，在生物反应和代谢过程中起着不可或缺的作用。涉及多种酶的级联反应是生物体内信号传递和代谢(如氧化磷酸化)的基础。在真核细胞中，酶被划分在特定的细胞器和生物分子凝聚体中，为多步反应提供了一个封闭的环境，以完成预期的生物过程，具有反应效率高，独立性强的特点。

2、大多数研究都集中在用合成系统模仿大自然的划分策略上，目前已经开发出多种人工细胞和亚细胞类似物，如人工细胞和纳米细胞器，来模拟基本的细胞结构和反应。这种区域化的分离不仅保留了酶的活性和功能，而且能够通过不同的方式组装目标酶，用来模拟复杂的自然催化过程。然而，不同酶的组合以及酶的定量划分以及实现对级联反应的时空控制仍然具有挑战性。此外，将这些人工合成系统用于生物医学领域应用的研究目前也很罕见。介孔二氧化硅纳米容器常被用于封装酶或作为其他药物的载体。然而，在二氧化硅形成过程中，原位酶包埋需要苛刻的合成条件，这一过程通常会导致酶活性降低。聚合物是在酶纳米反应器的水核中捕获酶的另一种选择，在这种情况下，嵌段共聚物的合成需要多步过程。此外，合成聚合物的生物相容性仍然是体内应用另一个主要问题。

3、为解决目前存在的问题，开发一种具有高效酶级联反应能力的酶纳米反应器用于生物医学等领域具有重要研究意义。

技术实现思路

1、本发明针对现有问题，提供一种脂质体酶纳米反应器、制备方法，以及将其用于抗肿瘤治疗的应用。本发明不需要复杂的合成过程，采用薄膜分散法和挤压法制备脂质体酶纳米反应器(lnrs)。该纳米反应器具有高效酶级联反应能力，具有临床抗肿瘤治疗的前景。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种脂质体酶纳米反应器包括脂质体；以及葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶，与所述脂质体复合。

3、所述脂质体包括l-α-磷脂酰胆碱、胆固醇和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。

4、其中，所述的脂质体酶纳米反应器中gox(葡萄糖氧化酶)和hrp(辣根过氧化物酶)的负载量分别为1～1000μg mg-1。所述负载量为葡萄糖氧化酶或者辣根过氧化物酶在脂质体上的负载率。

5、其中，所述脂质体酶纳米反应器的流体动力学半径为1～1000nm。

6、其中，所述脂质体酶纳米反应器的电动电势为-100～100mw。

7、在一些具体实施方式中，所述脂质体酶纳米反应器的流体动力学半径为10～300nm。

8、在一些具体实施方式中，所述脂质体酶纳米反应器的流体动力学半径为20～220nm。

9、在一些具体实施方式中，所述的脂质体酶纳米反应器中gox(葡萄糖氧化酶)和hrp(辣根过氧化物酶)的负载量分别为1～300μg mg-1。

10、在一些具体实施方式中，所述的脂质体酶纳米反应器中gox(葡萄糖氧化酶)和hrp(辣根过氧化物酶)的负载量分别为10～300μg mg-1。

11、所述的脂质体酶纳米反应器的制备方法，采用脂质体、葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶通过薄膜分散法和挤压法制备脂质体酶纳米反应器。

12、所述的脂质体酶纳米反应器的具体制备方法，包括以下步骤：

13、1)将l-α-磷脂酰胆碱、胆固醇和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)溶解在有机溶剂中；

14、2)去除溶剂，获得均匀透明的脂质体薄膜；

15、3)将脂质体薄膜、葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶在溶液中混合，得到脂质体悬浮液；

16、4)依次使用不同孔径的聚碳酸酯膜对步骤3的悬浮液进行挤压过滤；

17、5)过滤后的滤液离心纯化，重悬于新鲜pbs中，得到脂质体酶纳米反应器的悬浮液。

18、在一些具体实施方式中，所述制备方法中，l-α-磷脂酰胆碱的用量为0～800mg，胆固醇的用量为0～200mg，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)的用量为0～200mg。

19、在一些具体实施方式中，所述制备方法中，葡萄糖氧化酶的用量为1～10000μg，辣根过氧化物酶用量为1～10000μg。

20、在一些具体实施方式中，所述制备方法中，依次使用孔径为800nm、400nm和200nm的聚碳酸酯膜对步骤3的悬浮液进行挤压过滤。

21、所述制备方法中，使用聚碳酸酯膜对步骤3的悬浮液进行挤压过滤的时间根据实验物质的投料量不同时间不同，挤压完全即可，具体的，挤压过滤的时间为0-30min。

22、所述的一种脂质体酶纳米反应器在制备抗肿瘤治疗材料或者药物中的应用。

23、开发了基于脂质体的酶纳米反应器(gox/hrp-lnrs)，模拟了用于抗肿瘤治疗的真核细胞器的结构和串联反应。葡萄糖氧化酶(gox)和辣根过氧化物酶(hrp)共同负载在脂质体的水核中心。两种酶的共区隔化提高了串联反应的整体效率。纳米反应器中的gox可以消耗肿瘤细胞中的葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢(h2o2)。产生的葡萄糖酸导致较低的ph值和局部h2o2浓度的增加，可以加速hrp的催化效率，产生高细胞毒性的羟基自由基(·oh)，杀死肿瘤细胞。体外和体内的研究表明，酶纳米反应器gox/hrp-lnrs具有良好的生物相容性和体内外显著的抗肿瘤作用。

24、所述脂质体酶纳米反应器外层为生物相容性良好的脂质体，内部包含葡萄糖氧化酶，辣根过氧化物酶，两种酶在纳米反应器中区隔化时，实现了高效的级联反应。

25、与现有技术相比，本发明具有如下的特色及优点：本发明原理新颖，脂质体酶纳米反应器的制备方法简单，在保留酶活性的同时具有高效的级联反应效率，并将基于脂质体的酶纳米反应器用于催化抗肿瘤治疗。由葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶组成的纳米反应器消耗葡萄糖，产生具有高细胞毒性的·oh作为级联反应的最终产物。脂质体中两种酶的共区隔化产生了一个受限的微环境，增加了局部h2o2浓度，从而提高了串联反应的效率。该脂质体纳米反应器具有良好的生物相容性，在体内外均能有效抑制肿瘤生长，具有广阔的发展前景。

技术特征：

1.一种脂质体酶纳米反应器，其特征在于：包括脂质体；以及葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶，与所述脂质体复合。

2.根据权利要求1所述的一种脂质体酶纳米反应器，其特征在于，所述脂质体包括l-α-磷脂酰胆碱、胆固醇和1,2 -二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。

3. 根据权利要求2所述的一种脂质体酶纳米反应器，其特征在于，所述的脂质体酶纳米反应器中葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的负载量各自独立的为1~1000μg mg-1。

4. 根据权利要求2所述的一种脂质体酶纳米反应器，其特征在于，所述的脂质体酶纳米反应器中葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的负载量各自独立的为1~300μg mg-1。

5. 根据权利要求2所述的一种脂质体酶纳米反应器，其特征在于，所述的脂质体酶纳米反应器的流体动力学半径为1~1000 nm。

6. 根据权利要求2所述的一种脂质体酶纳米反应器，其特征在于，所述的脂质体酶纳米反应器的电动电势为-100~100 mw。

7.根据权利要求1-6任意一项所述的脂质体酶纳米反应器的制备方法，其特征在于，采用脂质体、葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶通过薄膜分散法和挤压法制备脂质体酶纳米反应器。

8.根据权利要求7所述的脂质体酶纳米反应器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求1-6任意一项所述的一种脂质体酶纳米反应器在制备抗肿瘤治疗材料或者药物中的应用。

技术总结
一种脂质体酶纳米反应器及制备方法和抗肿瘤治疗的应用，属于生物纳米医学技术领域。该脂质体酶纳米反应器外层为生物相容性良好的脂质体，内部包含葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶。脂质体酶纳米反应器使葡萄糖氧化物酶和辣根过氧化物酶在分隔化后发生级联反应，通过抑制肿瘤营养供应和产生高细胞毒性的羟基自由基（·OH），能够有效抑制肿瘤在体内外的生长，导致癌细胞凋亡。脂质体中的酶共区隔化增加了中间产物过氧化氢（H<subgt;2</subgt;O<subgt;2</subgt;）和酸的局部浓度，进一步加速辣根过氧化物酶介导的第二步产生细胞毒性·OH的反应，使整个级联反应达到较高的反应效率。本发明公开的这种脂质体酶纳米反应器具有高效的抗肿瘤能力，具有治疗肿瘤的临床潜力。

技术研发人员：孙文,王然,夏祥,贺毛毛,邱添,樊江莉,彭孝军
受保护的技术使用者：大连理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12