一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液的制作方法

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种含有重组17型人胶原蛋白酵母发酵产物滤液。

背景技术：

1、胶原蛋白是生物高分子，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，某些生物体内含量甚至在80%以上。胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，因此在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。

2、胶原蛋白在护肤产品中，一直具有广泛的应用。胶原蛋白分多种类型，常见的i型、iii型、iv型胶原蛋白，胶原分子量都在40kd以上，需要通过水解等方式得到较小的水解胶原，进而渗入皮肤发挥功效。胶原蛋白不仅具有纯天然的保湿、美白、防皱、祛斑等作用，而且胶原蛋白与人体皮肤胶原的结构相似，分子中富含大量氨基酸和亲水基，具有一定的表面活性和很好的生物相容性；同时，其分子中含有大量的羟基，因此它也有着相当好的保湿作用。

3、目前市售的胶原蛋白产品，大多提取于猪、牛、鱼等动物组织中，虽然这些动物体胶原与人源的胶原蛋白较为相似，但仍存在异源蛋白致敏的风险。尤其对敏感性肌肤，如痤疮、爆痘、过敏等，可能会加剧肌肤问题。相对而言，人源的胶原蛋白，在安全性上更具优势。但是由于人胶原蛋白的分子量过大，不适合直接应用于化妆品产品中，在使用时往往都需要通过水解、酶解等方式，因而一些胶原蛋白不能发挥其全部生物学活性。

4、人胶原蛋白17（hc17）型属于非纤维类胶原蛋白，是由三个胶原链结构形成的一个同源三聚体，单链分子量达180kda。人胶原蛋白17型中包含多段重复的螺旋结构序列，可以起到良好的支撑作用，同时具有耐高温、稳定性强等特点。目前，对此类人胶原蛋白的研究及应用并不广泛，尤其是在化妆品领域，应用较少。

5、利用酵母底盘直接生产含有重组人胶原蛋白17的化妆品原料，具有工艺简单、周期短、产品生物活性高等特点。同时，酵母发酵产物中包含多种天然代谢产物、细胞质成分、细胞壁组分和多糖复合物，经过发酵技术的洗礼，大分子营养物质被分解成小分子，更利于渗透肌肤屏障，深入到肌底滋养皮肤细胞。此外，直接由酵母底盘表达的重组人胶原蛋白17肽，是具有天然生物活性的益肤分子，进一步为皮肤细胞供能，有效维持肌肤活力。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液及其制备方法，以解决如何将17型人胶原蛋白应用于化妆品领域的技术问题。

2、为解决上述技术问题，本发明的一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液的具体技术方案如下：

3、一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液，包括如下三部分：（i）酵母发酵产物滤液；（ii）酵母溶胞产物；（ⅲ）重组17型人胶原蛋白。

4、进一步，所述重组17型人胶原蛋白（ⅲ）的含量为0.01%-0.1%。

5、进一步，所述的（i）为酿酒酵母菌株发酵产物滤液，其酿酒酵母菌株保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为cicc1002；或经优化的其他酵母菌株，更进一步的是酿酒酵母菌株。

6、所述的重组17型人胶原蛋白，其氨基酸序列如seq id no：1所示；

7、所述seq id no：1氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或与上述氨基酸序列至少有80%同源性的，且功能相同或相似的氨基酸序列。

8、本发明的第二目的在于提供一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液的制备方法，包括如下步骤：

9、步骤a、在质粒ycplac22上插入如seq id no：2所示的核苷酸序列，获得重组17型人胶原蛋白目的片段和表达载体；

10、步骤b、提取步骤a中的构建质粒的dna，并线性化，然后与酿酒酵母混合，转化完成后将其涂布于色氨酸缺陷型筛选培养基平板上，筛选阳性克隆，即获得含有重组17型人胶原蛋白基因的酿酒酵母底盘；

11、步骤c、将步骤b中得到的表达重组17型人胶原蛋白的酿酒酵母菌株，接种至ypda培养基，并于200rpm、28℃摇床内发酵约60h，通过离心、浓缩等工艺富集发酵产物，并对其进行高压均质破碎，破碎后得到含有多种酵母菌小分子代谢物的酵母溶胞产物（ii）；

12、步骤d、对步骤c中离心收集的发酵滤液，进行过滤除杂等工艺，得到含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液（i），将酵母溶胞产物（ii）与酵母发酵滤液（i）按照一定比例进行混合，得到一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液。

13、进一步，所述酵母溶胞产物（ii）与酵母发酵产物滤液（i）按照体积配比为1:10~1:1进行混合；

14、进一步，所述高压均质破碎采用梯度压力法进行，可以更好地保护代谢产物的天然活性，破碎压力依次为400pa、800pa、1200pa。

15、本发明的一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液的制备方法具有以下优点：

16、1、本发明提供的一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液，作为化妆品原料，具有保湿、修复、滋养肌肤等效果；

17、2、本发明提供的制备方法，省略了重组胶原蛋白17的纯化工艺，同时避免了由于纯化造成的蛋白损失、部分蛋白活性减弱等问题；

18、3、本发明得到的含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液，较复配的17型人胶原蛋白或者传统制备的酵母发酵产物滤液，具有更好的保湿及促细胞生长的性质。

技术特征：

1.一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液，其特征在于，所述发酵产物滤液包括三部分：（i）酵母发酵产物滤液；（ii）酵母溶胞产物；（ⅲ）重组17型人胶原蛋白 。

2.根据权利要求1所述的含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液，其特征在于，所述重组17型人胶原蛋白（ⅲ）的含量为0.01%-0.1%。

3.根据权利要求1所述的含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液，其特征在于，所述酵母菌株为酿酒酵母菌株。

4.根据权利要求3所述的含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液，其特征在于，所述酿酒酵母菌株保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为cicc1002。

5.根据权利要求1所述的含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液，其特征在于，所述重组17型人胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示。

6.根据权利要求1所述的含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液的制备方法，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，所述酵母溶胞产物（ii）与酵母发酵产物滤液（i）按照体积配比为1:10~1:1进行混合。

8.根据权利要求6所述的含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，所述高压均质破碎采用梯度压力法进行，可以更好地保护代谢产物的天然活性，破碎压力依次为400pa、800pa、1200pa。

技术总结
一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液，包括三部分：（I）酵母发酵产物滤液；（II）酵母溶胞产物；（Ⅲ）重组17型人胶原蛋白。本发明的酵母发酵产物滤液作为化妆品原料，具有保湿、修复、滋养肌肤等效果；本发明提供的制备方法，省略了重组胶原蛋白17的纯化工艺，同时避免了由于纯化造成的蛋白损失、部分蛋白活性减弱等问题；本发明得到的含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液，较复配的17型人胶原蛋白或者传统制备的酵母发酵产物滤液，具有更好的保湿及促细胞生长的性质。

技术研发人员：刘一琳,郑春阳
受保护的技术使用者：守正创新生物科技（天津）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14