一种神经再生修复支架的制备方法与流程

本发明涉及组织工程支架，尤其涉及一种神经再生修复支架的制备方法。

背景技术：

1、疾病、外伤、功能紊乱都可能导致神经系统的损伤，神经损伤导致运动和感觉功能丧失，甚至残疾。端-端缝合和自体移植是修复周围神经损伤的传统方法，然而端-端缝合不能修复长距离的周围神经缺损，且自体神经来源受限。

2、神经组织工程可以为神经组织的修复和重建提供理想的支架，目前有多种方法可以制备出神经组织的修复支架，如静电纺丝技术、3d打印技术和自组装技术等，但这些方法虽可以复合制备多功能的修复支架，但其在神经修复应用方面神经细胞的存活率较低，同时再生修复时间周期较长，不利于神经感觉和运动功能的快速恢复，影响患者康复周期，因此，本发明提出一种神经再生修复支架的制备方法以解决现有技术中存在的问题。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的在于提出一种神经再生修复支架的制备方法，该神经再生修复支架的制备方法通过使用自体骨髓间充质干细胞修饰制备的rada16自组装肽修复支架，可促进神经细胞的增殖，修复再生速度快，同时配合修饰的生物促进因子，可大大增加神经细胞的存活率，有效改善神经元轴突数目和纤维直径的恢复效果。

2、为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案实现：一种神经再生修复支架的制备方法，包括以下步骤：

3、步骤一、间充质干细胞的制备，取自体的骨髓细胞经处理后在细胞培养瓶中进行培养得到骨髓间充质干细胞，并在低温环境下保存备用；

4、步骤二、生物促进因子的制备，将神经营养因子和生物活性肽分别置于20ml的pbs缓冲液中适应处理，然后将含有神经营养因子和生物活性肽的pbs缓冲液共瓶混合处理，并保温备用；

5、步骤三、复合三维支架的合成，利用生物自组装纳米技术制备获得自组装肽rada16，然后将步骤一中培养得到的骨髓间充质干细胞制备成细胞悬浮液，并将自组装肽rada16置于细胞悬浮液中复合，经离心去上清得到复合三维支架；

6、步骤四、促进因子的修饰，将步骤三中的复合三维支架转移至步骤二中共瓶混合处理的混合液中进行支架修饰，离心去上清后得到修复支架。

7、进一步改进在于：所述步骤一中间充质干细胞的制备具体包括

8、s1、取自体的骨髓细胞使用含有1％的青链霉素基础培养基培养洗涤三次，然后用不含青链霉素的培养基洗涤一次得到骨髓组织；

9、s2、将得到的骨髓组织进行离心处理，随后向离心管中加入5倍体积含1％ⅰ型胶原酶的基础培养基吹打混匀；

10、s3、将混匀的含有基础培养基和骨髓组织的离心管进行消化震荡处理，随后使用细胞滤网进行过滤得到滤出液；

11、s4、将滤出液装入新的离心管再次进行离心处理，随后去除上清液使用完全培养基漂洗后接种于细胞培养瓶中培养得到骨髓间充质干细胞。

12、进一步改进在于：所述s1中进行三次洗涤时每次持续5min，所述s2中离心条件为在1000r/min条件下离心10min，所述s4中的离心条件为在1200r/min条件下离心5min。

13、进一步改进在于：所述s3中消化处理是在37℃的温度条件下置于含5％二氧化碳的培养箱中进行消化处理，期间每隔10min进行一次震荡，消化处理一小时后取出进行过滤，过滤时先使用100μm孔径的细胞滤网过滤一次，然后再使用40μm孔径的细胞滤网对第一次过滤得到的滤出液进行第二次过滤，即得到滤出液。

14、进一步改进在于：所述步骤二中加入神经营养因子和生物活性肽前先将两组20ml的pbs缓冲液水浴加热到37℃保温，随后将神经营养因子和生物活性肽分别置于不同管的pbs缓冲液中持续保温进行适应处理2h。

15、进一步改进在于：所述步骤三中细胞悬浮液的制备具体包括取步骤一中获得的骨髓间充质干细胞进行培养扩增，然后在细胞融合低于80％时使用消化液消化细胞，并进行洗涤后使用5％的人蛋白混悬，最后加入生理盐水制得细胞悬浮液。

16、进一步改进在于：所述步骤三中离心条件为在900r/min条件下离心处理8min，去上清后使用80μm的细胞滤网对去上清后的溶液进行过滤，得到滤出液即为复合三维支架。

17、进一步改进在于：所述步骤四中离心条件为在800r/min条件下离心处理5min，去上清后即得到修复支架。

18、本发明的有益效果为：本发明通过使用自体骨髓间充质干细胞修饰制备的rada16自组装肽修复支架，可促进神经细胞的增殖，修复再生速度快，同时配合修饰的生物促进因子，可大大增加神经细胞的存活率，有效改善神经元轴突数目和纤维直径的恢复效果，为神经组织工程修复提供了一种高效且快速的神经再生修复支架。

技术特征：

1.一种神经再生修复支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种神经再生修复支架的制备方法，其特征在于：所述步骤一中间充质干细胞的制备具体包括

3.根据权利要求2所述的一种神经再生修复支架的制备方法，其特征在于：所述s1中进行三次洗涤时每次持续5min，所述s2中离心条件为在1000r/min条件下离心10min，所述s4中的离心条件为在1200r/min条件下离心5min。

4.根据权利要求2所述的一种神经再生修复支架的制备方法，其特征在于：所述s3中消化处理是在37℃的温度条件下置于含5％二氧化碳的培养箱中进行消化处理，期间每隔10min进行一次震荡，消化处理一小时后取出进行过滤，过滤时先使用100μm孔径的细胞滤网过滤一次，然后再使用40μm孔径的细胞滤网对第一次过滤得到的滤出液进行第二次过滤，即得到滤出液。

5.根据权利要求1所述的一种神经再生修复支架的制备方法，其特征在于：所述步骤二中加入神经营养因子和生物活性肽前先将两组20ml的pbs缓冲液水浴加热到37℃保温，随后将神经营养因子和生物活性肽分别置于不同管的pbs缓冲液中持续保温进行适应处理2h。

6.根据权利要求1所述的一种神经再生修复支架的制备方法，其特征在于：所述步骤三中细胞悬浮液的制备具体包括取步骤一中获得的骨髓间充质干细胞进行培养扩增，然后在细胞融合低于80％时使用消化液消化细胞，并进行洗涤后使用5％的人蛋白混悬，最后加入生理盐水制得细胞悬浮液。

7.根据权利要求1所述的一种神经再生修复支架的制备方法，其特征在于：所述步骤三中离心条件为在900r/min条件下离心处理8min，去上清后使用80μm的细胞滤网对去上清后的溶液进行过滤，得到滤出液即为复合三维支架。

8.根据权利要求1所述的一种神经再生修复支架的制备方法，其特征在于：所述步骤四中离心条件为在800r/min条件下离心处理5min，去上清后即得到修复支架。

技术总结
本发明公开一种神经再生修复支架的制备方法，包括步骤一、间充质干细胞的制备，步骤二、生物促进因子的制备，步骤三、复合三维支架的合成，步骤四、促进修饰因子的修饰得到修复支架；本发明通过使用自体骨髓间充质干细胞修饰制备的RADA16自组装肽修复支架，可促进神经细胞的增殖，修复再生速度快，同时配合修饰的生物促进因子，可大大增加神经细胞的存活率，有效改善神经元轴突数目和纤维直径的恢复效果。

技术研发人员：钱运,王旭,范存义
受保护的技术使用者：上海市第六人民医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13