一种放疗增敏并激活远隔效应的中性粒细胞膜包裹纳米颗粒及其制备方法与应用

本发明属于医药领域，具体涉及一种放疗增敏并激活远隔效应的中性粒细胞膜包裹纳米颗粒及其制备方法与应用。

背景技术：

1、化疗、手术以及放射治疗(radiotherapy，rt)是目前临床的三大肿瘤治疗方式，目前超过50％的癌症患者接受放射治疗。部分接受rt的患者出现了“远隔效应”的激活，即在局部病灶上进行rt时，未照射病灶或转移病灶也随rt缩小的现象。近年来，免疫治疗与rt联合治疗于各类实体肿瘤实现了协同治疗的疗效，并诱导远隔效应的增强。

2、r837是toll样受体7激动剂，通过激活先天免疫反应表现出突出的抗肿瘤和抗病毒效应。已有研究表明r837可以增强rt诱导产生的抗肿瘤免疫。但r837水溶性低，难以系统给药，限制了其临床转化。通过纳米颗粒在实体瘤中的高通透性和滞留效应(enhancedpermeability and retention effect)能够显著提高药物在肿瘤的摄取，是目前解决脂溶性药物瘤内浸润效率低的主要方法。

3、近年来，利用细胞膜包裹进行表面修饰的纳米颗粒展现了更好的稳定性以及更丰富的生物学功能，为纳米颗粒在生物医学应用中创造了更多的可能性。多种来源的细胞膜能够通过挤出的方法制备细胞膜包裹的纳米颗粒，能够保留细胞膜表面原有的生物学功能。活化的中性粒细胞能够通过rt募集中性粒细胞的过程相关。当前仍未有报道明确中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒具备放疗后肿瘤的靶向性。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种协同放疗并激活远隔效应的中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒及其制备方法。该纳米颗粒制备成本低、在体内稳定性好，具有良好的放疗后肿瘤靶向性，能够显著协同放疗并激活远隔效应。

2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

3、一种中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒(r837@plga@neu)，包括r837@plga纳米颗粒以及包覆于所述纳米颗粒外部的活化的中性粒细胞膜；

4、其中，所述r837@plga纳米颗粒是利用plga聚合物对r837(咪喹莫特)进行包裹得到的。

5、进一步的，所述中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒的粒径为80-200nm。

6、进一步的，所述r837@plga纳米颗粒的粒径为60-150nm。

7、上述采用活化的中性粒细胞膜，是因为由于常规的中性粒细胞的生物活性较低，通过lps外来抗原激活后才具有显著的生物学效应。

8、本发明中所述的plga聚合物具体可为mpeg2000-bplga1000聚合物固体(r-pl1001-3kd，西安瑞禧生物)。

9、本发明提供的中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒的制备方法，包括下述步骤：

10、1)制备r837@plga纳米颗粒；

11、2)将所述r837@plga纳米颗粒与中性粒细胞膜混合后，通过挤出器得到新型纳米颗粒r837@plga@neu。

12、上述纳米颗粒r837@plga@neu的制备流程图如图1所示。

13、上述方法步骤1)中，制备r837@plga纳米颗粒的具体方法如下：将plga聚合物的丙酮溶液与r837的dmso溶液混合，分散均匀；再利用注射器将得到的r837与plga的混合溶液滴入搅拌状态下的双蒸水中，滴加后反应30-60min待水化形成纳米颗粒后，用旋蒸仪快速将有机溶剂蒸发，用双蒸水洗涤纳米粒子离心收集得到r837@plga，通过测定洗涤后得到的上清液r837浓度，计算r837的载药量以及合成得到的r837@plga的质量。

14、上述方法中，plga聚合物与r837的质量比可为1：2-1：3。

15、所述plga聚合物的丙酮溶液的具体配制方法如下：取plga聚合物固体10mg，溶解于1ml丙酮中，超声使其溶解分散均匀。

16、所述r837的dmso溶液的具体配制方法如下：取20mg的r837固体溶解于0.05mldmso中。

17、所述r837与plga的混合溶液的滴加速度可为1-2滴/s。

18、所述搅拌为磁力搅拌，其搅拌转速可为600-800rpm。

19、所述双蒸水的体积可为r837与plga的混合溶液体积的50-100倍。

20、上述方法步骤2)中，所述活化的中性粒细胞膜按照本领域的常规方法进行提取，制备方法如下：密度梯度离心的方法获得的中性粒细胞在含有lps(100ng/ml)培养24h以进行活化，活化后的中性粒细胞在0.25×pbs溶液中裂解后进行离心，通过梯度离心组合处理除去细胞内容物，获得活化的中性粒细胞的细胞膜。冻干后中性粒细胞膜能够保存在-80℃条件下，并进行精准称量。

21、上述方法步骤2)中，所述r837@plga纳米颗粒与中性粒细胞膜的质量配比为1：2-1：5。

22、上述方法步骤2)中，所述混合为低功率(60-100w)超声混合，

23、上述方法步骤2)中，所述挤出器的挤出孔径为200nm以及100nm。

24、本发明利用中性粒细胞膜制备的一种新型纳米颗粒r837@plga@neu能够通过表面分子大量募集于放疗后肿瘤，用于将r837递送到放疗后肿瘤并达到协同放疗并激活远隔效应的目的。

25、本发明还提供了上述中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒的应用。

26、本发明所提供的中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒的应用，包括下述1)-3)至少一方面：

27、1)在制备肿瘤放疗增敏剂中的应用；

28、2)在制备治疗肿瘤产品中的应用；

29、3)在制备抑制肿瘤组织生长的产品中的应用。

30、其中，所述肿瘤为实体肿瘤，包括结直肠癌、肝癌、食管癌、胃癌、乳腺癌和肺癌等。

31、所述肿瘤细胞，包括结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞和肺癌细胞等，具体可为ct26小鼠结肠癌细胞以及多种人源结直肠癌细胞(sw480、sw620、ht29、km12sm、hct116。

32、本发明利用新型纳米颗粒与放疗进行综合治疗，将小分子免疫激动剂递送到肿瘤以刺激肿瘤免疫的形成。在纳米颗粒r837@plga的基础上，利用中性粒细胞膜包裹制备新型纳米颗粒r837@plga@neu，相比较传统的纳米颗粒，具有更高的生物相容性，更长的在体代谢时间，本发明首次明确中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒能够靶向放疗后肿瘤组织，为激活远隔效应提出了一个崭新的方法，提高了r837在肿瘤的递送效率，明确了中性粒细胞膜制备的仿生纳米药物与放疗结合的可行性，具有较高的临床转化应用前景。

技术特征：

1.一种中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒r837@plga@neu，包括r837@plga纳米颗粒以及包覆于所述纳米颗粒外部的活化的中性粒细胞膜；

2.根据权利要求1所述的中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒r837@plga@neu，其特征在于：所述中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒的粒径为80-200nm；

3.权利要求1或2所述的中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒r837@plga@neu的制备方法，包括下述步骤：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，制备r837@plga纳米颗粒的具体方法如下：将plga聚合物的丙酮溶液与r837的dmso溶液混合，分散均匀；再利用注射器将得到的r837与plga的混合溶液滴入搅拌状态下的双蒸水中，滴加后反应30-60min待水化形成纳米颗粒后，用旋蒸仪快速将有机溶剂蒸发，用双蒸水洗涤纳米粒子离心收集得到r837@plga。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：

6.根据权利要求3-5中任一项所述的制备方法，其特征在于：

7.权利要求1或2所述的中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒r837@plga@neu的应用，包括下述1)-3)至少一方面：

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为实体肿瘤，包括结直肠癌、肝癌、食管癌、胃癌、乳腺癌和肺癌；

9.一种肿瘤放疗增敏剂，包括权利要求1或2所述的中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒r837@plga@neu。

10.一种治疗肿瘤的产品，包括权利要求1或2所述的中性粒细胞膜包裹的纳米颗粒r837@plga@neu。

技术总结
本发明公开了一种放疗增敏并激活远隔效应的中性粒细胞膜包裹纳米颗粒及其制备方法与应用。该中性粒细胞膜包裹纳米颗粒，包括R837@PLGA纳米颗粒以及包覆于所述纳米颗粒外部的活化中性粒细胞膜；其中，所述R837@PLGA纳米颗粒是利用PLGA聚合物对R837进行包裹得到的。本发明利用中性粒细胞膜制备的一种新型纳米颗粒R837@PLGA@Neu能够通过表面分子大量募集于放疗后肿瘤，用于将R837递送到放疗后肿瘤并达到协同放疗并激活远隔效应的目的。

技术研发人员：卢德华,高静,刘雅洁
受保护的技术使用者：北京大学深圳医院（北京大学深圳临床医学院）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13