一种猴痘病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种猴痘病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：

1、猴痘病毒(monkeypox virus，mpxv)属痘病毒科，正痘病毒属，与其同属的还有天花病、痘苗病毒和牛痘病毒等，mpxv基因组为长达196kb的双链dna，包含190个开放阅读框，编码约200种蛋白质，其中约100种为非结构蛋白，由于对mpxv的基础研究不多，所以目前只有少数mpxv的蛋白了解功能。

2、目前，尚无针对mpxv感染的特异性疫苗和药物。由于正痘病毒属成员的抗原存在交叉保护作用，天花疫苗对猴痘具有一定保护活性。研究表明，天花疫苗对mpxv具备85％的保护效率。流行病学调查表明，大约90％的mpxv确诊病例未曾感染其他痘病毒，大多数病例是在1980年who宣布天花病毒根除计划结束后出生的，并未接种过天花疫苗。fda批准了两款疫苗，用于针对包括猴痘在内的正痘病毒进行暴露前疫苗接种，分别是第二代疫苗acam2000和第三代疫苗jynneos。acam2000在本世纪初美国mpxv流行期间曾被证明可以减轻mpxv的症状。但存在副作用，包括心肌炎和心包炎，对部分人群(例如湿疹患者和孕妇)具有更高的风险，导致该疫苗不向公众提供，也未在mpxv流行地区使用。丹麦bavarian nordic公司以其特有的改良牛痘安卡拉病毒(modified vaccinia virus ankara–bavariannordic,mva-bn)技术平台为基础研发了非复制型天花-猴痘疫苗jynneos。与早期疫苗相比，jynneos等第三代减毒疫苗具有更好的安全性。jynneos疫苗于2019年9月获美国fda批准上市，该疫苗通过皮下注射的方式进行接种，可以引发机体产生对于mpxv高效的体液和细胞免疫反应，用于在18岁以上的高危成年人群中预防天花(smallpox)和猴痘(monkeypox)感染。2021年11月，美国国际人事理事会(acip)一致投票支持jynneos作为acam2000的替代方案。这是fda批准的唯一一款非复制型天花疫苗，也是全世界范围内唯一一个获批上市的猴痘疫苗。与acam2000不同，jynneos可用于特应性皮炎患者和免疫缺陷患者。但由于保护靶点尚未确定，一些免疫调节蛋白在人体中的功能和影响尚不清楚。而且，jynneos以28天的间隔接种两剂，因此在暴露后接种疫苗的情况下，第二剂可能为时已晚，无法帮助预防疾病，目前尚不清楚第一剂是否足以达到治疗效果。acam2000和jynneos都只被批准用于暴露人群的紧急免疫接种，而没有被批准用于一般人群。acam2000、jynneos和在研的亚单位与dna疫苗都没有防止mpxv感染效果的完整临床研究数据(接种者vs对照组)，这些疫苗是否能有效预防普通人群mpxv流行仍有待确定。

3、因此，仍需要开发有效和安全的新一代猴痘专用疫苗，便于在需要的时候，用于普通人群接种。

技术实现思路

1、本发明提供的一种猴痘病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用，旨在解决上述背景技术中存在的问题。相比于其他疫苗，亚单位疫苗具有良好的安全性，也适用于免疫力低下的群体。本发明提出的亚单位疫苗包含来自mpxv胞内成熟病毒颗粒(intracellularmature virus，imv)的m1r、a29l抗原蛋白和胞外包膜病毒颗粒(extracellular envelopedvirus，eev)的a35r、b6r抗原蛋白，与氢氧化铝(明矾)或cpg混合组成。小鼠肌肉注射二次亚单位疫苗可引起广泛的中和抗体和细胞反应，诱发强烈的细胞免疫和体液免疫应答。

2、为了实现上述技术目的，本发明主要采用如下技术方案：

3、第一方面，本发明公开了一种猴痘病毒亚单位疫苗，包括抗原和佐剂，所述抗原成分为猴痘病毒抗原蛋白m1r、a29l、a35r和b6r，所述猴痘病毒抗原蛋白m1r、a29l、a35r或b6r的尾部均加入his标签，猴痘病毒抗原蛋白m1r的氨基酸序列如seq id no.1所示，猴痘病毒抗原蛋白a29l的氨基酸序列如seq id no.2所示，猴痘病毒抗原蛋白a35r的氨基酸序列如seq id no.3所示，猴痘病毒抗原蛋白b6r的氨基酸序列如seq id no.4所示，

4、优选的，所述佐剂为氢氧化铝或cpg。

5、更优选的，所述佐剂为cpg。

6、第二方面，本发明公开了一种能编码猴痘病毒抗原蛋白m1r的核酸序列如seq idno.5所示，编码猴痘病毒抗原蛋白a29l的核酸序列如seq id no.6所示，编码猴痘病毒抗原蛋白a35r的核酸序列如seq id no.7所示，编码猴痘病毒抗原蛋白m1r的核酸序列如seq idno.8所示。

7、第三方面，本发明公开了一种如第一方面所述的猴痘病毒亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：

8、(1)分别构建含有能编码猴痘病毒抗原蛋白m1r、a29l、a35r或b6r的核苷酸序列的表达载体；

9、(2)将各所述表达载体转入宿主细胞进行表达培养，获得含有所述猴痘病毒蛋白的重组菌体；

10、(3)培养所述重组菌液，表达猴痘病毒抗原蛋白m1r、a29l、a35r或b6r；

11、(4)分离纯化猴痘病毒抗原蛋白m1r、a29l、a35r或b6r，辅以佐剂，制备猴痘病毒亚单位疫苗。

12、优选的，所述表达载体为pet-9a。

13、优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞。

14、在本发明的较佳实施方式中，步骤(4)中，当所述佐剂为氢氧化铝时，猴痘病毒抗原蛋白质量为m1r、a29l、a35r和b6r各10μg，氢氧化铝佐剂40μg；当所述佐剂为cpg时，猴痘病毒抗原蛋白质量为m1r、a29l、a35r和b6r各10μg，cpg790910μg，所述佐剂与各所述猴痘病毒抗原蛋白充分混匀，即得。

15、第四方面，本发明公开了一种如第一方面所述的猴痘病毒亚单位疫苗在猴痘病毒免疫中或制备预防猴痘病毒感染引起的疾病药物中的应用。

16、进一步的，所述猴痘病毒亚单位疫苗应用于猴痘病毒免疫时，接种2针剂。

17、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

18、本发明制备的猴痘病毒亚单位疫苗，小鼠肌肉注射二次该亚单位疫苗后可引起广泛的中和抗体和细胞免疫反应，诱发强烈的细胞免疫和体液免疫应答。

19、本发明制备的猴痘病毒亚单位疫苗，可以在需要的时候，用于普通人群接种，更加安全，应用范围更加广泛。

技术特征：

1.一种猴痘病毒亚单位疫苗，其特征在于，包括抗原和佐剂，所述抗原成分为猴痘病毒抗原蛋白m1r、a29l、a35r和b6r，所述猴痘病毒抗原蛋白m1r、a29l、a35r或b6r的尾部均加入his标签，猴痘病毒抗原蛋白m1r的氨基酸序列如seq id no.1所示，猴痘病毒抗原蛋白a29l的氨基酸序列如seq id no.2所示，猴痘病毒抗原蛋白a35r的氨基酸序列如seq id no.3所示，猴痘病毒抗原蛋白b6r的氨基酸序列如seq id no.4所示。

2.根据权利要求1所述的猴痘病毒亚单位疫苗，其特征在于：所述佐剂为氢氧化铝佐剂或cpg佐剂。

3.根据权利要求2所述的猴痘病毒亚单位疫苗，其特征在于：所述佐剂为cpg。

4.编码猴痘病毒抗原蛋白m1r的核酸序列如seq id no.5所示，编码猴痘病毒抗原蛋白a29l的核酸序列如seq id no.6所示，编码猴痘病毒抗原蛋白a35r的核酸序列如seq idno.7所示，编码猴痘病毒抗原蛋白m1r的核酸序列如seq id no.8所示。

5.如权利要求1-3任一项所述的猴痘病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的猴痘病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述表达载体为pet-9a。

7.根据权利要求5所述的猴痘病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞。

8.根据权利要求5所述的猴痘病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，当所述佐剂为氢氧化铝时，猴痘病毒抗原蛋白质量为m1r、a29l、a35r和b6r各10μg，氢氧化铝佐剂40μg；当所述佐剂为cpg时，猴痘病毒抗原蛋白质量为m1r、a29l、a35r和b6r各10μg，cpg790910μg，所述佐剂与各所述猴痘病毒抗原蛋白充分混匀，即得。

9.如权利要求1-3任一项所述的猴痘病毒亚单位疫苗在猴痘病毒免疫中或制备预防猴痘病毒感染引起的疾病药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述猴痘病毒亚单位疫苗应用于猴痘病毒免疫时，接种2针剂。

技术总结
本发明公开了一种猴痘病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用，涉及生物技术领域。包括抗原和佐剂，所述抗原成分为猴痘病毒抗原蛋白M1R、A29L、A35R和B6R，所述猴痘病毒抗原蛋白M1R、A29L、A35R或B6R的尾部均加入His标签，猴痘病毒抗原蛋白M1R的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，猴痘病毒抗原蛋白A29L的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，猴痘病毒抗原蛋白A35R的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，猴痘病毒抗原蛋白B6R的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明小鼠肌肉注射二次亚单位疫苗可引起广泛的中和抗体和细胞免疫反应，诱发强烈的细胞免疫和体液免疫应答，可以临床推广使用，在需要的时候，用于普通人群接种，更加安全，应用范围更加广泛。

技术研发人员：林吉辉,杨雪涛,杨稀丹,王鹏
受保护的技术使用者：深圳鹏泊生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14