一种原位沉积药物和基因的定向骨软骨支架的制备方法

本发明属于生物医用材料，特别涉及一种原位沉积药物和基因的定向骨软骨支架的制备方法。

背景技术：

1、临床上，新生软骨与软骨下骨的垂直整合以及随后的软骨下骨的构建对于减轻组织恶化至关重要。由于骨和软骨固有的异质性，骨和软骨同时再生是具有挑战性的，同时实现骨软骨再生是一个具有前景的研究方向。许多文献研究主要集中在骨软骨组织工程中的软骨支架上，往往忽略了软骨下骨再生的需要。

2、实现高质量骨软骨修复再生的关键在于构建具有原生组织仿生层次结构的骨软骨支架。目前，已经有很多技术来制造双层或多层骨软骨支架，例如水凝胶前驱体溶液分层制备法、3d打印、静电纺丝、微流体法、磁控法和浮力驱动法等。然而，现有的方法大都涉及复杂的多步骤制造过程，阻碍了它们的实际应用。如公开号为cn114681677a的中国专利公开了一种软骨支架材料及其在软骨支架构建中的应用，所述软骨支架材料包括水凝胶、软骨碎块和软骨细胞球。本申请将软骨碎块与软骨细胞球混合打印，两者相辅相成。以及如公开号为cn110368529a的中国专利公开了软骨或软骨下骨全层修复支架及其制备方法，该制备方法包括：制备梯度软骨架，制备双层支架，制备全层修复支架成品，其中该申请通过浮力驱动的制孔技术可以在软骨层构建出具有梯度密度的多孔结构。

3、水凝胶作为最典型的具有三维网状结构的高分子材料，因其具有高含水量、可调节的力学性能、优异的生物降解性和生物相容性等突出特点而受到广泛关注。水凝胶材料设计的进步彻底改变了解决生物医学问题的方式，包括骨软骨组织工程。由于其与天然细胞外基质的相似性，水凝胶是骨软骨组织最具吸引力的材料之一。

4、由于软骨和骨具有明显的异质性，需要将不同的药物或生长因子梯度加载到支架上持续响应释放，以进行骨和软骨同时修复。但是目前大多数支架还是依靠单一的生物活性因子来修复骨软骨，无法实现骨和软骨的同时修复和整合。

5、将生物活性因子负载到支架的方法有很多种，但是仅仅是物理吸附作用不够牢固，使用过程种药物疗效大打折扣。而坚韧的共价化学作用会影响生物活性因子的释放，增加了药物释放的不可控性。由于动态可逆的特性，物理作用是一种比物理吸附和共价交联更加高效和可控的药物负载方法。

6、因此，如何简化骨软骨支架的制备方法以及多因子整合同时实现软骨和骨的修复和整合，是目前本领域的研究热点。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种原位沉积药物和基因的定向骨软骨支架的制备方法，本发明提供的制备方法简单快速，制备得到的定向骨软骨支架具有稳定的机械性能、自愈能力、活性氧捕获能力和药物控释能力，且本发明提供的制备方法实现了多因子空间上的整合，同时实现软骨和骨的修复再生以及新生软骨和软骨下骨的整合。

2、本发明提供如下技术方案：

3、一种原位沉积药物和基因的定向骨软骨支架的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

4、(1)将水凝胶前驱体溶液倒入定制的模具中，制备图案化水凝胶膜，所述图案化水凝胶膜包括上层凹槽和下层凹槽；

5、(2)将含有软骨修复再生药物的纳米颗粒悬浮液和含邻苯二酚的多酚化合物/缓冲溶液转移到图案化水凝胶膜的上层凹槽中，在水凝胶膜上原位合成软骨修复药物@含邻苯二酚的多酚化合物纳米颗粒；

6、(3)将含有骨再生基因药物/cacl2和na2hpo4溶液转移到图案化水凝胶膜的下层凹槽中，在水凝胶膜上原位合成骨再生基因药物@无定形磷酸钙纳米颗粒；

7、(4)利用卷膜法将图案化水凝胶膜卷成圆柱形，形成定向骨软骨支架。

8、其中，在图案化水凝胶膜上设计凹槽部位是为了让纳米药物原位沉积提供空间位置。

9、本发明通过设计定向双层结构的图案化水凝胶，图案化水凝胶上设置有沉积纳米颗粒的凹槽，再利用金属离子及其配体的动态响应性，原位沉积在富含羟基和羧基的图案化水凝胶膜上，并通过卷膜法得到定向水凝胶骨软骨支架。

10、在步骤(1)中，所述水凝胶前驱体溶液为含羧基和羟基的高分子/金属离子凝胶。

11、所述含羧基和羟基的高分子为明胶及其衍生物、海藻酸盐及海藻酸盐衍生物、羧甲基纤维素或羧甲基壳聚糖；金属离子选自ag+、mg2+、zn2+、sr2+、mn2+、cu2+、mo2+、fe2+、、fe3+、al3+和ti4+。

12、其中，明胶及其衍生物选自甲基丙烯酸酐化明胶、2-脲基-4[lh]-嘧啶酮改性明胶和3-氨基-4-甲氧基苯甲酸改性明胶。

13、在步骤(2)中，所述软骨修复再生药物选自骨形态发生蛋白(bmp)、转移生长因子(tgf)，胰岛素样生长因子(igf)、血小板衍生生长因子(pdgf)、wnt5a蛋白、kartogenin(kgn)、姜黄素(curcumin)、穿心莲内酯(andrographolide)、淫羊藿苷(icariin)和富血小板血浆(rpr))，含邻苯二酚的多酚化合物为所有含邻苯二酚的化合物，选自多巴胺(da)、单宁酸(ta)茶多酚(类黄酮)、没食子酸(ga)、没食子酸丙酯、邻苯三酚(pg)、儿茶素没食子酸酯(ecg)、儿茶素((2r,3s)-2-(3,4-二羟基苯基)-3,4-二氢-2h-苯并吡喃-3,5,7-三醇)、表没食子儿茶素(egc)和表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg))。

14、在步骤(3)中，所述骨再生基因药物选自mir-26a、mir-146a、mir-542a、mir-27a、mir-23a、mir-24-2、mir-138、mir-34a、mir-22、mir-199a-5p、mir-1260a、mir-140-3p或mir-144-5。

15、优选地，所述上层凹槽和下层凹槽的长度比为0.5-1：2.5-2，所述上层凹槽和下层凹槽的宽度为0.5mm-12mm。优选地，上层凹槽和下层凹槽的长度比为1:2。

16、所述上层凹槽和下层凹槽的形状选自圆柱形、矩形或三角形。

17、所述原位沉积药物和基因的定向骨软骨支架直径为3-5mm，长度为3-5mm。优选地，所述定向骨软骨支架直径为4mm，长度为3mm。

18、与现有技术相比，本发明的技术效果在于：根据天然骨单元的哈弗氏管结构，利用卷膜法将得到水凝胶膜卷成一个圆柱即得到定向骨软骨支架。本发明的方法简单快速，避免复杂的制造过程，可以大幅度推广。本发明制备的骨软支架具有稳定的机械性能、自愈能力、活性氧捕获能力和药物控释能力。本发明实现了多生物活性因子在空间上的整合，得到定向骨软骨支架。软骨修复再生药物@含邻苯二酚的多酚化合物纳米颗粒和骨再生基因药物@磷酸钙纳米颗粒分别促进间充质干细胞的成软骨分化迁移和成骨分化迁移。多因子同时修复可以达到定向骨软骨支架在体内表现出最佳的软骨下骨和软骨再生以及新软骨与软骨下骨的整合，相关区域的糖胺聚糖和胶原积累显著增加。这种多因子纳米生物材料引导的骨软骨修复将成为临床治疗的一个新途径。

技术特征：

1.一种原位沉积药物和基因的定向骨软骨支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的原位沉积药物和基因的定向骨软骨支架的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述水凝胶前驱体溶液为含羧基和羟基的高分子/金属离子凝胶。

3.根据权利要求2所述的原位沉积药物和基因的定向骨软骨支架的制备方法，其特征在于，所述含羧基和羟基的高分子为明胶及其衍生物、海藻酸盐及海藻酸盐衍生物、羧甲基纤维素或羧甲基壳聚糖；金属离子选自ag+、mg2+、zn2+、sr2+、mn2+、cu2+、mo2+、fe2+、、fe3+、al3+和ti4+。

4.根据权利要求1所述的原位沉积药物和基因的定向骨软骨支架的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述软骨修复再生药物选自骨形态发生蛋白、转移生长因子，胰岛素样生长因子、血小板衍生生长因子、wnt5a蛋白、kartogenin、姜黄素、穿心莲内酯、淫羊藿苷或富血小板血浆，含邻苯二酚的多酚化合物为所有含邻苯二酚的化合物，选自多巴胺、单宁酸、茶多酚、没食子酸、没食子酸丙酯、邻苯三酚、儿茶素没食子酸酯、儿茶素、表没食子儿茶素或表没食子儿茶素没食子酸酯。

5.根据权利要求1所述的原位沉积药物和基因的定向骨软骨支架的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述骨再生基因药物选自mir-26a、mir-146a、mir-542a、mir-27a、mir-23a、mir-24-2、mir-138、mir-34a、mir-22、mir-199a-5p、mir-1260a、mir-140-3p或mir-144-5。

6.根据权利要求1所述的原位沉积药物和基因的定向骨软骨支架的制备方法，其特征在于，所述上层凹槽和下层凹槽的长度比为0.5-1：2.5-2，所述上层凹槽和下层凹槽的宽度为0.5mm-12mm。

7.根据权利要求1所述的原位沉积药物和基因的定向骨软骨支架的制备方法，其特征在于，所述上层凹槽和下层凹槽的形状选自圆柱形、矩形或三角形。

8.根据权利要求1所述的原位沉积药物和基因的定向骨软骨支架的制备方法，其特征在于，所述原位沉积药物和基因的定向骨软骨支架直径为3-5mm，长度为3-5mm。

技术总结
本发明公开了一种原位沉积药物和基因的定向骨软骨支架的制备方法：将水凝胶前驱体溶液倒入模具中，制备包括上层凹槽和下层凹槽的图案化水凝胶膜；将含有软骨修复再生药物的纳米颗粒悬浮液和含邻苯二酚的多酚化合物/缓冲溶液转移到上层凹槽中，在水凝胶膜上原位合成软骨修复药物@含邻苯二酚的多酚化合物纳米颗粒；将含有骨再生基因药物/CaCl<subgt;2</subgt;和Na<subgt;2</subgt;HPO<subgt;4</subgt;溶液转移到下层凹槽中，在水凝胶膜上原位合成骨再生基因药物@无定形磷酸钙纳米颗粒；根据天然骨单元哈弗氏管的结构，利用简单高效的卷膜法将图案化水凝胶膜卷成圆柱形，形成定向骨软骨支架。本发明提供的制备方法实现了多因子空间上的整合，同时实现软骨和骨的修复再生以及新生软骨和软骨下骨的整合。

技术研发人员：齐义营
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16