一种能够促进间充质干细胞球体形成的纳米纤维海绵及制备方法

本发明属于医药材料，具体而言，涉及一种能够促进间充质干细胞球体形成并清除活性氧自由基的纳米纤维海绵及制备方法。

背景技术：

1、我国糖尿病患者人数逐年上升，而伤口长时间不愈合是糖尿病常见的并发症，给患者带来极大的身心痛苦和经济压力。干细胞为糖尿病伤口的愈合带来了新的希望，但是干细胞在糖尿病伤口的功能的发挥依赖于递送方式及递送材料，并且当干细胞以多细胞球体(后简称干细胞球体)的方式进行递送不仅可以维持其干性，还可以提高其功能性。悬滴培养是传统培养多细胞球体的方式，但这往往需要复杂的实验环节、大量的劳动力和较长的周期。

2、具有三维拓扑结构的生物材料被证明能够直接影响干细胞的行为(例如，干细胞的粘附、迁移、自我更新和分化)，干细胞有望通过与这种材料共培养的方式高效得到干细胞球体，提高其功能性。在诸多生物材料中纳米纤维由于具有类细胞外基质结构，在组织修复领域具有广阔的应用前景。

3、但是传统的纳米纤维是平面二维结构，不能为多细胞球体的形成提供良好的立体微环境和结构指引，导致干细胞难以聚集形成干细胞球体。因此，迫切需要调整纳米纤维的结构和功能，促进干细胞形成多细胞球体。此外，考虑到糖尿病伤口处具有高的活性氧水平，调整后的纳米纤维还应具有对干细胞的保护功能，防止干细胞球体的活性及功能被活性氧破坏。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种能够促进间充质干细胞球体形成并能够清除活性氧自由基的纳米纤维海绵及其制备方法，该纳米纤维海绵具有三维立体形态的拓扑结构，能够通过促进间充质干细胞聚集形成间充质干细胞球体以长期维持间充质干细胞的活性，提高其功能性，，并且该纳米纤维海绵还具有清除活性氧自由基的能力，可协同间充质干细胞球体加速糖尿病伤口愈合。

2、为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种能够促进间充质干细胞球体形成的纳米纤维海绵的制备方法，所述方法包括：

3、(1)制备羟基苯甲醛接枝聚乙二醇：将氨基聚乙二醇和羟基苯甲醛溶于水中搅拌，得到羟基苯甲醛接枝聚乙二醇溶液。

4、(2)制备纳米纤维海绵：以羟基苯甲醛接枝聚乙二醇溶液为纺丝液进行静电纺丝，制备纳米纤维膜；将所述纳米纤维膜分散成短纳米纤维，之后冷冻，干燥，得到所述纳米纤维海绵；

5、(3)将间充质干细胞负载在纳米纤维海绵表面：将间充质干细胞播种至纳米纤维海绵上，表面的间充质干细胞自发聚集成为多细胞球体，得到负载有间充质干细胞球体的纳米纤维海绵。

6、在本发明一个实施方式中，所述羟基苯甲醛为3,4-二羟基苯甲醛，所述氨基聚乙二醇和3,4-二羟基苯甲醛的质量比为9:1～7:3，例如8:2。

7、在本发明一个实施方式中，将氨基聚乙二醇和3,4-二羟基苯甲醛溶于50℃去离子水中搅拌12小时。

8、在本发明一个实施方式中，还包括在静电纺丝的原材料中加入生长因子；所述生长因子选自血管内皮生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子中的一种或多种。

9、优选地，所述生长因子的添加量为0.5-2.5mg/ml。

10、在本发明一个实施方式中，所述静电纺丝的条件为：电压18kv-26kv，距离为11cm-18cm，液体流速为0.1ml/h。

11、在本发明一个实施方式中，所述步骤(2)包括：将浸入无水叔丁醇中的纳米纤维膜分散成短纳米纤维，并将短纳米纤维转入四周冷冻温度一致的条件中，冷冻温度范围为-20℃～-50℃，冷冻12-36小时后，冷冻干燥12-24小时，得到纳米纤维海绵。

12、在本发明一个实施方式中，所述步骤(2)还包括将得到的纳米纤维海绵放入150℃-170℃烘箱中，热交联5～20分钟的步骤。

13、例如，将纳米纤维海绵放入150℃烘箱中，热交联10分钟，得到产品纳米纤维海绵。

14、在本发明一个实施方式中，所述纳米纤维海绵中纳米纤维的直径为300-700nm，纳米纤维海绵的孔隙直径为30-50μm。

15、优选地，负载在纳米纤维海绵上的球状体间充质干细胞的直径为30-50μm。

16、在本发明一个实施方式中，所述步骤(3)中将间充质干细胞负载在复合纳米纤维海绵表面的步骤包括：

17、取小鼠皮下脂肪并剪碎，置于0.2％ⅰ型胶原酶，将该混合溶液置于37℃摇床中消化1小时，1000rpm离心10分钟，弃上清，用pbs洗涤沉淀物，再次1000rpm离心10分钟，弃上清，将沉淀物放于细胞培养基(含有10％胎牛血清、1％双抗)中培养，3天后用pbs清洗去除未贴壁的细胞，得到原代间充质干细胞；将间充质干细胞播种至复合纳米纤维海绵，表面的间充质干细胞自发聚集成为多细胞球体并负载在其表面，得到负载有间充质干细胞球体的纳米纤维海绵。

18、根据本发明另一个方面，还提供了一种能够促进间充质干细胞球体形成的纳米纤维海绵，其由上述制备方法制备而成。

19、在本发明一个实施方式中，所述纳米纤维海绵为疏松多孔纳米纤维结构；所述纳米纤维海绵的纤维直径为200-700nm，孔隙直径为30-50μm；负载在所述纳米纤维海绵上的球状体间充质干细胞直径为30-50μm。

20、本发明的有益效果：

21、1)本发明的纳米纤维海绵主要由氨基聚乙二醇、羟基苯甲醛组成，为疏松多孔纳米纤维结构，该纳米纤维海绵中间充质干细胞球体可以在材料上实现多细胞球体的自主构建：细胞与基质之间的粘附性是细胞自主构建成多细胞球体的重要指标。由于纳米纤维海绵特殊的表面疏松多孔结构以及聚乙二醇亲水性聚合物的存在，使得纳米纤维海绵具有更低的细胞-基质粘附性，为自主构建多细胞球体提供了基础。由于纳米纤维海绵中羟基苯甲醛的存在，使得纳米纤维海绵获得活性氧自由基清除能力。本发明通过对传统纳米纤维进行结构调整和组分优化，构建三维拓扑结构，使干细胞在其表面能够自主形成多细胞球体并不易被活性氧自由基损伤其活性和功能性。

22、2)本发明借助静电纺丝技术，通过后处理的方式，将传统纳米纤维膜构筑成为立体形态的三维纳米纤维海绵，并且协同原材料的配方设计，加速间充质干细胞聚集形成多细胞球体。海绵培养的间充质干细胞的活性与在细胞培养皿中培养的无显著差异，海绵培养的间充质干细胞的分泌蛋白浓度相较于在细胞培养皿中培养的高3倍左右，并且海绵能够保护间充质干细胞免受活性氧自由基的损伤。因此，递送间充质干细胞的生物材料可以维持间充质干细胞活性，提升其功能性。

23、3)本发明通过调整纳米纤维的结构和功能，为多细胞球体的形成提供良好的立体微环境和结构指引，促进干细胞形成多细胞球体，负载有间充质干细胞球体的纳米纤维海绵可以促进糖尿病伤口愈合。此外，考虑到糖尿病伤口处具有高的活性氧水平，调整后的纳米纤维还应具有对干细胞的保护功能，防止干细胞球体的活性及功能被活性氧破坏。

技术特征：

1.一种能够促进间充质干细胞球体形成的纳米纤维海绵的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述羟基苯甲醛为3,4-二羟基苯甲醛，所述氨基聚乙二醇和3,4-二羟基苯甲醛的质量比为9:1～7:3，例如8:2。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括在静电纺丝的原材料中加入生长因子；所述生长因子选自血管内皮生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝的条件为：电压18kv-26kv，距离为11cm-18cm，液体流速为0.1ml/h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)包括：

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)还包括将得到的纳米纤维海绵放入150℃-170℃烘箱中，热交联5～20分钟的步骤。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纳米纤维海绵中纳米纤维的直径为300-700nm，纳米纤维海绵的孔隙直径为30-50μm。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中将间充质干细胞负载在复合纳米纤维海绵表面的步骤包括：

9.一种权利要求1至8中任一项所述能够促进间充质干细胞球体形成的纳米纤维海绵的制备方法制备而成的纳米纤维海绵。

10.根据权利要求9所述的纳米纤维海绵，其特征在于，所述纳米纤维海绵为疏松多孔纳米纤维结构；所述纳米纤维海绵的纤维直径为200-700nm，孔隙直径为30-50μm；负载在所述纳米纤维海绵上的球状体间充质干细胞直径为30-50μm。

技术总结
本发明公开了一种能够促进间充质干细胞球体形成的纳米纤维海绵及其制备方法，包括：1)将氨基聚乙二醇和羟基苯甲醛溶于水中搅拌，得到羟基苯甲醛接枝聚乙二醇溶液；2)以羟基苯甲醛接枝聚乙二醇溶液为纺丝液进行静电纺丝，制备纳米纤维膜，然后分散成短纳米纤维，冷冻，干燥，得到纳米纤维海绵；3)将间充质干细胞播种至纳米纤维海绵上，表面的间充质干细胞自发聚集成为多细胞球体，得到负载有间充质干细胞球体的纳米纤维海绵。本发明制备的纳米纤维海绵能够加速间充质干细胞形成多细胞球体，递送间充质干细胞的生物材料可以维持间充质干细胞活性，促进糖尿病伤口愈合，还具有对干细胞的保护功能，防止干细胞球体活性及功能被活性氧破坏。

技术研发人员：张可欣,杨艳,张辰宇,侯超,单新航
受保护的技术使用者：太原科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16