本发明涉及一种生物的方法，具体是一种负载核酸及示踪剂工程化细胞外囊泡的制备方法。
背景技术：
1、细胞外囊泡（extracellular vesicles ,evs）是由绝大多数细胞类型释放且尺寸为纳米级的膜囊泡，目前的研究表明，细胞外囊泡存在不同的类型，包括外泌体、微囊泡和凋亡小体。外泌体被认为是最小的囊泡类型，大小从40-100 nm不等，起源于多囊泡体（mvb）的腔内出芽，mvb与质膜融合后释放外泌体。而微泡在尺寸上不均匀且起源于质膜的直接出芽。细胞在发生凋亡时也会释放一种成为凋亡小体的异质性囊泡。但由于囊泡大小的重叠和缺乏亚型特异性标记物，目前很难对三者进行纯化，将所有囊泡亚型统称为ev。
2、ev是一种天然的核酸运送载体，货物包括小和长rna、编码和非编码rna。因此是细胞间进行信息交换的媒介。细胞可以通过内源性分选机制将核酸打包到细胞外囊泡中，并组成性或在刺激后释放ev。随后可能被靶细胞内化，导致mrna和mirna的转移，从而导致靶蛋白的产生或沉默。因此将ev作为一种新的核酸药物传递平台使用引起研究人员的广泛兴趣。ev已表现出理想药物载体的许多特征，例如。ev具有内在的细胞靶向特性且能够克服血脑屏障等自然屏障，货物在循环过程中自然不容易被降解，值得注意的是ev几乎没有任何的免疫原性，临床试验已证明了ev在人体中的安全性。
3、尽管电动汽车在核酸药物递送方面具有巨大的前景，但ev的临床转化需要明确和优化其体内的生物分布，这是其治疗效果的重要决定因素，因为可以使药物更特异性地递送到目的组织。分子成像技术的进步使ev在体内的高分辨率示踪成为可能，为电动汽车的运输、生物分布、细胞摄取和分子机制提供了有价值的信息。断层扫描技术是一种高效、无创的成像技术，在临床转化方面具有优越的潜力。常见的断层扫描技术为计算机断层扫描(ct)和磁共振成像(mri)。金纳米颗粒和超顺磁性氧化铁纳米颗粒分别是ct和mri常见的对比剂。活体荧光成像技术能够进行无创伤定量示踪，其检测时间较快，无需注射底物。量子点是由硒化镉（cdse）、碲化镉（cdte）、硫化镉（cds）等核上包裹一层zns或cds组成的纳米晶或半导体纳米晶。量子点荧光强度高，稳定性好，抗光致漂白，通过改变量子点的粒径或纳米晶的组成来调节发光颜色。
4、无铜的点击反应可在较低的活性能垒下进行且没有细胞毒性过渡金属催化剂。因此非常适用于生物标记。本发明首先采用糖代谢标记法将叠氮基团引入细胞质膜并通过ev分泌机制传递至ev上，同时对示踪剂（金纳米颗粒，超顺磁性四氧化三铁，荧光量子点）进行环辛炔修饰。通过环辛炔与叠氮化物的发生1,3偶极环加成反应，将示踪剂与细胞外囊泡共价连接。此外药物装载使用电穿孔技术，将特定的核酸类药物（aso、sirna 、mirna、mrna）加载至ev中，获得的工程化ev可用于卵巢肿瘤的治疗与ev示踪。
技术实现思路
1、本发明目的在于提供一种负载核酸及示踪剂工程化细胞外囊泡的制备方法。
2、本发明再一目的在于，提供所述负载核酸及示踪剂工程化细胞外囊泡产品。
3、本发明又一目的在于，提供所述负载核酸及示踪剂工程化细胞外囊泡产品的应用。
4、本发明目的通过以下方案实现：一种负载核酸及示踪剂工程化细胞外囊泡的制备方法及应用，采用叠氮代谢糖蛋白标记物ac4mannaz与细胞共培养，在释放的ev表面生成叠氮基团；收获细胞上清来源的细胞外囊泡通过电穿孔技术将核酸类药物引入细胞外囊泡中；制备环辛炔修饰的纳米示踪剂与ev共孵育，将该示踪剂通过无铜点击化学连接于ev表面，获得用于卵巢肿瘤治疗的功能化细胞外囊泡，包含以下步骤：
5、 (1) 细胞培养与糖代谢标记：卵巢肿瘤细胞系采用1640完全培养基于37℃， 5%co2的条件下培养至对数期，更换含25-50μm糖蛋白标记物ac4mannaz无ev的条件培养基培养48 h，收集细胞上清液。
6、 (2) 细胞上清预处理：将收集的细胞上清依次通过 500 g 10 min，2000 g 20min，15000g 30 min 差速离心去除细胞上清中的细胞碎片和大囊泡，然后经0.22 μm的无菌滤膜过滤。
7、(3) ev的提取：通过超速离心、尺寸色谱排阻、超滤等方法收集上清中的ev。通过nta、tem和western bolt检测ev的颗粒数、形态和标志蛋白。
8、 (4) 核酸药物的负载：将约4-16 × 1011个ev使用稀释液稀释至200 μl，每100 μl为一组与核酸混合，将混合物转移到电穿孔杯中采用合适的程序进行电穿孔。
9、(5) 纳米示踪剂的制备：制备1-30 nm的纳米示踪纳米材料（如金纳米颗粒用于后续ct成像、荧光量子点用于荧光成像、超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒用于mri成像等）并用聚乙二醇化的环辛炔进行修饰。
10、(6) 纳米示踪剂与ev的连接：将叠氮基团修饰的ev与环辛炔修饰的纳米示踪剂混合，37℃孵育2 h，混合物经尺寸色谱排阻柱和50 k超滤管去除游离的纳米示踪剂。
11、工程化ev的应用：将5 × 1011个工程化ev腹腔注射于大鼠上皮卵巢癌原位模型中，每周2次。每日记录肿瘤体积变化，使用ct成像、mri成像、或荧光成像分析工程化ev的组织分布，后收获肿瘤组织进行治疗机理分析。
12、其中，示踪剂的选择为金纳米颗粒、荧光量子点、超顺磁性四氧化三铁类无机纳米材料。
13、优选的，示踪剂的颗粒粒径在1-30 nm间。
14、优选的，纳米示踪剂与细胞外囊泡的连接方式为叠氮-环辛炔间的无铜点击化学。
15、细胞外囊泡的母细胞为人或小鼠卵巢肿瘤细胞。
16、优选的，细胞外囊泡的提取方法为超速离心法、尺寸色谱排阻法、超滤法。
17、所述的核酸药物包括反义寡核苷酸（aso）、小干扰rna（sirna）、微小rna（mirna）、信使rna（mrna）等。
18、优选的，外泌体负载核酸药物的方法为电穿孔法。
19、本发明还提供了一种负载核酸及示踪剂工程化细胞外囊泡的产品。
20、本发明也提供了一种负载核酸及示踪剂工程化细胞外囊泡的产品在示踪技术中的应用，包括ct成像、mri成像、荧光成像。
21、本发明的优点在于结合核酸药物的递送与ev示踪，操作相对简单，成本低廉，为卵巢上皮肿瘤提供治疗方案，为ev的生物体内分布提供有效的研究工具。
22、细胞外囊泡是一种天然的核酸载体，在血液循环中稳定，能克服体内天然屏障且自身具有细胞靶向能力，因此作为核酸类药物的载体具有明显的优势。本发明通过电穿孔技术和代谢标记技术将核酸药物装载至细胞外囊泡中并用示踪剂修饰，该制备方法效率高，为卵巢上皮性肿瘤提供治疗方案。
1.一种负载核酸及示踪剂工程化细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，采用叠氮代谢糖蛋白标记物ac4mannaz与细胞共培养，在释放的细胞外囊泡表面生成叠氮基团；收集细胞上清来源的细胞外囊泡；通过电穿孔技术将核酸类药物引入细胞外囊泡中；制备环辛炔修饰的纳米示踪剂与细胞外囊泡共孵育，将该示踪剂连接于细胞外囊泡的表面，获得用于卵巢肿瘤治疗的功能化细胞外囊泡，包含以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种负载核酸及示踪剂工程化细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述的示踪剂的颗粒粒径在1-30 nm间。
3.根据权利要求1所述的一种负载核酸及示踪剂工程化细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，纳米示踪剂与细胞外囊泡的连接方式为叠氮-环辛炔间的无铜点击化学。
4.根据权利要求1所述的一种负载核酸及示踪剂工程化细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，细胞外囊泡的母细胞为人或小鼠卵巢肿瘤细胞。
5.根据权利要求1所述的一种负载核酸及示踪剂工程化细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，细胞外囊泡的提取方法为超速离心法、尺寸色谱排阻法、超滤法。
6.根据权利要求1所述的一种负载核酸及示踪剂工程化细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述的核酸药物包括反义寡核苷酸（aso）、小干扰rna（sirna）、微小rna（mirna）、信使rna（mrna）。
7.根据权利要求1所述的一种负载核酸及示踪剂工程化细胞外囊泡的制备方法及应用，其特征在于，外泌体负载核酸药物的方法为电穿孔法。
8.一种负载核酸及示踪剂工程化细胞外囊泡，根据权利要求1至7任一所述的制备方法得到的。
9.一种根据权利要求8所述的负载核酸及示踪剂工程化细胞外囊泡在ct成像、mri成像、荧光成像中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将5 × 1011个工程化细胞外囊泡腹腔注射于大鼠上皮卵巢癌原位模型中，每周2次，每日记录肿瘤体积变化，使用ct成像、mri成像、或荧光成像分析工程化细胞外囊泡的组织分布，后收获肿瘤组织用于治疗机理分析。