一种复方抗HPV生物蛋白及其应用的制作方法

本发明涉及hpv治疗，更具体地，涉及一种复方抗hpv生物蛋白及其应用。

背景技术：

1、宫颈癌是全世界范围内常见的女性恶性肿瘤。持续感染高危型人乳头瘤病毒（hpv）是发生宫颈癌的明确危险因素。hpv16是最常见的高危型hpv 之一。hpv编码的e6和e7早期癌蛋白的检测具有重要的生物学意义。然而目前尚无商业化、可应用于临床检测hpv16e7抗体。

2、卵黄抗体(immunoglobulin of yolk ,igy)是指特定抗原刺激禽类ｂ淋巴细胞，由ｂ细胞分化成浆细胞并由此分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体。卵黄抗体具有性质稳定、特异性强、制备成本低、口服安全等优点在家禽、家畜传染病的防治中已得到广泛的应用。

3、hpv蛋白敷料作为新型创面敷料既可以作为预防hpv感染的方式，又可以辅助治疗，无任何副作用，市场空间巨大。但是目前hpv蛋白敷料的疗效缓慢，并不能达到十分有效地中和hpv病毒的目的。

技术实现思路

1、针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种复方抗hpv生物蛋白及其应用。

2、具体而言，本发明首先是提供了一种复方抗hpv生物蛋白，所述复方抗hpv生物蛋白由以下重量比的原料组成：40-50%抗hpv病毒的特异性igy抗体、5-10%乳清蛋白、10-20%壳聚糖和5-10%泊洛沙姆以及余量蒸馏水配置成100％。

3、优选地，所述复方抗hpv生物蛋白由以下重量比的原料组成：40%抗hpv单链igy抗体、5%乳清蛋白、10%壳聚糖和5%泊洛沙姆以及余量蒸馏水配置成100％。

4、优选地，所述复方抗hpv生物蛋白由以下重量比的原料组成：45%抗hpv单链igy抗体、8%乳清蛋白、15%壳聚糖和8%泊洛沙姆以及余量蒸馏水配置成100％。

5、优选地，所述复方抗hpv生物蛋白由以下重量比的原料组成：50%抗hpv单链igy抗体、10%乳清蛋白、20%壳聚糖和10%泊洛沙姆以及余量蒸馏水配置成100％。

6、本发明的另一个目的在于提供了一种抗hpv单链igy抗体，所述抗hpv单链igy抗体是本发明首次分离纯化得到，所述抗hpv单链igy抗体的氨基酸序列如seq id no.1所示，进一步地，将密码子优化后，抗hpv单链igy抗体的编码序列如seq id no.2所示。

7、本发明的另一个目的在于提供了所述复方抗hpv生物蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下过程：

8、（1）按照重量比称取相关原料；

9、（2）首先将乳清蛋白、壳聚糖和泊洛沙姆在温水孵育中缓慢溶解于蒸馏水中，其间需要不断低温搅拌，得溶液a；

10、（3）将抗hpv单链igy抗体加入步骤（2）中的溶液a中，低温搅拌混合均匀，得溶液b；

11、（4）将溶液b经真空冷冻干燥后，即得得到本发明所述的复方抗hpv生物蛋白。

12、优选地，所述复方抗hpv生物蛋白可以与常见的药用辅料复配，剂型不限于膏剂、或凝胶剂、或栓剂。

13、本发明的另一个目的在于提供了一种抗hpv单链igy抗体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

14、（1）hpv16 e7全长蛋白获取：从hpv16全病毒质粒中扩增全长hpv16 e7（nc_001526.4）基因序列，将其扩增纯化产物与载体连接制备重组质粒，转化感受态细胞，并诱导表达hpv16 e7蛋白，经分离和纯化后得到hpv16 e7蛋白，经冷冻干燥后，将其至于-80℃保存备用。

15、（2）产蛋鸡免疫程序：初次免疫原为hpv16 e7蛋白(500µg) 加等体积弗氏完全佐剂( freunds complete adjuvant, fca) 充分混匀成乳剂, 常规碘酒、酒精消毒产蛋鸡胸部和翅膀下的4 个点分布式肌内注射2 ml 乳化液进行免疫。随后加强免疫的抗原为hpv16e7蛋白(250µg) 加弗氏不完全佐剂( freunds incomplete adjuvant, fia) 充分混匀间隔2周加强免疫2次。在加强免疫1 周后，收集鸡蛋，4 ℃下保存备用。

16、（3）特异性igy抗体的分离和纯化：分离收集蛋的蛋黄液，并加入5倍体积的pbs缓冲液，随后加入3.5%（w/v）的peg-6000，静置30min，经5000g离心后20min；采用脱脂棉过滤上清液，同时向上清液中加入硫酸铵盐析，使硫酸铵的饱和度达40％-50％，在4℃下静置12h；静置后离心，弃去上清液，得到沉淀物，按每毫升沉淀物加5-7ml pbs缓冲液溶解得到溶解液；将溶解液装入透析袋用蒸馏水透析除铵离子，最后一次改用pbs缓冲液透析；透析液除菌过滤，即得特异性的igy抗体提取液；经冷冻干燥后，将其至于-80℃保存备用。

17、（4）将步骤（3）中制备得到的特异性的igy抗体送至北京安必奇生物公司进行测序分析，将特异性的igy抗体的轻重链经过多肽连接子偶联即可得到所述抗hpv单链igy抗体。

18、优选地，所述多肽连接子包括(gggs)n重复单元。

19、进一步优先地，所述多肽连接子包括gggsgggs。

20、进一步地，本发明还提供了上述抗hpv单链igy抗体在制备复方抗hpv生物蛋白中的应用。

21、进一步地，本发明还提供了一种预防或治疗hpv病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括复方抗hpv生物蛋白。

22、优选地，所述试剂盒或试剂中还包括记载有执行所述治疗方法步骤的说明书。

23、优选地，上述所述检测hpv病毒的类型为hpv 16型。

24、本发明的优点如下：

25、（1）本发明首次提供的一种复方抗hpv生物蛋白，该复方抗hpv生物蛋白是以抗hpv单链igy抗体为有效成分，其中，乳清蛋白具有免疫活性，能够完整地进入近端小肠，起到保护小肠粘膜的功能，可以有效辅助抗hpv单链igy抗体的免疫效果；壳聚糖作为药物载体可以稳定抗hpv单链igy抗体，促进药物吸收，延缓或控制药物的溶解速度，帮助药物达到靶器官，并且抗酸、抗溃疡，防止药物对胃的刺激；泊洛沙姆可以增加抗hpv单链igy抗体在胃肠道中滞留时间增长，吸收增加，从而能提高药物的生物利用度，促进药剂的吸收。

26、（2）本发明首次针对hpv16 e7蛋白的抗hpv单链igy抗体，该类抗体经济易得，制备和纯化过程简单，成本相对于igg抗体而言更低，产量更高。

技术特征：

1.一种复方抗hpv生物蛋白，所述复方抗hpv生物蛋白由以下重量比的原料组成：40-50%抗hpv单链igy抗体、5-10%乳清蛋白、10-20%壳聚糖和5-10%泊洛沙姆以及余量蒸馏水配置成100％；

2.如权利要求1所述的复方抗hpv生物蛋白，其特征在于，所述复方抗hpv生物蛋白由以下重量比的原料组成：40%抗hpv单链igy抗体、5%乳清蛋白、10%壳聚糖和5%泊洛沙姆以及余量蒸馏水配置成100％。

3.如权利要求1所述的复方抗hpv生物蛋白，其特征在于，所述复方抗hpv生物蛋白由以下重量比的原料组成：45%抗hpv单链igy抗体、8%乳清蛋白、15%壳聚糖和8%泊洛沙姆以及余量蒸馏水配置成100％。

4.如权利要求1所述的复方抗hpv生物蛋白，其特征在于所述复方抗hpv生物蛋白由以下重量比的原料组成：50%抗hpv单链igy抗体、10%乳清蛋白、20%壳聚糖和10%泊洛沙姆以及余量蒸馏水配置成100％。

5. 一种抗hpv单链igy抗体，所述抗hpv单链igy抗体是本发明首次分离纯化得到，所述抗hpv单链igy抗体的氨基酸序列如seq id no.1所示，进一步地，将密码子优化后，抗hpv单链igy抗体的编码序列如seq id no.2所示。

6.权利要求5所述的抗hpv单链igy抗体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述多肽连接子包括(gggs)n重复单元。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述多肽连接子包括gggsgggs。

9.权利要求1-4任一项所述的复方抗hpv生物蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下过程：

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述复方抗hpv生物蛋白可以与常见的药用辅料复配，剂型不限于膏剂、或凝胶剂、或栓剂。

技术总结
本发明提供了一种复方抗HPV生物蛋白及其应用，该复方抗HPV生物蛋白是以抗HPV单链IgY抗体为有效成分，其中，乳清蛋白具有免疫活性，能够完整地进入近端小肠，起到保护小肠粘膜的功能，可以有效辅助抗HPV单链IgY抗体的免疫效果；壳聚糖作为药物载体可以稳定抗HPV单链IgY抗体，促进药物吸收，延缓或控制药物的溶解速度，帮助药物达到靶器官，并且抗酸、抗溃疡，防止药物对胃的刺激；泊洛沙姆可以增加抗HPV单链IgY抗体在胃肠道中滞留时间增长，吸收增加，从而能提高药物的生物利用度，促进药剂的吸收。本发明首次针对HPV16 E7蛋白的抗HPV单链IgY抗体，该类抗体经济易得，制备和纯化过程简单，成本相对于IgG抗体而言更低，产量更高。

技术研发人员：谢佰友,韩楚霖
受保护的技术使用者：浙江埃尔森生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15