基于新型反应路线在脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法与流程

本发明涉及疫苗，尤其涉及一种基于新型反应路线在脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法。

背景技术：

1、脑膜炎奈瑟菌是美国、欧洲和世界许多其他地区（包括撒哈拉以南非洲部分地区（称为非洲“脑膜炎带”）细菌性脑膜炎和败血症的主要原因。疾病通常由脑膜炎奈瑟菌血清型 a、b、c、y 或 w135 引起。脑膜炎球菌病的预防包括分离、化学预防和用可用的多糖疫苗接种疫苗。然而，多糖脑膜炎球菌疫苗（即a和c;a、c 和 w135;或 a、c、y 和 w135）最初在儿童中通常免疫原性差或需要重复给药并且不产生持久的免疫力。结合疫苗技术已非常成功地用于预防其他细菌性脑膜炎病原体的儿童疫苗，包括针对血清型b型流感嗜血杆菌（hib）的疫苗，以及最近的七价和九价结合肺炎球菌疫苗。新发布的针对血清型脑膜炎奈瑟菌的脑膜炎球菌结合疫苗对幼儿和青少年非常有效，副作用最小。脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗是通过化学键的方式将荚膜多糖与各种载体蛋白结合，形成稳定的化学结构，使原本的t细胞非依赖性抗原转变为t细胞依赖性抗原。多糖蛋白结合疫苗能有效地激发2岁以下儿童以及免疫缺陷者的免疫反应与免疫记忆，且保护时间长。相比多糖疫苗，多糖蛋白结合疫苗的覆盖年龄范围更广，免疫效果更好，优势相当明显。因此，采用多价脑膜炎球菌多糖结合疫苗来预防流行性脑膜炎是现如今最佳医疗的策略。

2、crm197载体蛋白已在结合疫苗研究及应用领域得到了广泛的应用，特别是在hib、脑膜炎球菌及肺炎球菌结合疫苗中获得成功。但国内以crm197作为载体蛋白上市的疫苗较少。由于crm197蛋白具有无毒的特点，且作为载体蛋白不需要进行脱毒处理，便含有更多的赖氨酸基团作为潜在的多糖共轭位点。

3、目前常见的结合疫苗策略一是采用adh（己二酸二酰肼）为连接剂，利用多糖上面的羟基，用酰胺化的化学结合方法与蛋白连接形成超级网格状的多糖蛋白结合物；策略二是采用高典酸纳等氧化剂，氧化多糖上面的羟基为醛基，然后与蛋白形成席夫碱，采用还原胺化的化学结合方法形成网格状的多糖蛋白结合物。因此，开发不同的多糖蛋白结合方法还是必要的；

4、为此，我们设计一种基于新型反应路线在脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，用于对上述技术问题提供另一种技术方案。

技术实现思路

1、基于此，有必要针对上述技术问题，提供一种基于新型反应路线在脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，解决上述背景技术中提出的技术问题。

2、为了解决上述的技术问题，本发明采用了如下技术方案：

3、一种基于新型反应路线在脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，步骤如下：

4、s1：先将解聚的脑膜炎球菌多糖与n,n'-羰基二反应，形成多糖与cdt的衍生物；

5、s2：将多糖衍生物与胱胺反应，形成二硫化物多糖；

6、s3：将二硫化物多糖经过tcep反应生成硫基化多糖；

7、s4：将crm197蛋白用溴乙酸 n-羟基琥珀酰亚胺酯活化，形成crm197溴化物；

8、s5：硫基化多糖与crm197溴化物反应形成硫醚；再加入氯代乙酰胺最后形成多糖-（2-（（2-氧乙基）硫代）乙基）氨基甲酸酯-crm197蛋白结合物。

9、作为本发明提供的所述的一种基于新型反应路线在脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法的一种优选实施方式，所述s1步骤中，将a、c、y、w135群精糖原液经过高压均质后，得到破碎的a、c、y、w135群多糖溶液。

10、作为本发明提供的所述的一种基于新型反应路线在脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法的一种优选实施方式，所述s1步骤中，在a、c、y、w135群精糖溶液中加入0.2m naoh溶液，并调节ph值范围为9.0~10.0，加入0.5mol/l的n,n'-羰基二,在25℃下反应两小时，形成多糖与cdt的衍生物；将样品超滤，除去未反应的小分子杂质。

11、作为本发明提供的所述的一种基于新型反应路线在脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法的一种优选实施方式，所述s2步骤中，向多糖与cdt的衍生物中加入2mol/l的胱胺，然后加入1m的naoh溶液调节ph为9.0，在25℃下反应6小时，得到二硫化物多糖；将样品超滤，除去未反应的小分子杂质。

12、作为本发明提供的所述的一种基于新型反应路线在脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法的一种优选实施方式，所述s3步骤中，向二硫化物多糖多糖中加入1mol/l的tcep，加入1m的naoh溶液调节ph为9.0，在25℃下反应12小时，形成硫基化多糖；将样品超滤，除去未反应的小分子杂质。

13、作为本发明提供的所述的一种基于新型反应路线在脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法的一种优选实施方式，所述s4步骤中，向crm197蛋白中加入溴乙酸 n-羟基琥珀酰亚胺酯，加入tirs缓冲液，调节ph为8的弱碱性，在25℃下反应12小时，形成crm197蛋白溴化物；将样品超滤，除去未反应的小分子杂质。

14、作为本发明提供的所述的一种基于新型反应路线在脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法的一种优选实施方式，所述s5步骤中，将crm197蛋白溴化物加入s4形成的硫基化多糖中，加入1m的naoh溶液调节ph为9.0，反应4小时，形成硫醚；然后加入加入氯代乙酰胺最后形成多糖-（2-（（2-氧乙基）硫代）乙基）氨基甲酸酯（etec）-crm197蛋白结合物。

15、可以毫无疑义的看出，通过本申请的上述的技术方案，必然可以解决本申请要解决的技术问题。

16、同时，通过以上技术方案，本发明至少具备以下有益效果：

17、本发明提供的一种基于新型反应路线在脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，通过对制备方法的改进，从而能够添加crm197蛋白后形成多糖-（2-（（2-氧乙基）硫代）乙基）氨基甲酸酯（etec）-crm197蛋白结合物。

技术特征：

1.一种基于新型反应路线在脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤如下：

2.根据权利要求1所述的一种基于新型反应路线在脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述s1步骤中，将a、c、y、w135群精糖原液经过高压均质后，得到破碎的a、c、y、w135群多糖溶液。

3.根据权利要求2所述的一种基于新型反应路线在脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述s1步骤中，在a、c、y、w135群精糖溶液中加入0.2m naoh溶液，并调节ph值范围为9.0~10.0，加入0.5mol/l的n,n'-羰基二,在25℃下反应两小时，形成多糖与cdt的衍生物；将样品超滤，除去未反应的小分子杂质。

4.根据权利要求1所述的一种基于新型反应路线在脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述s2步骤中，向多糖与cdt的衍生物中加入2mol/l的胱胺，然后加入1m的naoh溶液调节ph为9.0，在25℃下反应6小时，得到二硫化物多糖；将样品超滤，除去未反应的小分子杂质。

5.根据权利要求1所述的一种基于新型反应路线在脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述s3步骤中，向二硫化物多糖多糖中加入1mol/l的tcep，加入1m的naoh溶液调节ph为9.0，在25℃下反应12小时，形成硫基化多糖；将样品超滤，除去未反应的小分子杂质。

6.根据权利要求1所述的一种基于新型反应路线在脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述s4步骤中，向crm197蛋白中加入溴乙酸 n-羟基琥珀酰亚胺酯，加入tirs缓冲液，调节ph为8的弱碱性，在25℃下反应12小时，形成crm197蛋白溴化物；将样品超滤，除去未反应的小分子杂质。

7.根据权利要求1所述的一种基于新型反应路线在脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述s5步骤中，将crm197蛋白溴化物加入s4形成的硫基化多糖中，加入1m的naoh溶液调节ph为9.0，反应4小时，形成硫醚；然后加入加入氯代乙酰胺最后形成多糖-（2-（（2-氧乙基）硫代）乙基）氨基甲酸酯（etec）-crm197蛋白结合物。

技术总结
本发明涉及疫苗技术领域，尤其涉及一种基于新型反应路线在脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法。步骤如下：S1：先将解聚的脑膜炎球菌多糖与N,N'‑羰基二反应，形成多糖与CDT的衍生物；S2：将多糖衍生物与胱胺反应，形成二硫化物多糖；S3：将二硫化物多糖经过TCEP反应生成硫基化多糖；S4：将CRM197蛋白用溴乙酸N‑羟基琥珀酰亚胺酯活化，形成CRM197溴化物；S5：硫基化多糖与CRM197溴化物反应形成硫醚。本发明提供的一种基于新型反应路线在脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，通过对制备方法的改进，从而能够添加CRM197蛋白后形成多糖‑（2‑（（2‑氧乙基）硫代）乙基）氨基甲酸酯（eTEC）‑CRM197蛋白结合物。

技术研发人员：黄杰,魏鑫,姚永鹏,张子昌,许可,李松,朱慧,杨刚强,曾伟
受保护的技术使用者：成都康华生物制品股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15