一株解淀粉芽孢杆菌的筛选方法及基因工程方法

本发明涉及微生物，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌的筛选方法及基因工程方法。

背景技术：

1、产气荚膜梭菌感染对生猪健康养殖造成严重威胁，产生猪生长性能下降，腹泻增加等问题。同时，产气荚膜梭菌可以引发疾病，甚至会导致畜禽的死亡，给畜牧业造成巨大的经济损失，另外产气荚膜梭菌的致病性也会引发食品安全问题，由于动物产品的产气荚膜梭菌含量超标会导致人类食源性疾病的发生。此外，根据以往数据显示，饲料中添加抗生素会减少产气荚膜梭菌等致病菌的含量，但会导致抗生素相关耐药基因的水平传播和垂直传播风险增加。因此找到一种安全高效、绿色健康的抗菌添加剂是解决此类问题的一种有效途径。

2、生猪的健康养殖重中之重是维持猪的肠道健康，确保肠道营养物质吸收和免疫功能的正常运转。仔猪的断奶阶段是由液体猪奶向固体饲料过渡的一个时期，是肠道菌群形成的关键“窗口期”，较易受到产气荚膜梭菌的影响，可能会由产气荚膜梭菌的致病而引发死亡。如何高效、安全的解决由于产气荚膜梭菌对生猪养殖所带来的问题，是当前畜禽养殖的研究热点之一。

3、益生菌具有安全高效、绿色健康等特点，不仅能够促进宿主健康的肠道菌群的建立，参与宿主营养物质吸收，免疫调节等过程，而且同时可以防止致病菌损伤动物的肠道健康，特别是在仔猪断奶阶段，使用益生菌作为预防措施可以有效提高仔猪肠道健康程度。解淀粉芽孢杆菌是与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，其在生长过程中可以产生一系列能够抑制细菌和真菌活性的代谢产物。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了一株解淀粉芽孢杆菌的筛选方法及基因工程方法。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、一种解淀粉芽孢杆菌的筛选方法，鉴定菌株的次级代谢基因、毒力因子、抗生素耐药基因：1)筛选具有抑制致病菌的能力的次级代谢簇基因，包括bacillaene(多烯类)、macrlactin h(大环内酰亚胺h)、bacilysin(抗菌二肽溶杆菌素)和bacillibatin(儿茶酚型嗜铁素)和fengycin(芬荠素脂肽)；

4、2)根据毒力因子数据库(vfdb)筛选攻击型毒力因子(offensive virulencefactors)、防御型毒力因子(defensive virulence factors)和非特异型毒力因子(non-specific virulence factors)，筛选具有无毒力或低毒力的益生菌菌株；

5、3)根据抗生素综合抗生素耐药性数据库(card)对菌株基因组进行分析，包括林可酰胺类抗生素(lincosamide antibiotic)、大环内酯类抗生素(macrolide antibiotic)、链球菌素类抗生素(streptogramin antibiotic)、恶唑烷酮类抗生素(oxazolidinoneantibiotic)、苯尼考尔抗生素(phenicol antibiotic)和短侧耳菌素(pleuromutilinantibiotic)，筛选不具有抗生素耐药基因或具有较少抗生素耐药基因的益生菌；

6、4)所述的解淀粉芽孢杆菌，用于制备预防断奶仔猪产气荚膜梭菌感染中的直接饲用微生物或饲料，用于预防产气荚膜梭菌感染，降低肠道炎症损伤，提高断奶仔猪生产性能和营养物质表观消化率，降低腹泻率和肠道通透性，维持肠道物理屏障，提高仔猪免疫功能、十二指肠消化酶活力和抗氧化能力。

7、一种解淀粉芽孢杆菌的基因工程方法，对现有不具备抑菌能力的芽孢杆菌类亲缘菌株的次级代谢基因进行编辑后，引入ba40所携带的次级代谢基因，使得细菌携带有ba40的bacillibactin、bacilysin、macrolactin h、bacillaene和fengycin次级代谢基因簇，同时通过基因编辑敲除菌株毒力因子相关基因及相关抗生素耐药基因，从而具有如上述的次级代谢基因、毒力因子、抗生素耐药基因。

8、本发明的有益效果是：

9、1.解析几株益生菌包括解淀粉芽孢杆菌ba40在内的基因组成，首次揭示其次级代谢簇基因、毒力因子基因和抗生素耐药基因，用于解淀粉芽孢杆菌的筛选和基因工程编辑。

10、2.减少产气荚膜梭菌对仔猪的肠道损伤，降低肠道损伤评分和腹泻发生率。

11、3.提高仔猪生长性能和营养物质表观消化率，维持肠道物理屏障，提高仔猪免疫功能、十二指肠消化酶活力和抗氧化能力。

技术特征：

1.一种解淀粉芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，鉴定菌株的次级代谢基因、毒力因子、抗生素耐药基因：

2. 一种解淀粉芽孢杆菌的基因工程方法，其特征在于，对现有不具备抑菌能力的芽孢杆菌类亲缘菌株的次级代谢基因进行编辑后，引入ba40所携带的次级代谢基因，使得细菌携带有ba40的bacillibactin、bacilysin、macrolactin h、bacillaene和fengycin次级代谢基因簇，同时通过基因编辑敲除菌株毒力因子相关基因及相关抗生素耐药基因，从而具有如权利要求1中所述的次级代谢基因、毒力因子、抗生素耐药基因。

技术总结
本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌的筛选方法及基因工程方法。鉴定菌株的次级代谢基因、毒力因子、抗生素耐药基因；筛选具有抑制致病菌的能力的次级代谢簇基因，包括Bacillaene（多烯类）、Macrlactin H（大环内酰亚胺H）、Bacilysin（抗菌二肽溶杆菌素）和Bacillibatin（儿茶酚型嗜铁素）和Fengycin（芬荠素脂肽）；根据毒力因子数据库（VFDB）筛选具有无毒力或低毒力的益生菌菌株；根据抗生素综合抗生素耐药性数据库（CARD）对菌株基因组进行分析，筛选不具有抗生素耐药基因或具有较少抗生素耐药基因的益生菌；所述的解淀粉芽孢杆菌，用于制备预防断奶仔猪产气荚膜梭菌感染中的直接饲用微生物或饲料，用于预防产气荚膜梭菌感染，降低肠道炎症损伤等。

技术研发人员：汪以真,姜子鹏,苏维发,杨铭志,龚焘,靳明亮,路则庆,王凤芹,王新霞
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15