敲低METTL5基因的shRNA及其应用

本发明涉及分子生物学与基因工程领域，涉及敲低mettl5基因的shrna及其应用。

背景技术：

1、肺癌是起源于肺部支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤，目前位居全球肿瘤发病率第二和死亡率第一。肺癌根据生物学，治疗和预后分为两大类，小细胞肺癌(sclc)和非小细胞肺癌(nsclc)。非小细胞肺癌(nsclcs)占肺肿瘤的85％。超过20％的非小细胞肺癌(nsclcs)在诊断时已是晚期，只进行局部治疗(手术或放疗)的患者总生存率较差，大多数死于远处转移。nsclc患者生存率改善的原理尚未研究清楚且易产生耐药，原发性或继发性耐药最终会导致所有晚期疾病患者的治疗失败。因此研究治疗相关的新分子机制和靶点十分重要。

2、甲基转移酶样蛋白5(mettl5)是一种甲基转移酶，可以催化某些结构化rrna上的m6a。人metll5是一种24kda蛋白，需要与已知的甲基转移酶激活剂trmt112形成异二聚体复合从而在细胞中获得代谢稳定性，发挥甲基转移酶活性。mettl5在整个成人体内的所有组织中具有低但普遍存在的表达，且mettl5主要在细胞质中表达。人类rrna中只有两个m6a位点，即大亚基28sa4220位和小亚基18sa1832位，这些修饰位于核糖体内功能重要的区域，rrna的修饰会影响核糖体结构和功能，包括解码，停留时间，肽基转移，与trna，mrna和翻译因子的相互作用，因此mettl5可能对翻译至关重要。不同肿瘤中甲基转移酶样蛋白影响存在差异，特别是肺癌未见敲低mettl5后对其影响。

技术实现思路

1、本发明的首要目的在于提供两种靶向敲低mettl5基因的shrna。

2、本发明的另一目的在于提供所述一种靶向敲低mettl5基因的质粒系统的应用。

3、本发明的再一目的在于提供mettl5敲低的非小细胞肺癌细胞株。

4、本发明的再一目的在于提供一种敲低mettl5基因的方法在探究mettl5对非小细胞肺癌增殖影响中的应用，用以解决上述背景技术中提出的问题。

5、技术方案

6、一种shrna在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用，其特征在于：

7、所述shrna包括shmettl5-1或shmettl5-2，其中

8、shmettl5-1包括如下序列：

9、shmettl5-1 oligo1：

10、5'accgggtcattcgatacagtaattatctcgagataattactgtatcgaatgacttttttg3'；

11、shmettl5-1 oligo2：

12、5'cgaacaaaaaagtcattcgatacagtaattatctcgagataattactgtatcgaatgacc3'；

13、shmettl5-2包括如下序列：

14、shmettl5-2 oligo1：

15、5'accgggccagcatcatacaagtttcactcgagtgaaacttgtatgatgctggcttttttg3'；

16、shmettl5-2 oligo2：

17、5'cgaacaaaaaagccagcatcatacaagtttcactcgagtgaaacttgtatgatgctggcc3'。进一步而言，所述的shrna靶向敲低mettl5基因，shmettl5-1或shmettl5-2在细胞内转录后可形成发夹结构，如图1。

18、进一步，靶向敲低mettl5基因非小细胞肺癌细胞的构建方法，包括如下步骤：

19、s1：针对mettl5基因cds区不同位置设计两对shrna oligo，退火使两条oligo成双链；

20、s2：将prsi9-u6-(sh)-ubic-tagrfp-2a-puro载体用bbsi酶切形成线性化载体。载体线状化酶切回收；

21、s3：将上述退火后的oligo和载体连接；

22、s4：转化涂板单克隆鉴定；

23、s5：包装空载体及敲低mettl5质粒的慢病毒；

24、s6：病毒感染人非小细胞肺癌细胞，在感染敲低病毒的非小细胞肺癌细胞株中加入嘌呤霉素，进行筛选，构建稳定转染细胞株，westernblot检测mettl5的敲低效率。

25、s1-s4为shrna质粒的构建过程，其通过短发夹rna干扰mettl5的表达实现。

26、一种靶向敲低mettl5基因非小细胞肺癌细胞在制备作为药物筛选靶点或工具中的应用。

27、有益效果

28、与现有技术相比，本敲低mettl5基因的方法及其在探究mettl5对非小细胞肺癌增殖影响中的应用具有以下优点：

29、本发明设计的shrna对非小细胞肺癌有抑制作用，其可以通过敲低人非小细胞肺癌细胞的mettl5基因实现。

30、本发明利用稳定敲低人mettl5基因的方法制备的质粒稳定转染人非小细胞肺癌细胞后，即可使人非小细胞肺癌细胞的mettl5基因敲低，因此本发明提供了mettl5敲低细胞或shrna运用于研究mettl5对非小细胞肺癌细胞增殖的影响，提供一个非小细胞肺癌治疗的可能靶点或工具。

技术特征：

1.一种shrna在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用，其特征在于：

2.一种靶向敲低mettl5基因非小细胞肺癌细胞的构建方法，包括如下步骤：

3.一种根据权利要求2所述的方法获得的靶向敲低mettl5基因非小细胞肺癌细胞在制备作为药物筛选靶点或工具中的应用。

技术总结
本发明涉及分子生物学与基因工程领域，涉及敲低METTL5基因的shRNA及其应用；所述的shRNA靶向敲低METTL5基因，shMETTL5‑1或shMETTL5‑2在细胞内转录后可形成发夹结构；本发明设计的shRNA对非小细胞肺癌有抑制作用，其可以通过敲低人非小细胞肺癌细胞的METTL5基因实现。利用稳定敲低人METTL5基因的方法制备的质粒稳定转染人非小细胞肺癌细胞后，即可使人非小细胞肺癌细胞的METTL5基因敲低，可将该种方法运用于研究METTL5对非小细胞肺癌细胞增殖的影响，以及提供一个非小细胞肺癌治疗的可能靶点或工具。

技术研发人员：周君,李秋杰,原晶莹
受保护的技术使用者：中国药科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15