一种半月板损伤致创伤性膝骨关节炎模型的构建方法与流程

本发明属于生物医药，具体涉及一种半月板损伤致创伤性膝骨关节炎模型的构建方法。

背景技术：

1、膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis，koa)又被称为膝关节退行性骨关节病，临床表现为关节软骨变性、破坏及骨质增生，关节变形及关节周围组织功能减退等，是临床常见危害老年人健康的骨关节疾病，给社会增加沉重的负担。但其发病机制仍不明确，临床上也没有特异性的治疗措施，只能缓解症状，所以建立骨性关节炎动物模型来探索其发病机制和防治手段成为科研热点。针对koa的发病特点，国内外采用的造模方案主要针对肥胖、老年性激素代谢障碍、遗传易感性、炎症因素、关节力学不稳等因素进行模拟人体发病的机制进行造模。不同的造模方案均有其各自的优缺点及适用范围。因此，在实验中选择正确的动物模型，应尽量选择与人类koa发病机制相符合的动物模型方案。

2、半月板损伤临床比较常见，其年发生率(60～70)/10万，人们发现半月板损伤的程度与关节软骨表面增加的应力呈正比，半月板损伤后可引起软骨表面单位应力增加，进而导致继发性骨关节炎。构建半月板损伤致创伤性膝骨关节炎模型能够更好地研究半月板损伤导致膝骨关节炎的致病机制、炎症发展进程、关节病理性改变，以及提出更好的治疗方案。

技术实现思路

1、为了快速地和精准地构建半月板损伤致创伤性膝骨关节炎模型，更好地研究半月板损伤导致膝骨关节炎的致病机制、炎症发展进程、关节病理性改变，以及提出更好的治疗方案，本发明提供了一种快速构建半月板损伤致创伤性膝骨关节炎模型方法。

2、第一方面，本发明提供了一种快速构建半月板损伤致创伤性膝骨关节炎模型方法。所述方法包括一下步骤：

3、优选地，选择实验动物为雌性日本长耳大白兔，体质量为1.0kg～3.0kg，更优选为(2.0±0.5)kg，即为1.5kg、1.6kg、1.7kg、1.8kg、1.9kg、2.0kg、2.1kg、2.2kg、2.3kg、2.4kg、2.5kg。

4、手术方法：将实验动物称质量后，按3.5ml/kg剂量腹腔注射10％水合氯醛溶液麻醉，待完全麻醉后，剪刀于右侧膝关节内侧附近备皮，取髌旁内侧切口。采用膝关节结构损伤方法建立膝骨关节炎模型。

5、优选地，膝关节结构损伤方法为单纯切除内侧半月板方法、单纯切除前交叉韧带方法、单纯切断内侧副韧带方法、切除内侧半月板伴切断内侧副韧带方法、切断内侧副韧带伴切断前交叉韧带方法、切除内侧半月板伴切断内侧副韧带和前交叉韧带方法等任意一种，按照更加符合半月板损伤致膝骨关节炎的发病机制，更优选地选择单纯切除内侧半月板方法。

6、上述手术步骤结束后，彻底止血，再次消毒逐层缝合切口，术后连续3天肌肉注射青霉素40×104u/kg。术后不固定手术肢体，术后1周开始进行驱赶运动。

7、优选地，驱赶运动频次为每周1次～7次，例如，每周1次、每周2次、每周3次、每周4次、每周5次、每周6次、每周7次，更优选地选择每周7次。

8、优选地，驱赶运动每天时间为5分钟～40分钟，例如，5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟，更优选地选择每天30分钟。

9、优选地，造模时间为1周～6周，例如，1周、2周、3周、4周、5周、6周，更优选地选择4周。

10、第二方面，本发明提供兔创伤性膝骨关节炎模型构建评价方法

11、在建立模型结束时，切下术侧兔膝关节，去除皮肤，放置中性福尔马林固定2天，制作成切片，通过显微镜观察，并进行病理评分。

12、优选地，病理评分人员选择为1名～5名，例如，1名，2名，3名，4名，5名，更优选地选择3名～5名。

13、优选地，兔膝关节mankin's病理评分标准选择为2分～13分，例如，2分，3分，4分，5分，6分，7分，8分，9分，10分，11分，12分，13分，更优选地选择7分～13分。mankin's评分等级如下：

14、mankin's评分从整体结构、细胞结构、番红染色、潮线完整性4个方面分不同等级进行评分，最高13分，最低0分。0～1分为正常软骨；2～6分为早期骨关节炎；7～10分为中期骨关节炎；11～13分为晚期骨关节炎。mankin's评分具体标准见表1。

15、表1 mankin's病理评分

16、

17、注：正常：0-1分；轻度：2-5分；中度：6-9分；重度：10-13分；

18、优选地，兔膝关节oochas病理评分标准选择为4分～24分，例如，4分，5分，6分，8分，10分，12分，14分，16分，18分，20分，22分，24分，更优选地选择12分～24分。oochas评分标准如下：

19、oochas评分＝关节软骨损伤深度及相应组织反应分级(0～6级)×关节软骨损伤范围分期(0～4期)；分级评分标准为：0级：关节面完整，软骨完整；1级：表面完整；2级：表面不连续；3级：垂直裂隙；4级：糜烂；5级：缺损；6级：变形；分期评分标准为：0期：无炎症表现；1期：损伤面积小于样本面积10％；2期：损伤面积占样本面积10％～25％；3期：损伤面积占样本面积25％～50％；4期：损伤面积大于样本面积50％。oochas分级标准见表2、oochas分期标准见表3、oochas总分计算方式见表4。

20、表2 oochas分级标准

21、

22、 

23、

24、表3 oochas分期标准

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26、分期＝软骨损伤的长度

27、表4 oochas总分计算方式

28、

29、总分＝分期×分级

30、优选地，兔血清il-6含量的测定值高于阴性样本平均值，且两两比较具有统计学差异(p＜0.05)，更优选为高于阴性样本平均值1.5倍以上。

31、优选地，兔血清tnf-ɑ含量的测定值高于阴性样本平均值，且两两比较具有统计学差异(p＜0.05)，更优选为高于阴性样本平均值1.5倍以上。

32、优选地，兔膝关节软骨组织mmp-3阳性表达值高于阴性样本平均值，且两两比较具有统计学差异(p＜0.05)，更优选为高于阴性样本平均值1.5倍以上。

33、优选地，兔膝关节软骨组织collagenⅱ阳性表达值低于阴性样本平均值，且两两比较具有统计学差异(p＜0.05)，更优选为低于阴性样本平均值1.5倍以上。

技术特征：

1.一种半月板损伤致创伤性膝骨关节炎模型的构建方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所选择实验动物为雌性日本长耳大白兔，体质量为为(2.0±0.5)kg。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：选择单纯切除内侧半月板方法。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：造模过程中所需驱赶运动频次为每周7次(即每日1次)。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：造模过程中所需驱赶运动每天时间为30分钟。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：造模过程所需时间为4周。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在建模过程中，病理评分人员选择为3名～5名。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在建模过程中，膝关节mankin's病理评分标准为7分～13分。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在建模过程中，膝关节oochas病理评分标准为12分～24分。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在建模过程中，血清il-6和tnf-ɑ含量的测定高于阴性样本平均值，且高于平均值1.5倍以上。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在建模过程中，膝关节软骨组织mmp-3阳性表达高于阴性样本平均值，且高于平均值1.5倍以上。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在建模过程中，膝关节软骨组织collagenⅱ阳性表达低于阴性样本平均值，且低于平均值1.5倍以上。

技术总结
本发明涉及一种半月板损伤致创伤性膝骨关节炎模型的构建方法，其包括以下步骤：造模动物完全麻醉后，剪刀于右侧膝关节内侧附近备皮和显露皮肤，彻底消毒后，采用髌骨内侧切口切开右侧膝关节皮肤及皮下组织，完整切除内侧半月板，然后逐层缝合，关闭切口。术后肌肉注射青霉素预防感染，术后不固定手术肢体。术后1周进行驱赶运动，每日1次，每次30分钟，连续进行3周，共计造模4周。采用本发明构建的动物模型能够快速地、稳定地建立半月板损伤致创伤性膝骨关节炎模型，与传统Hulth法相比，具有损伤小，更加精准建立半月板损伤导致创伤性膝骨关节炎的动物模型，为半月板损伤致创伤性膝骨关节炎的致病机制、炎症发展进程、关节病理性改变以及治疗方案研究提供了技术基础。

技术研发人员：王恒,孙正梅,陈燕萍,梁子聪,陆瑞娜,周枝
受保护的技术使用者：黔南民族医学高等专科学校
技术研发日：
技术公布日：2024/3/5