一种直接包裹聚肌胞的乳佐剂制备方法与流程

本发明涉及乳化剂制备，具体涉及一种直接包裹聚肌胞的乳佐剂制备方法。

背景技术：

1、疫苗佐剂或称免疫佐剂(immunologic adjuvant)，作为疫苗主要成分之一，可被机体识别为异物(铝盐，矿物油)或者病原体(核酸，脂多糖等)从而警示免疫系统，或者放大抗原的“入侵信号”，从而使免疫系统发生更为强烈的反应，进而提高抗原的免疫原性，改变免疫应答性质，从而减少免疫成功所需的抗原量及免疫剂次数。

2、19世纪90年代，第一个非铝佐剂的新型佐剂mf59被批准用于疫苗。mf59因其成分简单、效果显著、应用广泛深受疫苗研发者的喜爱，最早由诺华研发，首先用于流感疫苗，可用于动物和人用疫苗，目前已经应用与全球30个国家和地区。有众多的研发人员基于mf59最初配方进行优化，研发出类似的水包油乳化剂。目前，的研究大多基于微流射均质机来控制液滴大小，技术成本较高，更适用于大规模生产，其高昂的成本对于小批量制备和配方优化的实验阶段不友好。mf59最佳液滴大小在160nm，其使用时往往是将抗原冻干粉和佐剂混合，冻干抗原制备工艺繁琐，低温保存成本较大，如果能直接将抗原包裹在乳佐剂中，可极大的减少成本。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种直接包裹聚肌胞的乳佐剂制备方法，该制备方法能够实现将抗原聚肌胞直接包裹在乳佐剂中，以减少乳佐剂的制备成本。

2、本发明通过下述技术方案实现：

3、一种直接包裹聚肌胞的乳佐剂制备方法，包括以下步骤：

4、s1、将角鲨烯、吐温80和司盘85混匀，制成油相；将聚肌胞粉溶解在缓冲体系中，制成内水相；将吐温80溶解在缓冲体系中，制成外水相；

5、s2、将步骤s1制备的内水相加入油相中，形成反相胶束；

6、s3、将步骤s2制备的反相胶束加入到步骤s1制备的外水相中，形成复乳；

7、s4、将步骤s3制备的复乳进行高压均质处理，获得乳化液。

8、本发明是利用内水相和油相制备成反相胶束，再将反相胶束和含有聚肌胞的外水相混合形成复乳，利用高压均质机控制液滴大小，在本发明中，内水相包裹聚肌胞后，油相包裹内水相，再与外水相进行混合，最终形成w/o/w结构的乳化液，聚肌胞被包裹在最内层水相中，实现了抗原聚肌胞直接包裹在乳佐剂中，以减少乳佐剂的制备成本。

9、进一步地，制备乳佐剂时，角鲨烯、司盘85、吐温80和聚肌胞粉重量百分比为：(4.5-4.9)：(0.4-0.6)：(0.4-0.6)：(0.03-0.07)，其中，制备油相和制备外水相的吐温80的用量比为1:1。

10、进一步地，制备乳佐剂时，角鲨烯、司盘85、吐温80和聚肌胞粉重量百分比为：(4.5-4.9)：(0.4-0.6)：(0.4-0.6)：0.05。

11、进一步地，制备乳佐剂时，角鲨烯、司盘85、吐温80和聚肌胞粉重量百分比为：4.7：0.5：0.5：0.05。

12、进一步地，步骤s1中，所用缓冲体系包括柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pbs缓冲液、tris盐酸缓冲液、硼酸盐缓冲液或琥珀酸盐缓冲液。

13、进一步地，步骤s1中，所用缓冲体系为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或pbs缓冲液。

14、申请人对本发明所述方法中所使用的缓冲体系进行了优选，通过试验发：用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pbs缓冲液、tris盐酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液制备的乳佐剂粒径分别为159.32nm、189.62nm、220.57nm、260.48nm、248.37nm，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液制备的乳佐剂粒径最小，pbs缓冲液也可用于乳佐剂制备，不同缓冲液制备的乳佐剂液滴大小见图1。

15、进一步地，步骤s4中，高压均质处理的具体过程为：

16、复乳用高压均质机1500bar均质10个循环，形成均匀且无明显颗粒的乳化液。

17、进一步地，步骤s1中，制备油相时，加入有维生素e。

18、进一步地，维生素e的加入量为复乳总重量的4-5％。

19、本发明制备的作乳佐剂中含有角鲨烯，角鲨烯一种易被氧化的三萜类化合物，在制备中应防止其被氧化，通过在制备油相时，加入有维生素e，能够防止乳佐剂在制备过程角鲨烯发生氧化。

20、进一步地，还包括以下步骤：

21、s5、乳化液采用无菌滤膜进行过滤除菌。

22、本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

23、1、本发明利用直接包裹聚肌胞粉，提供了一种乳佐剂包封药物的思，本发明通过分别制备油相、内水相和外水相内水相包裹聚肌胞后，制备乳化液时，油相包裹内水相，再与外水相进行混合，最终形成w/o/w结构的乳化液，聚肌胞被包裹在最内层水相中，乳化液中聚肌胞的包封率大于96％，实现了抗原聚肌胞直接包裹在乳佐剂中，以减少乳佐剂的制备成本。

24、2、本发明是利用内水相和油相制备成反相胶束，再将反相胶束和含有聚肌胞的外水相混合形成复乳，利用高压均质机控制液滴大小，无需使用微流射均质机来控制液滴大小，降低了成本，适用于大规模生产。

25、3、本发明通过大量试验进行验证，确定了本发明的缓冲体系优选为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或pbs缓冲液，最优为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，使用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液时，乳佐剂粒径最小，为159nm作用，且具有稳定性好的优点。

26、4、本发明通过在制备油相时，加入一定量的维生素e，从而达到防止角鲨烯氧化的效果，即能够提高制备的乳佐剂的抗氧化性能。

技术特征：

1.一种直接包裹聚肌胞的乳佐剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种直接包裹聚肌胞的乳佐剂制备方法，其特征在于，制备乳佐剂时，角鲨烯、司盘85、吐温80和聚肌胞粉重量百分比为：(4.5-4.9)：(0.4-0.6)：(0.4-0.6)：(0.03-0.07)，其中，制备油相和制备外水相的吐温80的用量比为1:1。

3.根据权利要求2所述的一种直接包裹聚肌胞的乳佐剂制备方法，其特征在于，制备乳佐剂时，角鲨烯、司盘85、吐温80和聚肌胞粉重量百分比为：(4.5-4.9)：(0.4-0.6)：(0.4-0.6)：0.05。

4.根据权利要求2所述的一种直接包裹聚肌胞的乳佐剂制备方法，其特征在于，制备乳佐剂时，角鲨烯、司盘85、吐温80和聚肌胞粉重量百分比为：4.7：0.5：0.5：0.05。

5.根据权利要求1所述的一种直接包裹聚肌胞的乳佐剂制备方法，其特征在于，步骤s1中，所用缓冲体系包括柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pbs缓冲液、tris盐酸缓冲液、硼酸盐缓冲液或琥珀酸盐缓冲液。

6.根据权利要求5所述的一种直接包裹聚肌胞的乳佐剂制备方法，其特征在于，步骤s1中，所用缓冲体系为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或pbs缓冲液。

7.根据权利要求1所述的一种直接包裹聚肌胞的乳佐剂制备方法，其特征在于，步骤s4中，高压均质处理的具体过程为：

8.根据权利要求1所述的一种直接包裹聚肌胞的乳佐剂制备方法，其特征在于，步骤s1中，制备油相时，加入有维生素e。

9.根据权利要求8所述的一种直接包裹聚肌胞的乳佐剂制备方法，其特征在于，维生素e的加入量为复乳总重量的4-5％。

10.根据权利要求1-9任一项所述的一种直接包裹聚肌胞的乳佐剂制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：

技术总结
本发明公开了一种直接包裹聚肌胞的乳佐剂制备方法，包括以下步骤：S1、将角鲨烯、吐温80和司盘85混匀，制成油相；将聚肌胞粉溶解在缓冲体系中，制成内水相；将吐温80溶解在缓冲体系中，制成外水相；S2、将步骤S1制备的内水相加入油相中，形成反相胶束；S3、将步骤S2制备的反相胶束加入到步骤S1制备的外水相中，形成复乳；S4、将步骤S3制备的复乳进行高压均质处理，获得乳化液。在本发明中，内水相包裹聚肌胞后，油相包裹内水相，再与外水相进行混合，最终形成W/O/W结构的乳化液，聚肌胞被包裹在最内层水相中，实现了抗原聚肌胞直接包裹在乳佐剂中，以减少乳佐剂的制备成本。

技术研发人员：张尚博,周兰馨,蔡济泽,马晓琴,易航,周丽苹,王婷
受保护的技术使用者：成都济沧泛海生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15