生物型人工角膜及其制备方法和用途与流程

本发明属于医疗器械领域，更具体涉及生物型人工角膜及其制备方法和用途。

背景技术：

1、角膜移植是解决角膜盲这一全球第二大类致盲疾病的有效方法，目前全球角膜盲患者超过5000万，且每年有100多万的新增患者，这些患者均需要通过全层角膜或板层角膜移植来恢复视力。然而现阶段活体角膜的供应量远少于患者需求，因此研究者们开始关注生物型人工角膜，例如，依次经过病毒灭活、化学试剂脱细胞、辐照灭菌等工艺制备而成的猪角膜细胞外基质类产品的应用，为众多患者带来了光明的希望。

2、然而，猪角膜细胞外基质等异种脱细胞角膜材料移植到人体后常会遇到宿主免疫排斥反应，主要表现为分泌物较多、角膜透明性不好，上皮化速度慢，严重时甚至出现植片脱落、溶解等现象。上述现象主要是由于脱细胞角膜基质来源于动物源性组织，虽然通过常规化学试剂进行了脱细胞处理，但并没有彻底去除细胞中胶原内部的细胞碎片残留以及小分子异种抗原物质等，导致将角膜细胞外基质等异种脱细胞角膜材料植入人体后，人体产生的免疫排斥反应较强。

3、针对上述问题，亟需研发一种生物相容性更好的生物型人工角膜，以减缓宿主免疫排斥反应。

技术实现思路

1、针对现有技术的上述缺陷和问题，本发明开发了一种生物型人工角膜及其制备方法和用途。

2、本发明第一方面提供了一种生物型人工角膜的制备方法，所述方法包括：

3、对动物角膜进行病毒灭活操作和溶胀操作，得到初始角膜；

4、超临界流体处理所述初始角膜，处理条件为：温度为20℃～60℃，压强为5mpa～18mpa，处理时间为3h～28h；重复1～7次该步骤，得到初品，所述初品经过清洗、脱水及灭菌后即得到所述生物型人工角膜。

5、上述过程中，通过超临界流体重复处理初始角膜，实现初始角膜的脱细胞化，在该过程中未加入其余化学试剂，与初始角膜接触的超临界流体能够快速挥发，从而不易粘附在处理后的角膜上，故上述处理过程既有助于在保留动物角膜天然胶原结构的基础上将动物角膜中的细胞成分及小分子免疫原性物质等彻底去除，又不存在试剂残留的情况，有效避免了因残留试剂破坏角膜组织中天然的胶原结构而导致脱细胞角膜材料被植入后出现上皮化速度较慢、透明性不好等情况，也降低了残留试剂对宿主健康造成危害的可能性。且经过后续实验验证，当将制备得到的生物型人工角膜植入宿主后，宿主不易产生免疫排斥反应。

6、采用超临界流体对初始角膜进行合理次数的重复处理，可在较便捷的制备流程中进一步提升脱细胞效果，让移植了生物型人工角膜的宿主中不易产生免疫排斥反应，进而让生物型人工角膜能够长久发挥作用。尤其是当重复次数为3次时，超临界流体对初始角膜的处理效果最好。需要注意的是，该步骤中不包括辅溶剂，所述辅溶剂包括c1-4醇，可有效避免因蛋白质沉淀而导致制得的角膜混浊。

7、可选地，所述超临界流体处理所述初始角膜的方式包括采用超临界流体浸泡或者持续流经所述初始角膜。

8、采用超临界流体浸泡或者持续流经初始角膜，有助于让超临界流体与初始角膜充分接触，进而实现超临界流体对动物角膜进行高效脱细胞化的目的，达到彻底去除胶原内部的细胞碎片残留以及小分子异种抗原物质的效果，让最终的生物性人工角膜在宿主中不易产生免疫排斥反应。

9、可选地，所述超临界流体处理所述初始角膜的处理条件为：温度为32℃～40℃，压强为7.5mpa～14mpa，处理时间为5h～24h。

10、通过调节超临界流体的压力、温度和处理时间，有助于在彻底去除角膜组织中异种细胞和小分子抗原物质的同时，保护角膜材料本身的胶原结构不受破坏，让所制备的生物型人工角膜透明度高，免疫原性极低，植入宿主后能够保持高度透明，能够实现快速上皮化。

11、可选地，所述超临界流体选自超临界二氧化碳、超临界一氧化二氮、超临界烷类、超临界烯类、超临界醇类及超临界丙酮中的至少一种。

12、可选地，所述病毒灭活操作包括：采用质量分数为0.1％～3.0％的次氯酸钠溶液对所述动物角膜进行浸泡处理，处理时间为10min～60min；优选地，病毒灭活处理后，用水清洗病毒灭活后的动物角膜。

13、可选地，所述溶胀操作包括：将所述动物角膜置于水中进行震荡溶胀，其中，震荡速率为120rpm～250rpm，震荡时间为30min～100min。

14、在振荡处理过程中，角膜基质的胶原蛋白吸水蓬松，角膜逐渐吸水变厚，角膜基质细胞和内皮细胞逐渐破裂，角膜上皮层逐渐脱落。在振荡处理结束时，角膜呈飞碟状，角膜上皮层全部脱落。

15、可选地，对所述动物角膜进行病毒灭活操作和溶胀操作之前，还包括：

16、裁剪动物眼球的巩膜边缘，获得动物角膜，所述巩膜的裁剪宽度为2～4mm。

17、合适尺寸的角膜有助于与后续的超临界流体充分接触，进而有助于进行高效的脱细胞化处理。

18、可选地，所述初品清洗和脱水步骤具体为：在震荡速率为120rpm～250rpm的条件下，采用ph为6.8～7.2的ph缓冲液清洗所述初品5min～30min，之后，采用质量分数为40％～80％的甘油在震荡速率为120rpm～250rpm的条件下处理所述初品10min～120min，以对所述初品进行脱水。

19、本发明另一方面还提供了一种生物型人工角膜，其通过上述生物型人工角膜的制备方法制得。

20、本发明另一方面还提供了上述生物型人工角膜在制备治疗眼部疾病的产品的应用；与之相对应地，本发明还提供了上述生物型人工角膜用于治疗眼部疾病的用途。优选地，所述眼部疾病为角膜盲疾病。

21、综上所述，本申请具有以下有益效果：

22、通过超临界流体在合适的处理条件下重复处理初始角膜，可实现初始角膜的高效脱细胞化，在该过程中未加入其余化学试剂，既有助于在保留动物角膜天然胶原结构的基础上将动物角膜中的细胞成分及小分子免疫原性物质等彻底去除，又不会存在试剂残留的情况，进而达到当将制备得到的生物型人工角膜植入宿主后，不易产生免疫排斥反应，且不易出现上皮化速度较慢、透明性不好等现象。

技术特征：

1.一种生物型人工角膜的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

2.权利要求1所述的生物型人工角膜的制备方法，其特征在于，所述超临界流体处理所述初始角膜的方式包括采用超临界流体浸泡或者持续流经所述初始角膜。

3.权利要求1所述的生物型人工角膜的制备方法，其特征在于，所述超临界流体处理所述初始角膜的处理条件为：温度为32℃～40℃，压强为7.5mpa～14mpa，处理时间为5h～24h。

4.权利要求1所述的生物型人工角膜的制备方法，其特征在于，所述超临界流体选自超临界二氧化碳、超临界一氧化二氮、超临界烷类、超临界烯类、超临界醇类及超临界丙酮中的至少一种。

5.权利要求1所述的生物型人工角膜的制备方法，其特征在于，所述病毒灭活操作包括：

6.权利要求1所述的生物型人工角膜的制备方法，其特征在于，所述溶胀操作包括：

7.权利要求1所述的生物型人工角膜的制备方法，其特征在于，所述对动物角膜进行病毒灭活操作和溶胀操作之前还包括：

8.权利要求1所述的生物型人工角膜的制备方法，其特征在于，所述清洗和脱水步骤具体为：在震荡速率为120rpm～250rpm的条件下，采用ph为6.8～7.2的ph缓冲液清洗所述初品5min～30min，之后，采用质量分数为40％～80％的甘油在震荡速率为120rpm～250rpm的条件下处理所述初品10min～120min，以对所述初品进行脱水。

9.一种生物型人工角膜，其特征在于，其通过权利要求1-8任一所述的生物型人工角膜的制备方法制得。

10.权利要求9所述的生物型人工角膜在制备治疗眼部疾病的产品的应用；优选地，所述眼部疾病为角膜盲疾病。

技术总结
本发明涉及生物型人工角膜及其制备方法和用途，属于医疗器械领域。所述方法包括对动物角膜进行病毒灭活操作和溶胀操作，得到初始角膜；超临界流体处理所述初始角膜，处理条件如下：温度为20℃～60℃，压强为5MPa～18MPa，处理时间为3h～28h；重复1～7次该步骤，得到初品，所述初品经过清洗、脱水及灭菌后即得到所述生物型人工角膜。采用本发明的制备方法制得的生物型人工角膜，异种细胞的残留量较低，且不存在细胞成分及小分子免疫原性物质等物质残留，当被植入宿主后，不易产生免疫排斥反应。

技术研发人员：樊杏利,罗威,石莉,张勇杰
受保护的技术使用者：广东博与再生医学有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29