一种布鲁氏菌Bp26基因重组腺病毒载体疫苗及其制备和应用的制作方法

本发明涉及一种布鲁氏菌bp26基因重组腺病毒载体疫苗及其制备和应用，属于疾病防控与病菌检测。

背景技术：

1、布鲁氏菌病(brucellosis，简称布病)是由布鲁氏菌属引起的在全世界范围流行的人畜共患病，是国际动物卫生组织规定必须通报的动物疫病。在实施免疫的同时，还需要剔除免疫失败而被布鲁氏菌野毒株感染的动物。因此，对免疫动物和自然感染动物的鉴别需求越来越迫切。

2、目前，布病免疫动物和自然感染动物的鉴别还存在一些瓶颈，主要表现在以下几个方面：1.没有成熟有效的血清学鉴别方法，尽管有个别的鉴别诊断试剂在使用(如天然半抗原nh)，但该技术的使用要受到免疫窗口期和动物个体差异的限制，不能做到完全的鉴别区分；2.我国当前流行的布鲁氏菌野毒株的种型比较复杂，至少有4种布鲁氏菌(羊种、牛种、猪种和犬种)在流行，用病原分离鉴定来区分疫苗与所有的野毒株存在较大的困难，而且还需要生物安全三级实验室，耗时耗力，极大地限制了该方法的应用；3.荧光定量pcr技术可在分子水平上对疫苗株和野毒株进行区分，但该方法技术要求高，特异性不足，限制了该技术的推广。

3、另外，传统疫苗主要依赖灭活或削弱的病原体为基础制备，是控制传染性疾病的主要手段。但这些疫苗还存在一些问题，包括无法提供完全保护或具有潜在的感染与病毒返祖等缺陷。同时，由于现有的减毒活疫苗仍存在较强的毒力，因抗原与毒株的差异不大而很难区分疫苗免疫和自然感染等缺点，限制了现有布鲁氏菌减毒活疫苗的广泛应用。因此提出本发明，以期通过对疫苗株中布鲁氏菌bp26基因进行遗传改造克服上述缺点。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明通过对bp26基因进行序列优化，优化后基因表达水平显著提高，经动物(牛、羊)效力验证，采用该优化后序列制备的布鲁氏菌病疫苗的防护效果明显增强。同时基于该优化序列提供了一对引物，该引物对在布鲁氏菌野毒株和疫苗株的鉴别中表现优异，对野毒株与疫苗株的鉴别率高达95％左右。

2、本发明的第一个目的是提供一种布鲁氏菌病疫苗，所述布鲁氏菌病疫苗以携带seq id no.4所示序列的质粒载体为免疫原。

3、进一步地，所述质粒载体为病毒载体。

4、进一步地，所述病毒载体包括但不限于慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等。优选地，所述布鲁氏菌病疫苗中含有重组腺病毒，所述重组腺病毒以复制缺陷型腺病毒为载体表达核苷酸序列如seq id no.4所示的bp26基因。

5、进一步地，所述bp26基因通过seq id no.1-2所示的引物扩增得到。具体地，seqid no.1-2的序列如下：

6、bp26-s：5’-gctagcctgtgagagatcctgtgaaccctcg-3’，

7、bp26-a：5’-ctcgaggtgatcctttgtgctgaccaga-3’。

8、本发明的第二个目的是提供一种重组腺病毒，所述重组腺病毒以复制缺陷型腺病毒为载体表达bp26基因，所述bp26基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。

9、进一步地，以复制缺陷型ad5腺病毒为载体。

10、进一步地，bp26基因通过seq id no.1-2所示的引物扩增得到。

11、本发明的第三个目的是提供所述重组腺病毒的制备方法，包括以下步骤：

12、s1、以seq id no.1-2所示的引物对扩增bp26序列，回收pcr产物；

13、s2、将所述pcr产物和腺病毒穿梭质粒进行连接，得到重组穿梭质粒；

14、s3、将重组穿梭质粒转化至含有腺病毒骨架质粒的感受态细胞中，同源重组后获得所述重组腺病毒。

15、进一步地，感受态细胞包括但不限于大肠杆菌感受态细胞。

16、进一步地，所述腺病毒穿梭质粒包括但不限于pshuttle-cmv质粒等。

17、本发明的第四个目的是提供上述布鲁氏菌病疫苗的其中一种制备方法，包括以下步骤：将上述重组腺病毒转染到疫苗的宿主细胞中，得到所述布鲁氏菌病疫苗。

18、本发明的第五个目的是提供seq id no.1-2所示的引物或seq id no.4所示的基因在制备布鲁氏菌病疫苗中的应用。

19、采用本发明制备的疫苗免疫羊、牛后均可实现疫苗株与野毒株的区分：疫苗中仅含有bp26蛋白，即通过除该蛋白外的其它任何保守布鲁氏菌蛋白(免疫反应蛋白)均可进行野毒株与疫苗株的鉴别诊断。若检测结果为阴性，则为疫苗株感染，若检测结果为阳性，则为野毒株感染。

20、进一步地，疫苗可为病毒载体疫苗或非病毒载体疫苗，其中，病毒载体包括但不限于慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等。

21、本发明的有益效果：

22、(1)本发明以腺病毒为骨架载体，重组表达了优化后的bp26基因，制备得到腺病毒活载体疫苗。经体内验证，该疫苗在动物免疫中体现出良好的免疫原性，与传统布鲁氏菌活疫苗a19、m5进行效力试验，发现有更高的保护力，且且不存在生物安全风险，有效的保障了畜群安全、餐桌安全、人员安全，有望开发为用于预防布鲁氏菌病感染的疫苗。

23、(2)本发明还针对上述疫苗进行免疫的下游防控提供了方法，即如何鉴别该疫苗免疫的布鲁氏菌疫苗株和野毒株，该方法敏感性强、特异性高，可以快速、准确地实现定性、定量检测，为布病的防控提供了基础。

技术特征：

1.一种布鲁氏菌病疫苗，其特征在于：所述布鲁氏菌病疫苗包含携带seq id no.4所示序列的质粒载体。

2.根据权利要求1所述的布鲁氏菌病疫苗，其特征在于：所述质粒载体为病毒载体。

3.根据权利要求2所述的布鲁氏菌病疫苗，其特征在于：所述病毒载体为慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。

4.根据权利要求1所述的布鲁氏菌病疫苗，其特征在于：所述seq id no.4序列通过seqid no.1-2所示的引物扩增得到。

5.权利要求1-4任一项所述的布鲁氏菌病疫苗的制备方法，包括以下步骤：

6.一种重组腺病毒，其特征在于：所述重组腺病毒以复制缺陷型腺病毒为载体表达bp26基因，所述bp26基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。

7.根据权利要求6所述的重组腺病毒，其特征在于：以复制缺陷型ad5腺病毒为载体。

8.权利要求6或7所述的重组腺病毒的制备方法，包括以下步骤：

9.seq id no.1-2所示的引物或seq id no.4所示的基因在制备布鲁氏菌病疫苗中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：疫苗为病毒载体疫苗或非病毒载体疫苗。

技术总结
本发明公开了一种布鲁氏菌Bp26基因重组腺病毒载体疫苗及其制备和应用。具体地，本发明通过对Bp26基因进行改造，提供了一种可同时实现布鲁氏菌检测和预防的引物对，并基于该引物对开发了一种安全性高、保护力强的病毒载体疫苗，解决了目前布鲁氏菌病整体免疫应答及免疫保护效果低下的问题，同时提供了一种高特异性、高灵敏度的检测方法，可实现该疫苗免疫后的布鲁氏菌野毒株及疫苗株的快速鉴别，弥补了现有缺乏有效诊断方法的缺陷，为动物布病的防控提供了一种新的策略。

技术研发人员：贺笋,赵海龙,何传雨,吴冬玲,刘梦志,韩瑞,穆榕博,黄伟伟,常品,师伟伟
受保护的技术使用者：天康制药股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/21