一种仿生红细胞及其制备方法和应用与流程

本发明属于在生物医用材料及组织工程领域，具体涉及一种仿生红细胞及其制备方法和应用。

背景技术：

1、组织损伤因其发病率高、治疗难度大而被认为是最棘手的健康问题之一，因此科学界一直致力于实现缺损组织的修复，重塑其组织并恢复其生物功能。该领域中，结合组织工程的生物材料支架具有良好的生物相容性和理想的细胞粘附性能，为修复损伤组织开辟了新的途径。虽然上述工作已取得了一定进展，但现有组织支架的形状与受损组织的不规则形状不一致，且不能充足供应细胞增殖所需的氧气，导致治疗效果仍不理想。

2、相比之下，来自微流体技术的生物医学微粒已经成为修复损伤组织的有前景的候选者，微流体技术可以设计出丰富的组件和功能，其生成微粒具有微小尺寸以适应损伤区域。然而，微流体中的微粒多为球形，在外力作用下容易发生位移，不利于伤口愈合。此外，这些微粒的释药方式普遍单一，释药过程控制较差，这也不利于组织再生。因此，新的可用于组织再生的微粒仍是值得期待的。

3、作为血液中数量最多的细胞，红细胞扮演着运送氧气和其他分子以维持生命的载体细胞的角色。在组织的自我修复过程中，这些红细胞发挥着关键作用，主要是提供足够的氧气以促进细胞增殖和组织重塑。红细胞具有特殊的双凹面盘状形态和机械柔韧性，具有较大的比表面积和堆积稳定性等优点。

技术实现思路

1、本发明目的是提供一种仿生红细胞及其制备方法和应用，制得共负载生长因子和氧气的仿生红细胞，结合红细胞在形貌结构和功能上的突出优势为组织再生提供新的技术手段。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种仿生红细胞的制备方法，包括以下步骤：

4、s1、将重组人二型胶原蛋白与甲基丙烯酸酐反应合成甲基丙烯酸酯-重组人二型胶原蛋白；

5、s2、将步骤s1制备的甲基丙烯酸酯-重组人二型胶原蛋白与卡拉胶、黑磷和光引发剂制成混合溶液，作为微流控电喷雾装置的流动相；在设置的电场条件下，流动相在微流控电喷雾装置的毛细管喷雾口流出、分裂为微液滴；

6、s3、使用收集相在毛细管喷雾口下方收集微液滴，经固化为固化微粒以及清洗，得到红细胞状水凝胶微球；

7、s4、将步骤s3制备的红细胞状水凝胶微球在溶解有碳二亚胺类试剂的37℃2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中浸泡活化羧基，然后与血红蛋白溶液孵育，形成血红蛋白修饰的仿生红细胞；

8、s5、将步骤s4制备的血红蛋白修饰的仿生红细胞置于富氧的生长因子溶液中浸泡，得到共负载生长因子和氧气的仿生红细胞。

9、为优化上述技术方案，采取的具体措施/限定还包括：

10、步骤s1中，甲基丙烯酸酯-重组人二型胶原蛋白的合成方法为：将甲基丙烯酸酐加入重组人二型胶原蛋白水溶液中，常温下反应，并在反应期间定期调整反应溶液的ph值，使其保持在8.0至9.0之间；反应后稀释并转移到透析袋中透析纯化，冷冻干燥，获得海绵状沉淀。

11、重组人二型胶原蛋白水溶液中，重组人二型胶原蛋白的浓度为5-15％w/v，甲基丙烯酸酐与重组人二型胶原蛋白溶液的体积比为1:8-12。

12、步骤s2中，所述流动相中，甲基丙烯酸酯-重组人二型胶原蛋白的浓度为10-20％w/v，卡拉胶的浓度为0.05-0.75％w/v，黑磷的浓度为0.1-0.5mg/ml；电场强度为2-6kv，流动相液体流速为20-60μl/min。

13、步骤s3中，使用氯化钾溶液作为收集相，收集距离为2-8cm，使用紫外灯照射固化；得到的红细胞状水凝胶微球的粒径为200～1000μm。

14、步骤s4中，所述的碳二亚胺类试剂采用质量比1:1混合的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺；2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中2-(n-吗啡啉)乙磺酸、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的浓度范围均为5-20mg/ml；浸泡活化的时间为25-40min；血红蛋白溶液的浓度为1-10mg/ml。。

15、步骤s5中，所述生长因子选自血管内皮生长因子、b-成纤维生长因子中的至少一种。

16、本发明还保护上述方法制备的仿生红细胞。

17、本发明还保护上述的仿生红细胞在制备药物载体或组织工程支架中的应用，上述应用是用于组织损伤的修复，促进组织再生，作为优选地，如腹壁缺损的修复。

18、本发明还保护一种负载药物的仿生红细胞，将采用上述方法制备的仿生红细胞负载药物。

19、进一步地，在药物中浸泡以实现负载，如液体药物，或其他制剂类型的药物；

20、作为优选地，所述的药物为大分子蛋白类药物。

21、使用时通过近红外照射促进药物的释放。

22、本发明提供了一种具有生物活性的仿生红细胞及其制备方法和应用，所制备的仿生红细胞具有与红细胞相似的红细胞的外部形貌和药物运输能力，具有结合和释放氧气的能力，具有能够长期维持药物活性和可控并缓释药物的特性，可以作为细胞黏附和增殖的支架，可以作为优良的氧气和生物活性药物缓释载体和组织工程微支架。与现有技术相比，本发明的有益效果是：

23、(1)本发明所制备的仿生红细胞具有良好的单分散性，具有红细胞形态的盘状微粒外部形貌，有利于细胞的黏附和增殖，具有稳定的堆叠稳定性，并可以增大与组织的接触面积，促进释药而不影响伤口的透气性；

24、(2)本发明采用微流控电喷雾制备红细胞状水凝胶微粒，产物高效、均一，且微球的大小和形态可控；制备过程不需使用有毒有机试剂，使得其应用时更安全；

25、(3)本发明使用的仿生红细胞可以同时负载氧气和多种生长因子，供应细胞生长代谢、以减少炎症、促进血管再生，还可以调节环境氧分压并长期保持生长因子的生物活性，并可实现其可控和持续性温和释放，且具有良好的生物相容性。

技术特征：

1.一种仿生红细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的仿生红细胞的制备方法，其特征在于：步骤s1中，甲基丙烯酸酯-重组人二型胶原蛋白的合成方法为：将甲基丙烯酸酐加入重组人二型胶原蛋白水溶液中，常温下反应，并在反应期间定期调整反应溶液的ph值，使其保持在8.0至9.0之间；反应后稀释并转移到透析袋中透析纯化，冷冻干燥，获得海绵状沉淀；重组人二型胶原蛋白水溶液中，重组人二型胶原蛋白的质量百分浓度为5-15％，甲基丙烯酸酐与重组人二型胶原蛋白溶液的体积比为1:8-12。

3.根据权利要求1所述的仿生红细胞的制备方法，其特征在于：步骤s2中，所述流动相中，甲基丙烯酸酯-重组人二型胶原蛋白的浓度为10-20％w/v，卡拉胶的浓度为0.05-0.75％w/v，黑磷的浓度为0.1-0.5mg/ml；电场强度为2-6kv，流动相液体流速为20-60μl/min。

4.根据权利要求1所述的仿生红细胞的制备方法，其特征在于：步骤s3中，使用氯化钾溶液作为收集相，收集距离为2-8cm，使用紫外灯照射固化；得到的红细胞状水凝胶微球的粒径为200～1000μm。

5.根据权利要求1所述仿生红细胞的制备方法，其特征在于：步骤s4中，所述的碳二亚胺类试剂采用质量比1:1混合的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺；

6.根据权利要求1所述的仿生红细胞的制备方法，其特征在于：步骤s5中，所述生长因子选自血管内皮生长因子、b-成纤维生长因子中的至少一种。

7.采用权利要求1-6任一项所述方法制备的仿生红细胞。

8.权利要求7所述的仿生红细胞在制备药物载体或组织工程支架中的应用，其特征在于：用于组织损伤的修复。

9.一种负载药物的仿生红细胞，其特征在于：将采用权利要求1-6任一项所述方法制备的仿生红细胞负载药物。

10.根据权利要求9所述的负载药物的仿生红细胞，其特征在于：在药物中浸泡以实现负载；

技术总结
本发明公开了一种仿生红细胞及其制备方法和应用，采用甲基丙烯酸酯‑重组人二型胶原蛋白与卡拉胶、黑磷和光引发剂通过微流控电喷雾装置制备红细胞状水凝胶微球，经处理后与血红蛋白溶液孵育过夜，形成血红蛋白修饰的仿生红细胞，然后置于富氧的生长因子溶液中浸泡，得到共负载生长因子和氧气的仿生红细胞。本发明制备的仿生红细胞能够用于制备药物载体或组织工程支架，用于组织损伤的修复，促进组织再生。

技术研发人员：赵远锦,罗志强,王经琳,甘璟璟
受保护的技术使用者：南京鼓楼医院
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1