一种促进内皮细胞成管的多孔凝胶材料及其制备方法和应用

本发明属于凝胶材料的，具体涉及一种促进内皮细胞成管的多孔凝胶材料及其制备方法和应用。

背景技术：

1、近年来，心肌组织工程的相关研究发展迅速，在保证工程化心肌组织在体内移植后存活并发挥功能，及时充分的血液供应起着重要作用。目前，在组织工程化心肌血管化研究方面常使用的方法有:细胞支架材料复合体中添加促血管生长因子、心肌细胞支架材料复合体中添加内皮细胞、将复合体移植到体内血运丰富的部位来促进其血管化等，其中，支架材料中添加促进血管生长的因子可以直接促进生物体内血管的形成，这种方法直接有效，但材料中生长因子的释放需要根据血管形成各个阶段所需生长因子的种类和含量的不同进行调整，简单来说就是需要解决多种生长因子在不同时期定量释放问题。心肌细胞支架材料复合体中添加内皮细胞、将复合体移植到体内血运丰富的部位来促进其血管化就是组织工程支架的体外和体内“预血管化”。将细胞复合到支架材料上对于材料的要求较高，其必须有一定的机械强度，生物可降解性，无毒，孔隙度大等特点。体外“预血管化”是在体外培养细胞材料复合体，内皮细胞可以在材料上形成血管样网状结构，其稳定性较好。但它只有单一培养系统，所需要的生长因子、营养物质都需要外界提供，缺少或不足均影响组织血管化的过程。体内“预血管化”的实验过程主要是建立在体外实验的基础之上的，内皮细胞种植在适宜的支架材料上，然后再植入裸鼠皮下，一些实验证明体内“预血管化”的细胞材料复合体内可以形成毛细血管样管道，这相比于网状血管结构是更加成熟的血管形态。但移植于体内的炎症反应是不可避免的，这直接影响细胞-支架复合物的功能发挥；细胞材料复合物在体内的存活问题，刚移植于体内的复合物会因缺血缺氧处于停滞与休克状态，甚至死亡。这就会导致复合体在形成血管结构并种植到受损部位前已经缺氧死亡。体内“预血管化”相比体外预血管化涉及的实验更加复杂，成本也更高。

2、血管内皮细胞是形成血管网络的主要功能细胞，因此，通过在心肌细胞和支架复合体中复合血管内皮细胞的方式促进再造心肌的血管化是目前研究的热点。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的在于提供一种促进内皮细胞成管的多孔凝胶材料及其制备方法和应用。

2、本发明的技术内容如下：

3、本发明提供了一种促进内皮细胞成管的多孔凝胶材料的制备方法，包括如下步骤：

4、1)将多酚物质与铕离子溶液反应形成配位物沉淀，其反应如下：

5、

6、所述多酚物质与铕离子溶液的使用浓度比为3～3.5:10；

7、所述多酚物质包括单宁酸；

8、所述铕离子溶液包括硝酸铕溶液；

9、该反应为经典螯合反应，反应中eu3+取代单宁酸最外围苯环上三个相邻羟基中的其中两个的羟基，同时铕离子由三价变为四价，两个苯环上的羟基被取代后形成带有铕离子的鳌环结构同时单宁酸的内部结构反应形成-coo-结构。铕离子的取代位置是随机、不定向的，螯环可以在单体分子内形成，分子间形成，金属离子取代后形成的螯环具有强大的稳定性，螯合反应最终形成沉淀物。

10、步骤1)中，所述多酚物质反应前滴加氨溶液(28％wt)，用于调节反应环境的ph值，约为8.5，之后铕离子溶液与加过氨溶液的多酚物质反应；

11、2)将步骤1)形成的配位物沉淀与双键明胶、多巴胺交联剂、致孔剂、促凝剂进行混合，充分反应形成多孔隙凝胶，后置于低温环境下形成稳定的多孔凝胶材料；

12、所述双键明胶、多巴胺交联剂、致孔剂、促凝剂的使用同于本申请人的在先申请cn202310879864.4的专利；

13、所述双键明胶的使用质量浓度为10～20％(w/v)，其用量为20～30％，其制备为：将溶解的明胶与甲基丙烯酸酐混合进行搅拌反应，温度为50℃～55℃，反应结束后在去离子水中进行透析和冻干，得到双键明胶，该反应中，明胶的氨基被甲基丙烯酸修饰改性得到双键基团，形成有助于提高活性和热稳定性的结构；

14、所述明胶与甲基丙烯酸酐的使用固液比为(1～5):1g/ml；；

15、所述溶解的明胶为将明胶溶解于pbs中，温度为50～55℃；

16、所述反应结束为通过加入pbs终止反应；

17、所述透析为采用12-14kda的透析袋。

18、所述多巴胺交联剂的使用质量浓度为5～10％(w/v)，其用量为20～30％，其制备为：多巴胺与n,n’－亚甲基双丙烯酰胺混合溶解于纯水中，进行油浴搅拌，全程避光，得到多巴胺-n,n’－亚甲基双丙烯酰胺交联剂。

19、所述致孔剂优选聚乙二醇二丙烯酸酯，其用量为15～20％，所述聚乙二醇而丙烯酸酯在引发剂或紫外光下可形成凝胶，其具有亲水性且富有弹性，在水凝胶体系中加入聚乙二醇而丙烯酸酯可以调节水凝胶的含水量以及弹性模量。

20、所述促凝剂优选过硫酸铵、四甲基乙二胺，其中过硫酸铵的使用浓度为10～20％，其用量为的用量为1～5％；四甲基乙二胺的用量为0～1％，所述过硫酸铵和四甲基乙二的加入使得生成自由基，把双键明胶的双键打开，促进分子之间的交联。

21、所述低温环境为-20℃～-40℃，交联反应时间≥17h。

22、本发明还提供了一种通过上述制备方法制得的促进内皮细胞成管的多孔凝胶材料，所述多孔凝胶材料具有互联联通的多孔结构，有利于细胞物质代谢交换和在三维环境下信号的传导。

23、本发明还提供了一种上述多孔凝胶材料的应用，用于制备心肌组织工程支架，具体为将多孔凝胶材料与心肌细胞复合构建成血管化的心肌组织工程支架，用于内皮细胞的血管形成。

24、本发明的有益效果：

25、本发明的多孔凝胶材料的制备方法，以双键明胶为水凝胶基底，加入铕(eu3+)和具有抗氧化能力的单宁酸(ta)成功制备了一种促进血管生成的生物凝胶材料，具有多孔结构，可复合心肌细胞构建了血管化的心肌组织工程支架。

技术特征：

1.一种促进内皮细胞成管的多孔凝胶材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的促进内皮细胞成管的多孔凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述多酚物质与铕离子溶液的使用浓度比为3～3.5:10。

3.根据权利要求1所述的促进内皮细胞成管的多孔凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述多酚物质包括单宁酸。

4.根据权利要求1所述的促进内皮细胞成管的多孔凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述铕离子溶液包括硝酸铕溶液，其反应前与氨溶液混合。

5.根据权利要求1所述的促进内皮细胞成管的多孔凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述双键明胶的制备为：将溶解的明胶与甲基丙烯酸酐混合进行搅拌反应，温度为50℃～55℃，反应结束后在去离子水中进行透析和冻干，得到双键明胶，

6.根据权利要求1所述的促进内皮细胞成管的多孔凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述多巴胺交联剂的制备为：多巴胺与n,n’－亚甲基双丙烯酰胺混合溶解于纯水中，进行油浴搅拌，全程避光，得到多巴胺-n,n’－亚甲基双丙烯酰胺交联剂。

7.根据权利要求1所述的促进内皮细胞成管的多孔凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述低温环境为-20℃～-40℃，交联反应时间≥17h。

8.一种权利要求1-7任一项所述制备方法制得的促进内皮细胞成管的多孔凝胶材料，其特征在于，所述多孔凝胶材料具有互联联通的多孔结构。

9.一种权利要求8所述多孔凝胶材料的应用，其特征在于，用于制备心肌组织工程支架，具体为将多孔凝胶材料与心肌细胞复合构建成血管化的心肌组织工程支架，用于内皮细胞的血管形成。

技术总结
本发明属于凝胶材料的技术领域，具体涉及一种促进内皮细胞成管的多孔凝胶材料及其制备方法和应用。将多酚物质与铕离子溶液反应形成配位物沉淀；将形成的配位物沉淀与双键明胶、多巴胺交联剂、致孔剂、促凝剂进行混合，充分反应形成多孔隙凝胶，后置于低温环境下形成稳定的多孔凝胶材料；以双键明胶为水凝胶基底，加入铕(Eu<supgt;3+</supgt;)和具有抗氧化能力的单宁酸(TA)成功制备了一种促进血管生成的生物凝胶材料，具有多孔结构，可复合心肌细胞构建了血管化的心肌组织工程支架。

技术研发人员：华文熙,王春芷,丁雅铭,刘文文,曾桂容,郑小燕
受保护的技术使用者：福建医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17