蜜炙桑叶炮制工艺优化方法

本发明涉及中医炮制，具体是涉及一种蜜炙桑叶炮制工艺优化方法。

背景技术：

1、桑叶为桑科植物桑morus alba l.的干燥叶，具有疏散风热，清肺润燥，清肝明目的功效。其含有黄酮、多酚、生物碱、多糖、甾醇等多种有效成分，具有抗氧化、降血糖、降胆固醇、抗衰老、预防癌症、抗炎、保护肝脏、调节肠道菌群等作用，广泛应用于食品、药物等领域。桑叶炮制应用历史悠久，历代炮制方法多种多样，如桑叶烧灰外用、醋煮桑叶、酒拌蒸桑叶、九蒸九晒桑叶、芝麻拌蒸桑叶等，而现代主要为蜜炙桑叶(以下简称蜜桑叶)。

2、蜜桑叶应用始载于宋元时期《太平圣惠方》，其性偏润，较于生品增强了润肺作用，多用于肺燥咳嗽。《中华人民共和国药典》(1963版)、《湖北省中药饮片炮制规范》(2018版)、《山东省中药饮片炮制规范》(2012版)收载了蜜桑叶，但都缺少蜜桑叶具体炮制工艺参数，但都缺少蜜桑叶具体炮制工艺参数，多以“文火炒至表面深黄色，微有光泽，不粘手”文字表述。同时，蜜桑叶水分、指标成分含量也是生产加工和质量控制的难题，有关蜜桑叶炮制工艺的文献报道较少。因此，明确蜜桑叶炮制工艺参数对蜜桑叶的生产加工及质量控制具有重要的参考价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提出一种蜜炙桑叶炮制工艺优化方法，以box-behnken设计-响应面法对蜜桑叶的炮制工艺进行优化，通过critic-ahp复合赋权法计算绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、总黄酮、醇浸出物、水分7项指标的权重系数，并求出总评“归一值”(od)，得到最佳炮制工艺结果。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

3、一种蜜炙桑叶炮制工艺优化方法，步骤如下：

4、1)运用uplc超高液相色谱法对蜜桑叶中绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷进行含量测定

5、2)总黄酮含量测定

6、按照以芦丁标准品构建的标准曲线测定样品中总黄酮浓度，并根据以下公式计算桑叶总黄酮含量：

7、

8、其中，c为测定液总黄酮浓度(mg·ml-1)；n为稀释倍数；v为样品体积(ml)；m为样品质量(g)；

9、3)醇浸出物含量测定

10、依照醇浸出物含量测定方法测定；

11、4)、水分的测定及赋分

12、测定水分含量后，选取水分含量7％～13％为最佳值，赋5分；0～7％或13％～15％为优值，赋4分；15％～20％为中值，赋3分；20％～30％为劣值，赋2分；30％以上为最差值，赋1分；

13、5)、critic熵权法确定权重

14、针对绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、总黄酮、醇浸出物、水分共计7项指标选用critic熵权法进行客观赋权，选用正向指标进行数据标准化处理，得到标准化值后，对各数据的相关性进行分析，得到相关性矩阵，再分别计算7个指标的权重；

15、6)、ahp层次分析法确定权重

16、针对7项指标，通过构建两两比较的判别矩阵，对重要性进行赋值，并计算权重；根据优先级顺序，计算得芦丁、醇浸出物、水分、总黄酮、异槲皮苷、紫云英苷及绿原酸的权重系数分别为：0.31、0.19、0.19、0.11、0.06、0.06、0.06，矩阵的一致性比例因子ci＝0.007及一致性比率cr＝0.005，均小于0.10；

17、7)、复合权重及综合评分的确定

18、将通过critic法计算得到的客观权重wi及通过ahp法计算得到的客观权重wa综合计算得到复合权重w，并计算得出od值：

19、复合权重计算公式：

20、od值计算公式：

21、8)单因素试验

22、以炒制温度、炒制时间以及辅料用量作为自变量因素，分别根据critic-ahp复合赋权法综合加权得到总评od值，并得到总评od值最高所对应的各取值中心点；

23、9)响应面法优化工艺试验

24、选择炒制温度(x1)、炒制时间(x2)、辅料用量(x3)三个因素为自变量，每个因素选取三个水平，并以绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、总黄酮、醇浸出物、水分含量的od值为响应值，进行3因素3水平实验，计算得到最高理论od值时所对应的炒制温度、炒制时间、辅料用量即为优化的蜜炙桑叶炮制工艺参数。

25、优化的蜜炙桑叶炮制工艺步骤为：取炼蜜7.5g，以沸水稀释(桑叶：沸水＝1：2)，淋入30g净制桑叶药材中拌匀，闷润4min，置于热锅内，以170℃炒制10min，取出冷凉，然后密封保存。

26、与现有技术相比，本发明的有益效果表现在：

27、1)、本课题组前期开展关于不同产地桑叶的指纹图谱研究，包括安徽亳州、安徽合肥、陕西临潼、江苏南京、广东清远等十个产地的桑叶。结果显示陕西临潼的桑叶中绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量最高，图谱出峰较多且分离度较好，因此本实验选取陕西临潼的桑叶作为实验材料。根据前期的预实验结果，本实验中蜜桑叶中用沸水稀释炼蜜的比例以桑叶：沸水＝1：2最为合适。过多的水量导致导致桑叶水分过多，延长炒干时间，增加蜜水在锅底粘黏损耗的量，影响结果的准确性。过少的水量则会导致蜜水无法浸润到全部桑叶，无法拌匀，且由于吸水不均导致炒制时受热不均，同样影响结果的准确性，故此选取桑叶：沸水＝1：2的比例稀释炼蜜。

28、2)、对于色谱条件的选择前期做了预实验筛选最佳条件。分别对不同流动相系统(乙腈-0.2％磷酸、乙腈-0.5％磷酸、甲醇-0.5％甲酸、乙腈-0.5％甲酸)进行考察，结果为乙腈-0.5％甲酸水溶液时的峰形和分离度最优。对乙醇回流与甲醇超声两种提取方法做了考察，结果显示两者色谱图信息差别不明显，但甲醇超声法操作简单，故选用甲醇超声的方法制备供试品溶液。

29、3)、critic熵权法可以客观的反映各因素间的重要性，但无法反映人为制定的法典及标准的要求，而ahp层次分析法则是一种通过主观决策分析分配权重的方法，本实验采用将两种赋权方法结合的复合赋权法，既能顾及人为规定的要求又能避免过度主观导致的误差。兼顾客观指标评价与主观人为规定两者优势，避免了单一客观评价导致结果不能满足法典规定，也避免了单一主观评价导致结果稳定性及可重复性降低。

30、4)、本发明将量化炒制温度、炒制时间、辅料用量三个因素，建立客观的评价方法，以box-behnken设计-响应面法对蜜桑叶的炮制工艺进行优化，利用现代仪器分析方法对蜜桑叶的指标成分进行检测，通过critic-ahp复合赋权法计算绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、总黄酮、醇浸出物、水分7项指标的权重系数，并求出总评“归一值”(od)，得到最佳炮制工艺结果，以期为蜜桑叶的规范化生产提供依据。

技术特征：

1.一种蜜炙桑叶炮制工艺优化方法，其特征在于，步骤如下：

2.如权利要求1所述的蜜炙桑叶炮制工艺优化方法，其特征在于，步骤1)中uplc超高液相色谱法的色谱条件为：eclipse plus c18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相为乙腈(a)-0.5％甲酸水溶液(b)，梯度洗脱程序为10％～15％a(0～3min)，15％～15％a(3～8min)，15％～25％a(8～15min)，25％～45％a(15～25min)，45％～70％a(25～27min)，70％～100％a(27～30min)，100％～10％a(30～32min)，10％～10％a (32～35min)；进样量为5μl；检测波长为358nm；流速为1.0ml·min-1；柱温为30℃。

3.如权利要求1或2所述的蜜炙桑叶炮制工艺优化方法，其特征在于，优化的蜜炙桑叶炮制工艺步骤为：取炼蜜7.5g，以沸水稀释(桑叶：沸水＝1：2)，淋入30g净制桑叶药材中拌匀，闷润4min，置于热锅内，以170℃炒制10min，取出冷凉，然后密封保存。

技术总结
蜜炙桑叶炮制工艺优化方法，涉及中医炮制技术领域，本发明将量化炒制温度、炒制时间、辅料用量三个因素，建立客观的评价方法，以Box‑Behnken设计‑响应面法对蜜桑叶的炮制工艺进行优化，利用现代仪器分析方法对蜜桑叶的指标成分进行检测，通过CRITIC‑AHP复合赋权法计算绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、总黄酮、醇浸出物、水分7项指标的权重系数，并求出总评“归一值”，得到最佳炮制工艺结果。最终优化炮制工艺步骤为：取炼蜜7.5g，以沸水稀释(桑叶：沸水＝1：2)，淋入30g净制桑叶药材中拌匀，闷润4min，置于热锅内，以170℃炒制10min，取出冷凉，然后密封保存。

技术研发人员：陈泽键,王玲玲,李园,巢同磊,黄维昆,朋汤义,刘子路,杨之童,薛羽,谢涛
受保护的技术使用者：安徽中医药大学第一附属医院（安徽省中医院）
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17