具有骨免疫调节功能的仿生骨膜及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物材料，具体涉及一种具有免疫调节功能的仿生骨膜及其制备方法和应用。

背景技术：

1、因创伤、感染、肿瘤等因素导致每年有大量人群发生骨缺损，虽然骨组织具有较强的再生修复能力，但对于大段骨缺损仍无法实现自愈。目前常用的骨缺损修复技术有ilizarov技术、带血管腓骨移植及自体松质骨移植等，但这些手术方法均存在明显不足，如来源有限、治疗周期长、移植骨吸收及成骨不全等。因此，研究理想的骨修复材料和治疗措施，对降低致残率，提高患者生活质量具有重要意义。

2、骨膜的缺失是造成骨移植成骨修复效果差的重要原因，而采用骨膜样组织覆盖在移植骨材料表面，可模拟骨膜诱导愈合过程。组织工程的快速发展为有效修复骨缺损提供了新的方向。采用天然高分子/合成高分子材料制成生物降解膜，依靠膜材料创造的独立空间引导骨生成细胞在其表面贴附、增殖分化为成骨细胞，从而实现骨再生。

3、生物支架植入宿主体内后，由于异物反应会引起相应的免疫反应却常常被忽略。当m1型巨噬细胞比例上升或持续时间长，将导致骨修复迟缓或骨不连；m2型巨噬细胞能促进干细胞向成骨细胞分化并有利于骨组织的修复再生，特别是在炎症中后期，在促进矿化能力中发挥重要作用。将促巨噬细胞m1型极化的材料植入体内，可使移植物周围形成肉芽肿、纤维包裹物，导致修复失败；而m2型巨噬细胞可通过tgf-β1途径诱导干细胞成骨分化，参与组织修复。因此，m2型巨噬细胞在骨缺损修复过程中发挥重要调控作用。而骨膜蛋白(periostin)是一种在骨膜中特异表达的细胞外基质蛋白，可以促进巨噬细胞向m2型极化。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的主要目的在于提供一种具有骨免疫调节功能的仿生骨膜及其制备方法和应用。

2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

3、第一方面，一种具有骨免疫调节功能的仿生骨膜，包括叠加在一起的外层静电纺丝膜和内层静电纺丝膜，所述外层静电纺丝膜和内层静电纺丝膜的表面和内部均匀分布设置有纳米羟基磷灰石，所述纳米羟基磷灰石上负载有细胞外基质蛋白。

4、在某些具体的实施例中，所述外层静电纺丝膜和内层静电纺丝膜均为胶原蛋白纤维膜，所述细胞外基质蛋白为periostin。

5、在某些具体的实施例中，所述外层静电纺丝膜的为平行取向纳米纤维，所述内层静电纺丝膜的随机取向纳米纤维。

6、第二方面，一种根据前述具有骨免疫调节功能的仿生骨膜的制备方法，包括如下步骤：

7、s1.将纳米羟基磷灰石置于的periostin水溶液中，2-6℃静置3天，沉淀、洗涤后获得pf-nha；

8、s2.以六氟异丙醇为溶剂配制i型胶原蛋白溶液，并将pf-nha分散于i型胶原蛋白溶液中，得到胶原溶液；

9、s3.仿生骨膜的制备：将所述胶原溶液采用不同的旋转速率进行静电纺丝，得到平行取向纳米纤维的外层静电纺丝膜，随机取向纳米纤维的内层静电纺丝膜；

10、s4.将至少一层外层静电纺丝膜和至少一层内层静电纺丝膜叠加在一起，制备得到仿生骨膜。

11、在某些具体的实施例中，所述纳米羟基磷灰石通过如下制备方法获得：

12、1)将可溶性钙盐溶液和磷酸盐溶液在碱性环境下沉淀结晶，陈化2-5天后用去离子水洗涤至中性获得nha晶体；

13、2)配制nha晶体溶液，将双磷酸盐滴入至nha溶液中，搅拌反应后，离心，去除上清液并采用dh2o洗涤，再用dh2o重新溶解，获得阿仑膦酸钠修饰的nha-al溶液；

14、3)将fe3o4悬液滴入上述nha-al溶液搅拌反应后，离心，去除上清液并采用dh2o洗涤，得到f-nha。

15、在某些具体的实施例中，所述可溶性钙盐为ca(no3)2，所述磷酸盐为(nh4)2hpo4溶液，所述可溶性钙盐溶液和磷酸盐溶液的体积比为1:(1-5)，且所述可溶性钙盐溶液的摩尔浓度为0.3-0.6m，所述磷酸盐溶液的浓度为0.5-0.5m；所述双磷酸盐为帕米膦酸钠、阿仑磷酸钠、唑来磷酸钠中的一种或者多种；所述双磷酸盐溶液与nha晶体的体积比为1:(1-3)，所述nha溶液的浓度为30-50mm，所述双磷酸盐溶液的浓度为6-10mm；所述nha-al溶液与fe3o4悬液的体积比为1:(1-5)，所述nha-al溶液的浓度为2-8mm，所述fe3o4悬液的浓度为3-8mm。

16、在某些具体的实施例中，所述f-nha溶液与periostin水溶液的体积比为1:(2-6)，所述f-nha的浓度为3-15mm，所述periostin水溶液的浓度为40-60μg/ml；所述i型胶原蛋白溶液的质量浓度为4-8％，所述pf-nha在i型胶原蛋白溶液的质量浓度为3-8mg/ml。

17、在某些具体的实施例中，所述静电纺丝参数为：温度20-60℃，湿度40-90％，静电高压5-20kv，接收距离5-20cm，推注速率0.8-10ml/h，将接收杆的旋转速率设定为300rpm或50rpm中的一种。

18、在某些具体的实施例中，步骤s4具体为：将2％的胶原蛋白溶液均匀倒入同等大小的fsa和fsr表面，然后相互压在一起形成复合膜，并将复合膜在-30--80℃下冷冻12-36h后，用戊二醛交联后dh2o洗涤，即得仿生骨膜。

19、第三方面，前述具有骨免疫调节功能的仿生骨膜或采用前述制备方法制备得到的具有骨免疫调节功能的仿生骨膜在制备骨修复产品中的应用。

20、与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

21、本发明所提供的仿生骨膜，从多维仿生角度出发，将periostin负载于功能化纳米羟基磷灰石(functionalized nano hydroxyapatite，f-nha)表面，使其除了具有调节巨噬细胞m2极化功能以外，还兼具促进成骨分化、磁性响应等功能化纳米羟基磷灰石的特殊功能。然后，将负载periostin的f-nha(pf-nha)分散于i型胶原蛋白溶液中，通过静电纺丝技术制备高取向性(fiber scaffold with aligned orientation，fsa)和随机取向性(fiberscaffold with random orientation，fsr)两种不同表面拓扑结构的支架材料。最后，通过两种材料复合构建一种具有骨免疫调节功能的仿生骨膜，使外层高取向结构具有免疫调节功能，内层随机取向结构具有促成骨作用。

技术特征：

1.一种具有骨免疫调节功能的仿生骨膜，其特征在于，包括叠加在一起的外层静电纺丝膜和内层静电纺丝膜，所述外层静电纺丝膜和内层静电纺丝膜的表面和内部均匀分布设置有纳米羟基磷灰石，所述纳米羟基磷灰石上负载有细胞外基质蛋白。

2.根据权利要求1所述的具有骨免疫调节功能的仿生骨膜，其特征在于，所述外层静电纺丝膜和内层静电纺丝膜均为胶原蛋白纤维膜，所述细胞外基质蛋白为periostin。

3.根据权利要求1所述的具有骨免疫调节功能的仿生骨膜，其特征在于，所述外层静电纺丝膜的为平行取向纳米纤维，所述内层静电纺丝膜的随机取向纳米纤维。

4.一种根据权利要求1所述的具有骨免疫调节功能的仿生骨膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的具有骨免疫调节功能的仿生骨膜的制备方法，其特征在于，所述纳米羟基磷灰石通过如下制备方法获得：

6.根据权利要求4所述的具有骨免疫调节功能的仿生骨膜的制备方法，其特征在于，所述可溶性钙盐为ca(no3)2，所述磷酸盐为(nh4)2hpo4溶液，所述可溶性钙盐溶液和磷酸盐溶液的体积比为1:(1-5)，且所述可溶性钙盐溶液的摩尔浓度为0.3-0.6m，所述磷酸盐溶液的浓度为0.5-0.5m；所述双磷酸盐为帕米膦酸钠、阿仑磷酸钠、唑来磷酸钠中的一种或者多种；所述双磷酸盐溶液与nha晶体的体积比为1:(1-3)，所述nha溶液的浓度为30-50mm，所述双磷酸盐溶液的浓度为6-10mm；所述nha-al溶液与fe3o4悬液的体积比为1:(1-5)，所述nha-al溶液的浓度为2-8mm，所述fe3o4悬液的浓度为3-8mm。

7.根据权利要求4所述的具有骨免疫调节功能的仿生骨膜的制备方法，其特征在于，所述f-nha溶液与periostin水溶液的体积比为1:(2-6)，所述f-nha的浓度为3-15mm，所述periostin水溶液的浓度为40-60μg/ml；所述i型胶原蛋白溶液的质量浓度为4-8％，所述pf-nha在i型胶原蛋白溶液的质量浓度为3-8mg/ml。

8.根据权利要求7所述的具有骨免疫调节功能的仿生骨膜的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝参数为：温度20-60℃，湿度40-90％，静电高压5-20kv，接收距离5-20cm，推注速率0.8-10ml/h，将接收杆的旋转速率设定为300rpm或50rpm中的一种。

9.根据权利要求7所述的具有骨免疫调节功能的仿生骨膜的制备方法，其特征在于，步骤s4具体为：将2％的胶原蛋白溶液均匀倒入同等大小的fsa和fsr表面，然后相互压在一起形成复合膜，并将复合膜在-30--80℃下冷冻12-36h后，用戊二醛交联后dh2o洗涤，即得仿生骨膜。

10.权利要求1-3任一项所述的具有骨免疫调节功能的仿生骨膜或采用权利要求4-9任一项所述的制备方法制备得到的具有骨免疫调节功能的仿生骨膜在制备骨修复产品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种具有骨免疫调节功能的仿生骨膜，包括叠加在一起的外层静电纺丝膜和内层静电纺丝膜，外层静电纺丝膜和内层静电纺丝膜的表面和内部均匀分布设置有纳米羟基磷灰石，纳米羟基磷灰石上负载有细胞外基质蛋白。本发明还公开了该具有骨免疫调节功能的仿生骨膜的制备方法和应用。本发明所提供的仿生骨膜，从多维仿生角度出发，将Periostin负载于功能化纳米羟基磷灰石表面，然后将负载Periostin的f‑nHA分散于I型胶原蛋白溶液中，通过静电纺丝技术制备高取向性和随机取向性两种不同表面拓扑结构的纳米纤维支架材料。最后，通过两种材料复合构建一种外层高取向结构(FSa)具有免疫调节功能，内层随机取向结构(FSr)具有促成骨作用的仿生骨膜。

技术研发人员：李晓明,吴鹏飞,代维
受保护的技术使用者：中国人民解放军陆军特色医学中心
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17