一种基于蚕丝和胶原的仿生湿润双层人工皮肤及制备方法与流程

本发明涉及一种仿生湿润双层人工皮肤及其制备方法，特别涉及一种基于蚕丝和胶原的仿生湿润双层人工皮肤及制备方法。

背景技术：

1、皮肤是人体最大的器官，在免疫防护、感觉传导、体温调控以及人体美观等方面起到非常重要的作用。创伤和肿瘤的切除往往会导致大面积的全层皮肤缺损。目前临床上对于大面积全层皮肤组织缺损的治疗主要采用自体皮肤移植(皮瓣修复)、同种异体皮肤移植以及异种皮肤移植。传统治疗手段存在供体短缺、免疫排异以及病毒传播等风险。

2、组织工程技术的出现为大尺寸皮肤缺损的再生带来了新的技术手段。传统的皮肤组织工程支架由生物材料和生物活性因子(如细胞和生长因子等)组成。添加细胞或生长因子虽然能促进皮肤愈合，但也使组织工程皮肤支架的成本更加昂贵以及质量控制更加复杂。因此，开发仅含生物材料的组织工程皮肤支架来实现高效的皮肤再生则具有更广阔的转化前景和临床意义。

3、发明专利cn101716375b公开了一种双层人工皮肤制备方法，其中表皮层是丝素蛋白和壳聚糖制备的薄膜，真皮层是胶原蛋白和透明质酸钠制备而来的多孔海绵。该人工皮肤未进行化学交联，为干燥支架，力学强度欠佳(拉伸模量7.0mpa)。本发明拟构建一种仿生湿润双层人工皮肤，其中表皮层由桑蚕丝来源的丝素蛋白组成，真皮部分由胶原蛋白水凝胶组成，表皮层和真皮层通过化学交联整合。所述人工皮肤具有约40.0mpa左右的拉伸模量，而且可以促进细胞粘附和增殖，可用于促进皮肤组织再生。

技术实现思路

1、本发明目的提供一种基于蚕丝和胶原蛋白的双层人工皮肤、制备方法及应用，该人工皮肤模拟天然皮肤的结构、细胞外基质组分及功能，具有抗拉伸性能，而且能促进人成纤维细胞粘附和增殖，可应用于全层皮肤缺损的修复再生。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明公开了一种基于蚕丝和胶原的仿生湿润双层人工皮肤，所述的人工皮肤包括表皮层和真皮层，所述的表皮层是拉伸模量大于40mpa的丝素蛋白湿态薄膜，所述的真皮层是胶原蛋白水凝胶，所述的表皮层和真皮层通过化学交联整合形成双层人工皮肤。

4、本发明还公开了一种基于蚕丝和胶原的仿生湿润双层人工皮肤的制备方法，步骤如下：

5、1)从蚕丝提取丝素蛋白，并制备丝素蛋白湿态薄膜表皮层；

6、2)将胶原蛋白溶液倒入丝素蛋白湿态薄膜表皮上方，并进行化学交联，得到双层支架；

7、3)将化学交联后的双层支架进行洗涤，得到仿生湿润双层人工皮肤。

8、作为进一步地改进，本发明所述的制备表皮层丝素蛋白湿态薄膜包括如下制备步骤：

9、1)脱胶：将桑蚕蚕丝放入碳酸钠水溶液中，煮沸脱胶，然后取出，用纯化水清洗，得到丝素蛋白，干燥后室温保存；

10、2)溶解：将步骤1)中得到的干燥后的丝素蛋白溶解于溴化锂溶液中，水浴加热至丝素蛋白完全溶解，得到丝素蛋白/溴化锂溶液；

11、3)透析：将步骤2)中得到的丝素蛋白/溴化锂溶液装入再生纤维素透析袋中，并放入纯化水中进行透析，除去溴化锂，获得丝素蛋白的纯化水溶液；

12、4)将丝素蛋白的纯化水溶液冷冻过夜，然后转移至冻干机，冷冻干燥后获得冻干的再生丝素蛋白海绵；

13、5)用去离子水溶解步骤4)获得的再生丝素蛋白海绵获得再生丝素蛋白溶液；

14、6)将步骤5)获得的丝素蛋白溶液加入模具中，然后置于0℃～65℃下彻底干燥，得到干燥后的丝素蛋白薄膜；

15、7)在乙醇水溶液中浸泡2～6小时，去除乙醇，随后加去离子水没过干燥后的丝素蛋白薄膜，在温度25～75℃下放置0.5～6小时，然后加入生理盐水，获得湿润交联丝素蛋白表皮支架。

16、作为进一步地改进，本发明所述的丝素蛋白湿态薄膜是由桑蚕蚕丝提取的丝素蛋白制备的。

17、作为进一步地改进，本发明所述的步骤6)中的模具为不锈钢皿或聚四氟乙烯高分子模具。

18、作为进一步地改进，本发明所述的步骤3)中的再生纤维素透析袋的截留分子量为5000-14000道尔顿。

19、作为进一步地改进，本发明所述的将胶原蛋白溶液倒入丝素蛋白湿态薄膜表皮上方，并进行化学交联，得到双层支架具体包括如下制备步骤：

20、1)将胶原蛋白溶液加入到丝素蛋白湿态薄膜表皮层上；

21、2)向模具中加入化学交联剂进行交联，得到下层为丝素蛋白湿态薄膜，上层为胶原蛋白水凝胶的双层支架；

22、3)将步骤2)中得到的双层支架用磷酸盐缓冲液清洗后，得到湿态双层人工皮肤。

23、作为进一步地改进，本发明所述的步骤1)中的胶原蛋白溶液中的胶原蛋白来自动物组织或来自微生物发酵或哺乳动物细胞表达，所述的胶原蛋白为ⅰ型胶原蛋白、ⅲ型胶原蛋白、xvⅱ型胶原蛋白、vⅱ型胶原蛋白中的任意一种，所述的动物组织为猪皮或牛跟腱或鱼皮或鱼鳞，所述的微生物发酵和哺乳动物细胞表达的为重组胶原蛋白。

24、作为进一步地改进，本发明所述的步骤2)中的化学交联剂为碳化二亚胺、二胺、环氧化合物、羟基琥珀酰亚胺、戊二醛和京尼平中的任意一种或任意几种的组合。

25、作为进一步地改进，本发明所述的化学交联剂为碳化二亚胺与羟基琥珀酰亚胺时，其摩尔比为3:1～8:1。

26、与现有技术相比，本发明的创新以及有益效果主要体现在：

27、1.发明使用两类来源广泛的天然材料构建出从空间结构、材料物质成分以及生物学功能三个维度仿生人体皮肤的双层湿润人工皮肤，为皮肤组织修复再生提供了新策略。

28、2.本发明制备出结构模拟天然皮肤的双层支架，其中丝素蛋白表皮层结构致密具有疏水防护作用，胶原蛋白水凝胶层模拟天然真皮，结构疏松多孔，能为细胞的粘附和生长提供适宜的微环境。(对应图3)

29、3.本发明利用化学反应对丝素蛋白湿态薄膜表皮和胶原蛋白水凝胶真皮层进行交联，使表皮层与真皮层之间通过化学键连接，整合良好。

30、4.本发明基于蚕丝和胶原蛋白制备双层人工皮肤支架所采用的工艺简单，有利于大批量生产操作。

31、5.本发明制备仿生湿润双层人工皮肤所采用的高分子材料均为可降解天然生物材料，生物相容性良好，且能随着皮肤组织再生而降解，使用后不需要剥离去除。

32、6.本发明制备出的仿生湿润双层人工皮肤具有优异的力学性能(拉伸模量高达40.0mpa)，可抗拉伸，对患处活动的限制小。(对应图4，5)

33、7.本发明的真皮层为胶原蛋白水凝胶，模拟天然皮肤真皮细胞外基质组成，进行物质成分仿生，促进细胞粘附和增殖，从而可以加快组织愈合。(对应图6、7、8、9)

34、8.本发明同时明确了基于蚕丝和胶原蛋白的仿生湿润双层人工皮肤的理化特性，并利用体外细胞实验验证了该支架的功能，为该人工皮肤的临床应用提供了基础。

技术特征：

1.一种基于蚕丝和胶原的仿生湿润双层人工皮肤，其特征在于，所述的人工皮肤包括表皮层和真皮层，所述的表皮层是拉伸模量大于40mpa的丝素蛋白湿态薄膜，所述的真皮层是胶原蛋白水凝胶，所述的表皮层和真皮层通过化学交联整合形成双层人工皮肤。

2.一种基于蚕丝和胶原的仿生湿润双层人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述的步骤如下：

3.根据权利要求2所述的基于蚕丝和胶原的仿生湿润双层人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述的制备表皮层丝素蛋白湿态薄膜包括如下制备步骤：

4.根据权利要求3所述的基于蚕丝和胶原的仿生湿润双层人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述的丝素蛋白是由桑蚕蚕丝提取的丝素蛋白制备。

5.根据权利要求3所述的基于蚕丝和胶原的仿生湿润双层人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述步骤6)中的模具为不锈钢皿或聚四氟乙烯高分子模具。

6.根据权利要求3或4所述的基于蚕丝和胶原的仿生湿润双层人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述的步骤3)中的再生纤维素透析袋的截留分子量为5000-14000道尔顿。

7.根据权利要求6所述的基于蚕丝和胶原的仿生湿润双层人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述的将胶原蛋白溶液倒入丝素蛋白湿态薄膜表皮上方，并进行化学交联，得到双层支架具体包括如下制备步骤：

8.根据权利要求7所述的基于蚕丝和胶原的仿生湿润双层人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述的步骤1)中的胶原蛋白溶液中的胶原蛋白来自动物组织或来自微生物发酵或哺乳动物细胞表达，所述的胶原蛋白为ⅰ型胶原蛋白、ⅲ型胶原蛋白、xvⅱ型胶原蛋白、vⅱ型胶原蛋白中的任意一种，所述的动物组织为猪皮或牛跟腱或鱼皮或鱼鳞，所述的微生物发酵和哺乳动物细胞表达的为重组胶原蛋白。

9.根据权利要求7或8所述的基于蚕丝和胶原的仿生湿润双层人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述的步骤2)中的化学交联剂为碳化二亚胺、二胺、环氧化合物、羟基琥珀酰亚胺、戊二醛和京尼平中的任意一种或任意几种的组合。

10.根据权利要求9所述基于蚕丝和胶原的仿生湿润双层人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述的化学交联剂为碳化二亚胺与羟基琥珀酰亚胺时，其摩尔比为3:1～8:1。

技术总结
本发明公开了一种基于蚕丝和胶原的仿生湿润双层人工皮肤及制备方法，本发明具有双层结构，分别模拟天然皮肤的表皮层和真皮层，且两层结构通过化学交联进行复合，表皮层由蚕丝来源的丝素蛋白膜组成，具有致密平滑的形貌，拉伸模量约40MPa，可以提供抗拉伸和保护作用；真皮层由胶原蛋白水凝胶组成，具有疏松多孔的形貌，可以为细胞粘附和生长提供空间。真皮层的胶原蛋白水凝胶具有促进细胞粘附和增殖的作用，可以使真皮层快速再生。因此，本发明所提供的双层人工皮肤不仅可用于治疗烧伤、机械损伤以及肿瘤切除导致的皮肤缺损，同样可用于治疗由于Ⅱ型糖尿病、肾功能障碍等造成的难愈合性皮肤溃疡，还可作为皮肤细胞培养所用三维支架。

技术研发人员：梁仁杰,王艺蓉,励迪鹏,孙伟庆,张薇,贾倩倩,朱美琴
受保护的技术使用者：杭州协合医疗用品有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/8