一种羟基磷灰石渐进交联胶原蛋白复合支架材料及其制备方法和应用与流程

本发明属于骨组织工程，具体涉及一种羟基磷灰石渐进交联胶原蛋白复合支架材料及其制备方法和应用。

背景技术：

1、胶原蛋白，作为一种天然的高分子生物材料，广泛存在于动物的皮肤、骨、肌腱等组织中，其独特的生物相容性和生物降解性使得它在生物医学和组织工程中得到了广泛的应用。但是，胶原蛋白的天然性能并不完美，尤其是在骨组织工程领域，其力学性能和生物稳定性仍需进一步提高。

2、胶原蛋白的交联生物合成已经成为研究热点，其分子间可以相互滑动，但在没有交联的情况下，胶原纤维容易受到各种环境因子（酶）的降解。为了提高胶原蛋白的稳定性和功能性，通常需要进行交联处理。传统的交联方法主要包括物理交联和化学交联。物理交联，如紫外线照射或冷冻-解冻，虽然简单，但可能不够稳定；而化学交联，如使用醛类化合物，可能会引入有毒的残留物，影响材料的生物相容性。因此，开发一种既安全又有效的胶原蛋白交联方法具有重要意义。

3、为了更好地应用于骨组织工程和修复骨缺损，胶原蛋白需要与其他材料，如羟基磷灰石（hap）进行复合，形成稳定的涂层或支架。hap是骨组织的主要无机成分，与胶原蛋白复合后，不仅可以提高支架的力学性能，还可以促进骨组织的再生和修复。但传统的hap涂层技术可能导致涂层不均匀，或者hap与胶原蛋白之间的结合不紧密，进而降低支架的机械性能和生物活性。因此，如何确保hap涂层的均匀性并增强其与胶原蛋白之间的附着性成为研究的重点。

技术实现思路

1、解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供了一种羟基磷灰石渐进交联胶原蛋白复合支架材料及其制备方法和应用，通过赖氨酸氧化酶与铜离子协同作用，提高了交联胶原蛋白的交联效率和成功率，增强了其稳定性、机械强度和生物相容性；通过交替浸泡实现了hap的均匀附着，提高了支架的界面活性、骨诱导性和力学性能。

2、技术方案：一种羟基磷灰石渐进交联胶原蛋白复合支架材料，通过以下方法获得复合支架材料：向胶原蛋白水溶液中依次加入赖氨酸氧化酶的水溶液和氯化铜溶液，再依次经过孵育、离心和透析，去除小分子杂质和铜离子，得到交联后的胶原蛋白；将其交替在钙盐水溶液和磷酸盐水溶液中孵育若干次，水洗干燥后进行冷冻真空干燥，即获得所述复合支架材料。

3、一种羟基磷灰石渐进交联胶原蛋白复合支架材料的制备方法，包括步骤如下：

4、步骤一、向胶原蛋白水溶液中依次加入赖氨酸氧化酶的水溶液和氯化铜溶液并搅拌；

5、步骤二、将步骤一所得溶液的ph调节为2.5~8.5，然后在0~40℃下保温孵育1~24h；

6、步骤三、孵育完成后离心，去上清液，将沉淀物透析去除小分子杂质和铜离子，得到交联后的胶原蛋白；

7、步骤四、将交联后的胶原蛋白交替在钙盐水溶液和磷酸盐水溶液中孵育，水洗干燥后在-20~-80℃下预冷，然后真空冻干，即获得所述复合支架材料。

8、优选的，所述步骤一中，所述胶原蛋白水溶液的浓度为2mg/ml，赖氨酸氧化酶的水溶液的浓度为1 mg/ml，氯化铜溶液中铜离子浓度为1mm/ml。

9、优选的，所述步骤二中，溶液的ph为7.5。

10、优选的，所述步骤二中，保温孵育的温度为37℃，时间为24h。

11、优选的，所述步骤三中，离心的转速为10000rpm，时间为10min。

12、优选的，所述步骤三中，采用edta的pbs溶液作为透析液，透析的时间为36h。

13、优选的，所述步骤四中，孵育的温度为37℃，每次在钙盐水溶液和磷酸盐水溶液中孵育的时间分别为1h。

14、优选的，所述步骤四中，预冷的温度为-40℃，时间为24h；真空冻干的时间为48h。

15、羟基磷灰石渐进交联胶原蛋白复合支架材料在骨组织工程中的应用。

16、有益效果：本发明通过赖氨酸氧化酶与铜离子协同作用，提高了交联胶原蛋白的交联效率和成功率，增强了其稳定性、机械强度和生物相容性；通过交替浸泡实现了hap的均匀附着，提高了支架的界面活性、骨诱导性和力学性能。

17、具体的，本发明采用赖氨酸氧化酶与铜离子的组合，模拟了人体的自然成胶过程，可以实现胶原蛋白分子内部的深度交联，提高胶原蛋白的稳定性和机械强度，同时保持其三维结构的完整性。这种渐进性交联方法既温和又可控，减少副反应的发生，使胶原蛋白的稳定性、机械性能和安全性均得到了明显提高，更加适合作为生物医学材料使用。本发明还将ph调整至生物相容的水平，确保了交联后的胶原蛋白的生物活性和安全性。本发明通过透析确保有效去除小分子杂质和铜离子，确保产品的纯度和生物安全性。本发明采用在-40℃下预冷24小时，然后在真空条件下冻干48小时这一步骤确保了胶原蛋白的稳定性和长期保存。

18、本发明采用交替浸泡的方式，有效地制备了hap涂层，这种涂层进一步增强了支架材料的生物相容性和骨诱导性。相较于传统的涂层制备技术，交替浸泡法能够确保hap涂层均匀地覆盖在胶原蛋白上，从而保证涂层的完整性和持久性。这一步骤对于骨组织工程及其它生物医学应用至关重要，因为它为胶原蛋白支架提供了更为优越的界面活性，有助于保持胶原蛋白的生物活性，同时加强了其与骨细胞的亲和力，有助于支架与周围组织的结合和相互作用，从而提高骨组织工程的效果。

技术特征：

1.一种羟基磷灰石渐进交联胶原蛋白复合支架材料，其特征在于，通过以下方法获得复合支架材料：向胶原蛋白水溶液中依次加入赖氨酸氧化酶的水溶液和氯化铜溶液，再依次经过孵育、离心和透析，去除小分子杂质和铜离子，得到交联后的胶原蛋白；将其交替在钙盐水溶液和磷酸盐水溶液中孵育若干次，水洗干燥后进行冷冻真空干燥，即获得所述复合支架材料。

2.权利要求1所述的一种羟基磷灰石渐进交联胶原蛋白复合支架材料的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：

3.根据权利要求2所述的一种羟基磷灰石渐进交联胶原蛋白复合支架材料的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，所述胶原蛋白水溶液的浓度为2mg/ml，赖氨酸氧化酶的水溶液的浓度为1 mg/ml，氯化铜溶液中铜离子浓度为1mm/ml。

4.根据权利要求2所述的一种羟基磷灰石渐进交联胶原蛋白复合支架材料的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，溶液的ph为7.5。

5.根据权利要求2所述的一种羟基磷灰石渐进交联胶原蛋白复合支架材料的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，保温孵育的温度为37℃，时间为24h。

6.根据权利要求2所述的一种羟基磷灰石渐进交联胶原蛋白复合支架材料的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，离心的转速为10000rpm，时间为10min。

7.根据权利要求2所述的一种羟基磷灰石渐进交联胶原蛋白复合支架材料的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，采用edta的pbs溶液作为透析液，透析的时间为36h。

8.根据权利要求2所述的一种羟基磷灰石渐进交联胶原蛋白复合支架材料的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，孵育的温度为37℃，每次在钙盐水溶液和磷酸盐水溶液中孵育的时间分别为1h。

9.根据权利要求2所述的一种羟基磷灰石渐进交联胶原蛋白复合支架材料的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，预冷的温度为-40℃，时间为24h；真空冻干的时间为48h。

10.权利要求1所述的羟基磷灰石渐进交联胶原蛋白复合支架材料在骨组织工程中的应用。

技术总结
本发明公开了一种羟基磷灰石渐进交联胶原蛋白复合支架材料及其制备方法和应用，属于骨组织工程技术领域。该复合支架材料的制备方法为：向胶原蛋白水溶液中依次加入赖氨酸氧化酶的水溶液和氯化铜溶液，再依次经过孵育、离心和透析，去除小分子杂质和铜离子，得到交联后的胶原蛋白；将其交替在钙盐水溶液和磷酸盐水溶液中孵育若干次，水洗干燥后进行冷冻真空干燥，即获得所述复合支架材料。本发明通过赖氨酸氧化酶与铜离子协同作用，提高了交联胶原蛋白的交联效率和成功率，增强了其稳定性、机械强度和生物相容性；通过交替浸泡实现了HAP的均匀附着，提高了支架的界面活性、骨诱导性和力学性能。

技术研发人员：张永强,姚庆强
受保护的技术使用者：南京市第一医院
技术研发日：
技术公布日：2024/5/19