一种干细胞外泌体复合剂及其制备方法及应用与流程

本发明涉及犬类眼病药物。具体地说是一种干细胞外泌体复合剂及其制备方法及应用。

背景技术：

1、干燥性角膜结膜炎(keratoconjμnct i vit i s s icca，kcs)是犬类较常见的眼病之一，由于角膜不同程度的损伤,导致出现眼部不适、分泌物增多、视觉障碍、以及眼表炎症等一系症状，从而导致的泪膜稳定性下降或失明，狗狗干眼症主要表现为频繁眨眼，用前肢抓眼，眼睛表面失去光泽，多伴有眼部黏液或黏液脓样性分泌物干且硬的眼屎，在发病早期，眼球表面会变得浑浊、干燥，接着便出现纤维化，甚至出现眼睑痉挛的现象。临床缺乏有效措施,常应用大剂量维生素、甲状腺素或雌激素、滴人工泪液以缓解眼干燥和异物感,效果多不理想，随着时间推移症状则在不断加剧，导致角膜出不同程度的溃疡,前葡萄膜眼以及色素沉着等现象，随着病情的加重病犬的视力逐渐受到影响,最终可导致失明。

技术实现思路

1、为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种干细胞外泌体复合剂及其制备方法及应用，成本低，易吸收，具有治疗炎症、延长泪膜破裂时间、修复角膜上皮的作用，通过滋阴润燥生津而润养结角膜，使犬类眼睛炎症消失视力提高。

2、为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

3、一种干细胞外泌体复合剂，包括凝胶载体、犬源胎盘蜕膜外泌体、熊胆混合液和人工泪液。

4、更进一步地，包括2.5-3.5ml的犬源胎盘蜕膜外泌体、2-3ml的熊胆混合液和93.5-95.5ml的人工泪液，余量为凝胶载体。

5、更进一步地，所述人工泪液包括羧甲纤维素2.0-2.2g、氯化钠6.9-7.0g、氯化钾0.14-0.15g、碳酸氢钠0.2-0.25g、氯化钙0.42-0.45g和葡萄糖1.0-1.2g，余量为注射用水，所述人工泪液的ph为6.8-7.5，所述人工泪液的渗透压为290-310mosm/l。

6、一种干细胞外泌体复合剂的制备方法，包括如下步骤：

7、s1、制备犬源胎盘蜕膜外泌体，将犬胎盘蜕膜剪切为若干组织块后加入消化酶进行消化，消化后的组织块加入细胞培养液中培养后获得外泌体粗提液，将外泌体粗提液纯化后收集获得犬源胎盘蜕膜外泌体；

8、s2、制备熊胆混合液，将适量熊胆粉提取液和二权狗牙花提取物加注射用水并加热煮沸使之溶解，放冷后加乙醇，静置并滤过，收集上清液即为熊胆混合液；

9、s3、制备人工泪液，无菌状态在羧甲纤维素中加入注射用水中，充分搅拌均匀后依次加入氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钙和葡萄糖，充分搅拌均匀，获得人工泪液；

10、s4、制备凝胶载体：将壳聚糖溶解在醋酸溶液中,搅拌均匀后加入戊二醛，于50-55℃下加热1h，室温放置过夜即得凝胶载体；

11、s5、制备干细胞外泌体复合剂，在注射用水中加入适量比例的犬源胎盘蜕膜外泌体、熊胆混合液和人工泪液并搅拌使之溶解形成混合液，将凝胶载体缓缓加入到混合液中并搅拌至均匀，灭菌、分装后即得干细胞外泌体复合剂。

12、更进一步地，步骤s1中，犬源胎盘蜕膜外泌体的制备包括如下具体步骤：

13、a1、将清洗干净的犬胎盘蜕膜放入到无菌容器中，用消毒灭菌剪刀剪成1-3cm的组织块，用无菌生理盐水反复冲洗至无血渍；

14、a2、将上述组织块用无菌剪刀剪成2-3mm2的小组织块，按消化酶和细胞体积比0.2-0.3:1的比例向小组织块中加入温和消化酶，放入恒温摇床，37℃下消化30-60min，中间观察3-4次，避免细胞过度消化；

15、a3、将步骤a2中消化后的小组织块加入细胞培养液中形成混合液，用100μm无菌细胞筛网过滤消化后的混合液，离心后弃上清，收集原代细胞；

16、a4、将原代细胞按照1.0×104个活细胞/cm2接种于无菌培养瓶中，放置在37℃、0.5％ co2培养箱中，培养40-48小时收集培养液，于200000×g下离心2小时，得到外泌体粗提液；

17、a5、采用蔗糖梯度离心法，以200000×g离心16-20小时，使外泌体粗提液沉降到1.1-1.2g/ml的等密度层，收集该密度层的悬液，即可得到纯化后的犬源胎盘蜕膜外泌体。

18、更进一步地，步骤s2中，熊胆混合液的制备包括如下具体步骤：

19、b1、熊胆粉提取液的制备，取适量熊胆粉加入无菌注射用水中搅拌均匀形成初始熊胆混合液，加热煮沸后至室温，向初始熊胆混合液中加入95％乙醇，静止24小时后采用滤液减压回收乙醇，抽取上清液并将上清液用0.45μm的无菌滤器过滤到无菌容器内，放置至4℃，向过滤后的上清液内加入无菌注射用水和95％乙醇，按上述过程循环4次，将4次收集的上清液混合均匀，再静止4小时后用0.22μm的无菌过滤器进行过滤，收集上清液，获得熊胆粉提取液；

20、b2、二权狗牙花提取物的制备，取二权狗牙花干燥根茎,粉碎后以95％乙醇常温下浸泡一周，加热回流提取3次,减压浓缩提取液得浸膏状的二权狗牙花提取物；

21、b3、将熊胆粉提取液和二权狗牙花提取物混合，加入适量抑菌剂，混匀后过滤，得到熊胆混合液。

22、更进一步地，步骤b2中，初始熊胆混合液和95％乙醇的质量比为1:10-15，滤液减压回收乙醇在75℃、-0.08mpa下进行。

23、一种干细胞外泌体复合剂在制备犬类干眼病药物中的应用，所述干细胞外泌体复合剂包括凝胶载体、犬源胎盘蜕膜外泌体、熊胆混合液和人工泪液。

24、本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：

25、本发明一种干细胞外泌体复合剂及其制备方法及应用，外泌体不仅具有干细胞的再生能力，调节损伤修复，来源广泛，而且不含活体细胞，可以避免干细胞治疗原有的风险和副作用，由犬源胎盘蜕膜外泌体，成本低，易吸收，具有治疗炎症、延长泪膜破裂时间、修复角膜上皮的作用。

技术特征：

1.一种干细胞外泌体复合剂，其特征在于，包括凝胶载体、犬源胎盘蜕膜外泌体、熊胆混合液和人工泪液。

2.根据权利要求1所述的干细胞外泌体复合剂，其特征在于，包括2.5-3.5ml的犬源胎盘蜕膜外泌体、2-3ml的熊胆混合液和93.5-95.5ml的人工泪液，余量为凝胶载体。

3.根据权利要求2所述的干细胞外泌体复合剂，其特征在于，所述人工泪液包括羧甲纤维素2.0-2.2g、氯化钠6.9-7.0g、氯化钾0.14-0.15g、碳酸氢钠0.2-0.25g、氯化钙0.42-0.45g和葡萄糖1.0-1.2g，余量为注射用水，所述人工泪液的ph为6.8-7.5，所述人工泪液的渗透压为290-310mosm/l。

4.一种干细胞外泌体复合剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.根据权利要求3所述的干细胞外泌体复合剂的制备方法，其特征在于，步骤s1中，犬源胎盘蜕膜外泌体的制备包括如下具体步骤：

6.根据权利要求3所述的干细胞外泌体复合剂的制备方法，其特征在于，步骤s2中，熊胆混合液的制备包括如下具体步骤：

7.根据权利要求6所述的干细胞外泌体复合剂的制备方法，其特征在于，步骤b2中，初始熊胆混合液和95％乙醇的质量比为1:10-15，滤液减压回收乙醇在75℃、-0.08mpa下进行。

8.一种干细胞外泌体复合剂在制备犬类干眼病药物中的应用，其特征在于，所述干细胞外泌体复合剂包括凝胶载体、犬源胎盘蜕膜外泌体、熊胆混合液和人工泪液。

技术总结
本发明公开一种干细胞外泌体复合剂，包括凝胶载体、犬源胎盘蜕膜外泌体、熊胆混合液和人工泪液；一种干细胞外泌体复合剂的制备方法，包括如下步骤：S1、制备犬源胎盘蜕膜外泌体；S2、制备熊胆混合液；S3、制备人工泪液；S4、制备凝胶载体；S5、制备干细胞外泌体复合剂；一种干细胞外泌体复合剂在制备犬类干眼病药物中的应用，所述干细胞外泌体复合剂包括凝胶载体、犬源胎盘蜕膜外泌体、熊胆混合液和人工泪液；本发明提供的干细胞外泌体复合剂及其制备方法及应用，成本低，易吸收，具有治疗炎症、延长泪膜破裂时间、修复角膜上皮的作用，通过滋阴润燥生津而润养结角膜，使犬类眼睛炎症消失视力提高。

技术研发人员：韩改会
受保护的技术使用者：河南省华隆生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/7/25