一种益生菌产品及其制备方法和应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种益生菌产品及其制备方法和应用。

背景技术：

1、益生菌是一类能够改善宿主肠内微生物平衡，并对宿主产生正面效益的微生物。然而，口服益生菌不可避免地会受到人体内的胃酸、胆汁及各种消化酶的不良影响，导致益生菌数量不足，无法到达本该发挥作用的肠道部位，从而在很大程度上影响了益生菌的功效，这为进一步改善留下了空间。因此，保护益生菌免受胃肠道攻击，从而将足够的活益生菌靶向递送至肠道中是巩固益生菌治疗药物有效性的关键步骤。

2、为了保护益生菌免受胃肠道攻击，目前常用于保持益生菌活性的方法是在益生菌表面包裹上保护层以防止胃肠道攻击，其被证明是一种直接有效的方法。现有技术中公开了一些益生菌的包埋方法，这些现有技术都不同程度地提高了益生菌的存活率，但上述包裹方式所得的产品均为以非共价且非单菌水平的方式包埋益生菌，所得的保护层结构较为松散，不稳定，存在保护层脱落和胃肠消化液易渗透等风险，并且对单菌的保护效果也不一，故而相应产品的作用效果也较为欠佳。其次公开的一些益生菌的包埋方法中，包埋益生菌所选用的材料大多数本身不具有额外益生作用，甚至存在一定毒副作用，因此如何在保护益生菌的同时，并协同益生菌发挥益生作用，进而提高益生菌产品功效也是未来需要考虑的。

技术实现思路

1、本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种益生菌产品及其制备方法和应用，具体采用以下的技术方案：

2、本发明的第一方面，提供了一种益生菌产品的制备方法，包括以下步骤：

3、s1：将益生菌菌液与具有叠氮基团的物质进行共孵育，重悬，得到表面有叠氮基团修饰的益生菌的重悬液；

4、s2：将表面有叠氮基团修饰的益生菌重悬液与二苯并环辛炔基团修饰的具有益生作用的多糖混合，反应，重悬，得到多糖共价单层包埋益生菌的重悬液；

5、s3：将叠氮基团修饰的具有益生作用的多糖置于所述多糖供价单层包埋益生菌的重悬液中反应，最终得到多糖共价层层包埋的益生菌产品。

6、本发明通过将益生菌与具有叠氮基团的物质进行共孵育，孵育过程中，细菌通过内生合成机制，将叠氮基团修饰的物质作为合成细胞壁或外膜或荚膜多糖等细菌结构中的底物，进而得到叠氮基团修饰的益生菌，然后利用点击化学反应，将表面有叠氮基团修饰的益生菌与二苯并环辛炔基团修饰的具有益生作用的多糖二苯并环辛炔混合反应以使益生菌表面表达的叠氮基团与二苯并环辛炔修饰多糖的二苯并环辛炔基团发生点击化学反应并形成稳定的共价键，从而获得共价连接的第一层保护层，接着加入叠氮基团修饰的具有益生作用的多糖，使得第一层保护层（二苯并环辛炔基团修饰的多糖）上剩余的二苯并环辛炔基团再与叠氮修饰多糖的叠氮基团发生点击化学反应，进而获得共价连接的第二层保护层，最终得到多糖共价层层包埋的益生菌产品。

7、作为进一步优选的实施方式，上述步骤s1中所述益生菌菌液中活菌数为0.5×105cfu/ml-1×107cfu/ml；所述具有叠氮基团的物质的浓度为0.02 mg/ml-1.46 mg/ml；所述益生菌菌液和具有叠氮基团的物质的用量体积比为：1:1-1:100。

8、作为进一步优选的实施方式，上述步骤s2中表面有叠氮基团修饰的益生菌重悬液与二苯并环辛炔基团修饰的多糖用量比为1 ml：0.6 mg-0.8 mg；反应的温度为30℃-38℃；反应的时间为2 h-16 h。

9、作为进一步优选的实施方式，上述步骤s3中多糖供价单层包埋益生菌的重悬液与叠氮基团修饰的多糖用量比为1 ml：0.1 mg-0.6 mg；反应的温度为30℃-38℃；反应的时间为2 h-16 h。

10、作为进一步优选的实施方式，上述益生菌菌液中的益生菌包括乳酸乳球菌、大肠埃希菌nissle1917、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、双歧杆菌、植物乳杆菌、约氏乳杆菌、丁酸梭菌、唾液乳杆菌和脆弱拟杆菌中的至少一种。

11、作为进一步优选的实施方式，上述述具有叠氮基团的物质包括d-丙氨酸叠氮、叠氮甘露糖胺、n-叠氮基乙酰半乳糖胺-四酰化、n-叠氮乙酰半乳糖胺、3-去氧-d-甘露-2-辛酮糖酸叠氮糖和l-叠氮高丙氨酸盐酸盐中的至少一种。

12、作为进一步优选的实施方式，上述具有益生作用的多糖包括β-葡聚糖、岩藻多糖、银线莲多糖、金线莲多糖、低酯果胶、银耳多糖、茯苓多糖、壳聚糖、菊粉、甘草多糖、黄芪多糖、香菇多糖、灵芝多糖和柠檬多糖中的至少一种。上述多糖为有益生作用的多糖，其作为一种天然来源的大分子物质，不仅可作为具有靶向肠道递送的保护性壁材，还可对人体产生有益作用。

13、本发明的第二方面，提供了一种由上述制备方法制备得到的益生菌产品。

14、本发明的第三方面，还提供了上述益生菌产品在制备预防和/或治疗肠道疾病的药物中的应用。更优选地，上述肠道疾病为结肠炎。

15、本发明的有益效果为：

16、（1）本发明提供了一种层层组装的方法，该制备方法过程简单，高效，通过层层组装可给益生菌牢固地“穿上具有不同益生功能性质的外衣”，其通过安全无毒的生物正交反应层层接枝有益生作用的多糖，一方面采用共价层层组装方法接枝上的多糖非常稳定且紧实牢固，不易脱落，具有稳定的保护效果；另一方面接枝在益生菌外层的多糖在上消化道具有良好的稳定性，具有类似盾牌的功效，保护益生菌抵御胃酸、胆盐、uv及冻干等外界环境的伤害，进而可有效提高其存活率；此外，随着有益生作用的多糖在肠道被肠道细菌分泌的酶降解后，产生的功能性物质也可发挥其所具有的益生功能。

17、（2）本发明还提供了一种由上述制备方法制备得到的一种益生菌产品，且根据本发明的实验数据显示，相比同类别的益生菌产品，该益生菌产品具有较佳的抗胃酸和抗胆盐的能力，能够免受胃肠环境攻击，实现肠道靶向递送；并且，该益生菌产品能够降低结肠炎造成的体重减轻的现象，缓解结肠炎造成的脾脏肿大的现象，缓解结肠炎造成的结肠长度缩短的现象，积极改善肠道菌群组成；此外，该益生菌产品还具有较好的抗冻干能力、抗紫外能力、贮藏稳定性，通过在药物中使用上述益生菌产品，可在一定程度上提高或改善肠道疾病的治疗效果，尤其是结肠炎的治疗效果。

技术特征：

1.一种益生菌产品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中所述益生菌菌液中活菌数为0.5×105 cfu/ml-1×107 cfu/ml；所述具有叠氮基团的物质的浓度为0.02 mg/ml-1.46mg/ml；所述益生菌菌液和具有叠氮基团的物质的用量体积比为：1:1-1:100。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中表面有叠氮基团修饰的益生菌重悬液与二苯并环辛炔基团修饰的多糖用量比为1 ml：0.6 mg-0.8 mg；反应的温度为30℃-38℃；反应的时间为2 h-16 h。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s3中多糖供价单层包埋益生菌的重悬液与叠氮基团修饰的多糖用量比为1 ml：0.1 mg-0.6 mg；反应的温度为30℃-38℃；反应的时间为2 h-16 h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述益生菌菌液中的益生菌包括乳酸乳球菌、大肠埃希菌nissle1917、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、双歧杆菌、植物乳杆菌、约氏乳杆菌、丁酸梭菌、唾液乳杆菌和脆弱拟杆菌中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述具有叠氮基团的物质包括d-丙氨酸叠氮、叠氮甘露糖胺、n-叠氮基乙酰半乳糖胺-四酰化、n-叠氮乙酰半乳糖胺、3-去氧-d-甘露-2-辛酮糖酸叠氮糖和l-叠氮高丙氨酸盐酸盐中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述有益生作用的多糖包括β-葡聚糖、岩藻多糖、银线莲多糖、金线莲多糖、低酯果胶、银耳多糖、茯苓多糖、壳聚糖、菊粉、甘草多糖、黄芪多糖、香菇多糖、灵芝多糖和柠檬多糖中的至少一种。

8.一种益生菌产品，其特征在于，由权利要求1-7任一项制备方法制备得到。

9.权利要求8所述的益生菌产品在制备预防和/或治疗肠道疾病的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肠道疾病为结肠炎。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种益生菌产品及其制备方法和应用。该方法将益生菌菌液与具有叠氮基团的物质进行共孵育，重悬，得到表面有叠氮基团修饰的益生菌重悬液；再与二苯并环辛炔基团修饰的多糖反应，得到多糖共价单层包埋益生菌的重悬液；最后再与叠氮基团修饰的多糖反应，最终得到多糖共价层层包埋的益生菌产品。该益生菌产品具有较佳的抗胃酸和抗胆盐的能力，能够免受胃肠环境攻击，实现肠道靶向递送；并且，该益生菌产品能够降低结肠炎造成的体重减轻的现象，缓解结肠炎造成的脾脏肿大的现象，缓解结肠炎造成的结肠长度缩短的现象，积极改善肠道菌群组成，可在一定程度上提高或改善肠道疾病的治疗效果，尤其是结肠炎的治疗效果。

技术研发人员：聂少平,万昊,嵇海华
受保护的技术使用者：南昌大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/2