TRIM21/OTUD4在清除SHBs/HBsAg中的应用

本发明涉及生物，尤其涉及一种trim21/otud4在清除shbs/hbsag中的应用。

背景技术：

1、乙型肝炎病毒(hepatitis b virus，hbv)感染可引起急性、慢性肝炎，并导致肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌。hbv感染是全球重大公共卫生问题，目前，基于干扰素和核苷类似物的直接抗病毒策略无法完全清除患者体内hbv，因此，抗hbv感染药物的发现和开发的目标已从完全清除hbv转向实现慢性乙型肝炎(chronic hepatitis b，chb)的功能性治愈。hbv表面抗原(hepatitis b virus surface antigen,hbsag)是hbv主要致病因子之一，持续高水平的hbsag可导致免疫耗竭，并大大增加chb患者患肝癌风险，清除hbsag视为临床上hbv“功能性治愈”。目前已有多种药物研发靶向清除或阻断hbsag分泌到血清中，包括小干扰rna(ab-729)和反义寡核苷酸(aso)旨在阻碍hbsag的合成或翻译，以及核酸聚合物(nap)和s-抗原转运抑制寡核苷酸聚合物(stops)抑制hbsag分泌。尽管已有多种药物研发靶向清除或阻断hbsag分泌到血清中，但由于持续时间、效果和安全性等问题，目前无法实现完全清除hbsag，仍需研发更多的药物用于清除hbsag。shbs是hbsag中性质最稳定、含量最丰富的部分，占hbsag的70％左右，并且shbs区是lhbs、mhbs及shbs共有区段，shbs的e3泛素连接酶和去泛素化酶也可能是lhbs、mhbs的e3泛素连接酶和去泛素化酶，调控shbs蛋白的e3泛素连接酶和去泛素化酶不仅可调控shbs蛋白水平，也可作用于lhbs、mhbs的蛋白水平。

2、因此，本领域的技术人员致力于开发一种以trim21蛋白和otud4蛋白为靶点的清除shbs/hbsag蛋白的药物及其制备方法。

技术实现思路

1、有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是开发一种以trim21蛋白和otud4蛋白为靶点的清除shbs/hbsag蛋白的药物及其制备方法。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种清除shbs/hbsag蛋白的药物，包括trim21基因的重组质粒和/或otud4小干扰rna，靶点为trim21蛋白和otud4蛋白。

3、进一步地，trim21基因的genbank登录号:nm_003141.4，其核苷酸序列如序列表seq id no：1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如序列表seq id no：2所示。

4、进一步地，otud4基因的genbank登录号:nm_001366057.1，其核苷酸序列如序列表seq id no：3所示，其编码蛋白的氨基酸序列如序列表seq id no：4所示。

5、本发明还提供了一种清除shbs/hbsag蛋白药物的制备方法，包括以下步骤：

6、步骤1、合成trim21基因并克隆到表达载体，获得重组质粒；

7、步骤2、合成otud4基因的小干扰rna；

8、步骤3、将步骤1构建好的重组质粒或步骤2合成的小干扰rna转染至表达shbs蛋白或表达hbv的肝癌细胞中。

9、进一步地，步骤1还包括：从肝癌细胞huh7中提取mrna，反转录并构建cdna文库。

10、进一步地，步骤1还包括：trim21基因的核苷酸序列如seq id no：1所示，根据序列seq id no：1设计合成引物，从cdna文库中合成trim21基因。

11、进一步地，合成引物为包括引物1和引物2；引物1的核苷酸序列为：cggaattcgccaccatggcttcagcagcacgctt；引物2的核苷酸序列为：cccaagcttttacagatcctcttcagagatgagtttctgctcatagtcagtggatc cttgtg。

12、进一步地，还包括扩增trim21基因，扩增反应的条件为96℃5min，(95℃30s，58℃30s，72℃1min)共25cycles，72℃10min。

13、进一步地，步骤2还包括合成小干扰rna的引物对，包括引物otud4 sirna#1和引物otud4 sirna#2，引物otud4 sirna#1的序列为：otud4 sirna#1:5’-ucgagagaacagagagaaatt-3’；引物otud4 sirna#2的序列为:5’-ggguaggacaaguggaaautt-3’。

14、进一步地，步骤3还包括：通过蛋白免疫印迹、酶联免疫吸附试验及实时荧光定量pcr实验检测细胞内shbs/hbsag蛋白表达、分泌到细胞外的hbsag、hbeag及hbv dna表达。

15、进一步地，e3泛素连接酶的激动剂或去泛素化酶的抑制剂可作为治疗疾病相关药物，而本发明发现过表达trim21或敲弱otud4均可降低shbs/hbsag蛋白水平和其他病毒标志物hbeag及hbv dna水平，为清除shbs/hbsag提供了新靶点。

16、在本发明的较佳实施方式1中，详细说明了cdna文库的构建过程；

17、在本发明的另一较佳实施方式2中，详细说明了表达载体的构建、转化宿主、阳性克隆鉴定过程；

18、在本发明的另一较佳实施方式3中，详细说明了设计并合成sirna的过程；

19、在本发明的另一较佳实施方式4中，详细说明了转染宿主及蛋白表达检测过程；

20、在本发明的另一较佳实施方式5中，详细说明了分泌细胞外的蛋白表达检测过程；

21、在本发明的另一较佳实施方式6中，详细说明了分泌细胞外的hbv dna水平检测过程。

22、本发明有益的技术效果如下：

23、本发明解析调控shbs/hbsag蛋白稳定性的e3泛素连接酶trim21和去泛素化酶otud4，为开发清除shbs/hbsag蛋白的药物或干预措施提供理论依据，也为治疗hbv临床功能性治愈提供了潜在的抗病毒新靶点，具体为：

24、构建了重组载体pcdnatm3.1/myc-his(-)a-trim21-myc及otud4 sirna；

25、并过表达trim21或敲弱otud4均可显著抑制肝癌细胞内shbs/hbsag蛋白表达及分泌到细胞外的hbsag、hbeag蛋白表达及hbv dna水平。

26、以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

技术特征：

1.一种清除shbs/hbsag蛋白的药物，其特征在于，所述药物包括trim21基因的重组质粒和otud4小干扰rna，所述药物的靶点为trim21蛋白和otud4蛋白。

2.如权利要求1所述的药物，其特征在于，所述trim21基因的genbank登录号:nm_003141.4，其核苷酸序列如序列表seq id no：1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如序列表seq id no：2所示。

3.如权利要求1所述的药物，其特征在于，所述otud4基因的genbank登录号:nm_001366057.1，其核苷酸序列如序列表seq id no：3所示，其编码蛋白的氨基酸序列如序列表seq id no：4所示。

4.一种如权利要求1所述的药物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤1还包括：从肝癌细胞huh7中提取mrna，反转录并构建cdna文库。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1还包括：trim21基因的核苷酸序列如seq id no：1所示，根据所述序列seq id no：1设计合成引物，从所述cdna文库中合成所述trim21基因。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述合成引物为包括引物1和引物2；所述引物1的核苷酸序列为：cggaattcgccaccatggcttcagcagcacgctt；所述引物2的核苷酸序列为：cccaagcttttacagatcctcttcagagatgagtttctgctcatagtcagtggatc cttgtg。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括扩增trim21基因，扩增反应的条件为96℃5min，(95℃30s，58℃30s，72℃1min)共25cycles，72℃10min。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2还包括合成小干扰rna的引物对，所述引物对包括引物otud4 sirna#1和引物otud4 sirna#2，所述引物otud4 sirna#1的序列为：otud4 sirna#1:5’-ucgagagaacagagagaaatt-3’；所述引物otud4 sirna#2的序列为:5’-ggguaggacaaguggaaau tt-3’。

10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3还包括：通过蛋白免疫印迹、酶联免疫吸附试验及实时荧光定量pcr实验检测细胞内shbs/hbsag蛋白表达、分泌到细胞外的hbsag、hbeag及hbv dna表达。

技术总结
本发明公开了一种清除SHBs/HBsAg蛋白的药物及其制备方法，涉及生物技术领域，该药物包括TRIM21基因的重组质粒和/或OTUD4小干扰RNA；其制备方法为：合成TRIM21基因并克隆到表达载体，获得重组质粒；合成OTUD4基因的小干扰RNA；将构建好的重组质粒或合成的小干扰RNA转染至表达SHBs蛋白或表达HBV的肝癌细胞中。本发明构建了重组载体pcDNATM3.1/myc‑His(‑)A‑TRIM21‑myc及OTUD4siRNA的构建；过表达TRIM21或敲弱OTUD4均可显著抑制肝癌细胞内SHBs/HBsAg蛋白表达及分泌到细胞外的HBsAg、HBeAg蛋白表达及HBV DNA水平。

技术研发人员：林旭,吴淑香
受保护的技术使用者：福建医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/30