本发明属于再生医学，具体涉及一种将富血小板血浆（prp）和骨髓间充质干细胞（bmscs）负载于生物支架的方法。
背景技术：
1、富血小板血浆（prp）是最近发现的一种重要的血小板浓缩物，其中含有大量生长因子，可刺激组织缺损的修复，在口腔科及骨科领域，是一项热门的研究课题（fufa d,shealy b, jacobson m, et al. activation of platelet-rich plasma using solubletype i collagen[j]. journal of oral and maxillofacial surgery, 2008, 66(4):684-690）。当被应用于损伤部位时，prp中含有的pdgf，tgf-β，igf,egf,vegf等生长因子可以促使成纤维细胞dna合成增加，增加胶原蛋白合成和细胞外基质的分泌，提高组织损伤的修复效率（joshi s m, mastrangelo a n, magarian e m, et al. collagen-plateletcomposite enhances biomechanical and histologic healing of the porcineanterior cruciate ligament[j]. the american journal of sports medicine, 2009,37(12): 2401-2410）。
2、但是，将液体形式的prp应用于口腔或前交叉韧带等部位，纤溶酶的存在可能会造成prp的分解和损失。现有的解决方案之一是通过凝血机制完成prp的凝胶化。这种凝胶化目前使用牛凝血酶完成；虽然牛凝血酶是一种有效的血小板激活剂，但是它也会引起针对凝血酶、凝血酶原、v因子和心磷脂的抗体的发展，从而产生临床问题，有可能出现从术后出血或类似狼疮的自身免疫综合征（fleming b c, spindler k p, palmer m p, et al.collagen-platelet composites improve the biomechanical properties of healinganterior cruciate ligament grafts in a porcine model[j]. the american journalof sports medicine, 2009, 37(8): 1554-1563；murray m m, palmer m, abreu e, etal. platelet‐rich plasma alone is not sufficient to enhance suture repair ofthe acl in skeletally immature animals: an in vivo study[j]. journal oforthopaedic research, 2009, 27(5): 639-645；spindler k p, murray m m, carey jl, et al. the use of platelets to affect functional healing of an anteriorcruciate ligament (acl) autograft in a caprine acl reconstruction model[j].journal of orthopaedic research, 2009, 27(5): 631-638）。
3、故基于此，提出本发明的技术方案。
技术实现思路
1、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种将富血小板血浆和骨髓间充质干细胞负载于生物支架的方法，所述方法包括如下步骤：
2、（1）将富血小板血浆（prp）和骨髓间充质干细胞（bmscs）分别与抗凝剂混合，分别得到富血小板血浆-抗凝剂（prp-抗凝剂）混合液和骨髓间充质干细胞-抗凝剂（bmscs-抗凝剂）混合液；
3、（2）将所述富血小板血浆-抗凝剂混合液与所述骨髓间充质干细胞-抗凝剂混合液进行循环混合，得到富血小板血浆-骨髓间充质干细胞混合液（prp-bmscs）；
4、（3）将所述富血小板血浆-骨髓间充质干细胞混合液滴加至胶原生物支架表面或注射至胶原生物支架内部；
5、（4）待所述胶原生物支架被所述富血小板血浆-骨髓间充质干细胞混合液完全浸润后，即得到负载有富血小板血浆和骨髓间充质干细胞的胶原生物支架。
6、优选地，步骤（1）中，所述抗凝剂包括但不限于枸橼酸三钠、肝素、乙二胺四乙酸盐或草酸钠。
7、优选地，步骤（1）中，所述富血小板血浆-抗凝剂混合液中，富血小板血浆与抗凝剂的体积比为5:0.1，所述抗凝剂浓度为1~15wt.%。
8、优选地，步骤（1）中，所述骨髓间充质干细胞-抗凝剂混合液中，骨髓间充质干细胞与抗凝剂的体积比为5:0.1，所述抗凝剂浓度为1~15wt.%。
9、优选地，步骤（2）中，所述循环混合的次数为5~20次。
10、优选地，步骤（2）中，所述循环混合的温度为20~37℃。
11、优选地，步骤（3）中，所述滴加的速率为10~60滴/min。
12、优选地，步骤（3）中，所述注射的速率为0.5~3ml/min。
13、本发明的有益效果为：
14、本发明采用胶原生物支架作为prp的载体，胶原生物支架特有的多孔结构可以吸收大量的prp，并且保护其不受纤溶酶的作用，同时可以负载bmscs，这样便构建出了同时包含生物支架、种子细胞、生物因子三者的修复系统，切实的发挥prp的生物学功能，实现损伤部位的高效修复。
15、另外，本发明所述方法操作简单，仅需注射器和注射器连接管即可完成。且完成prp和bmscs负载的生物支架复合物已经具备了进行组织工程所需的三要素，即生物支架、种子细胞和生物因子，可以直接应用于损伤组织的修复与再生。
1.一种将富血小板血浆和骨髓间充质干细胞负载于生物支架的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述将富血小板血浆和骨髓间充质干细胞负载于生物支架的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述抗凝剂包括枸橼酸三钠、肝素、乙二胺四乙酸盐或草酸钠。
3.根据权利要求1所述将富血小板血浆和骨髓间充质干细胞负载于生物支架的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述富血小板血浆-抗凝剂混合液中，富血小板血浆与抗凝剂的体积比为5:0.1，所述抗凝剂浓度为1~15wt.%。
4.根据权利要求1所述将富血小板血浆和骨髓间充质干细胞负载于生物支架的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述骨髓间充质干细胞-抗凝剂混合液中，骨髓间充质干细胞与抗凝剂的体积比为5:0.1，所述抗凝剂浓度为1~15wt.%。
5.根据权利要求1所述将富血小板血浆和骨髓间充质干细胞负载于生物支架的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述循环混合的次数为5~20次。
6.根据权利要求1所述将富血小板血浆和骨髓间充质干细胞负载于生物支架的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述循环混合的温度为20~37℃。
7.根据权利要求1所述将富血小板血浆和骨髓间充质干细胞负载于生物支架的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述滴加的速率为10~60滴/min。
8.根据权利要求1所述将富血小板血浆和骨髓间充质干细胞负载于生物支架的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述注射的速率为0.5~3ml/min。