一种磁-机械力响应性组织工程气管及制备方法与流程

本发明涉及组织工程领域，具体地说，是一种磁-机械力响应性组织工程气管及制备方法。

背景技术：

1、由各种病理或临床情况引起的气道缺损特别是长段气管缺损目前无法通过气管的端端吻合术治疗。这时，需要合适的气管替代物来实现气道的重建与再生。近年来，组织工程学在气管替代与再生方面显示出巨大潜力并取得了一些了突破性进展。例如，目前可通过细胞种植和体内诱导形成软骨后实现气管缺损的原位修复。软骨组织可提供机械强度防止塌陷，性能良好的气管软管在组织工程气管移植后一方面可可以作为力学支撑以维持气道通畅；另一方面，其不易在气道炎症环境中发生降解，有助于气道上皮及血管等组织结构的再生，进而保证组织工程气管在气道内的长期功能。因此，构建性能近似天然气管的组织工程软骨是实现气道缺损重建与再生的关键。

2、在生理情况下，软骨细胞可以通过一系列机械力学敏感受体和通道来感知其所处微环境的力学特性，并通过激活复杂的下游信号网络影响其合成与分解代谢。例如，在关节软骨中，软骨细胞会对软骨细胞外基质(ecm)的物理性质和在关节载重过程中施加在其的力学作用力做出反应，并调节软骨组织相关生理及病理过程。然而，常见的机械刺激方法如施加压缩、拉伸等方法不易在动物实验中应用且依赖材料表征的微环境力学特性缺乏时空调控，这些都限制了机械力学刺激在组织工程软骨中的应用范围及应用前景。

3、近年来，随着纳米科学与技术的快速发展，磁性纳米粒子因其独特的磁学性质和良好的生物相容性，已被广泛应用于生物医学领域。

4、但是关于一种磁-机械力响应性组织工程气管及制备方法目前还未见报道。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于现有技术中常见的机械刺激方法不易在动物实验中应用且依赖材料表征的微环境力学特性缺乏时空调控，限制了机械力学刺激在组织工程软骨中的应用。本发明将磁性纳米颗粒与软骨细胞相结合，通过3d打印技术，构建一种磁-机械力响应性组织工程气管。磁性纳米材料在与细胞共孵育下，可通过细胞胞吞作用进入胞内，并在外部动态磁场作用下产生机械运动，进而对细胞内结构产生机械力。随后，细胞在遭受皮牛顿级别的外力时，机械敏感通道被激活，调节其相关生理过程。

2、本发明的第一方面，提供一种磁-机械力响应性组织工程气管的制备方法，包括以下步骤：

3、(a)首先，将光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(lap)溶解在pbs溶液中以配置0.25％(w/v)引发剂标准液；随后，将甲基丙烯酰化明胶(gelma)溶于引发剂标准溶液中，水浴加热直至完全溶解，形成10％(w/v)甲基丙烯酰化明胶溶液；待温度降至室温后，软骨细胞悬液以1×108/ml浓度与gelma溶液混合，之后将磁性纳米颗粒以12.5μg/ml的浓度加入上述混合体系中；

4、进一步地，所述的磁性纳米材料为fe3o4纳米颗粒，平均流体动力学直径为200nm左右。

5、更进一步地，所述的磁性纳米颗粒使用前直接置于75％乙醇中浸泡30分钟；使用紫外光照射30分钟以充分灭菌。

6、(b)通过3d生物打印机，在400-408nm紫外光照射下，将上述步骤所制成的混合体系打印为组织工程气管软骨环；多个气管软骨环层层堆叠形成结构近似天然气管的组织工程气管。

7、进一步地，所述的组织工程气管软骨环的内外径根据实验动物ct扫描重建的气管内外径确定。打印机喷嘴移动速度为10mm/s，打印压力为0.18兆帕，温度为25℃，打印参数因打印机型号的不同而有所差别。

8、进一步地，所述的软骨细胞悬液的制备方法包括以下步骤：

9、软骨切碎成1mm×1mm大小，加入15％ⅱ型胶原酶，37℃条件下消化24小时，期间震荡吹打数次，0.22μm无菌滤网过滤，离心、洗涤、细胞重悬、计数，以1.0×104/cm2细胞密度接种到10cm2培养皿中，通过包含血清和抗生素的软骨增殖培养液培养；在37℃，5％co2，饱和湿度条件下培养，第3天首次换液，以后隔日更换新鲜软骨增殖培养液；细胞基本铺满培养皿时，加入胰酶消化液约1.5ml，镜下见细胞胞质回缩、形态变圆后，加入dmem培养液(含血清)终止消化，收集细胞，离心后重悬细胞，随后以1.0×104/cm2细胞密度接种于新的10cm2培养皿，重复上述步骤细胞扩增到第2代时，培养3-5天待细胞铺满培养皿后收集细胞，即得所述的软骨细胞悬液。

10、更进一步地，所述的软骨为兔耳软骨。家兔麻醉或处死后减下兔耳，剥离兔耳皮肤，并剔除软骨组织周围纤维膜得到。

11、本发明的第二方面，提供一种磁-机械力响应性组织工程气管，其采用如上所述的制备方法制备得到。

12、本发明的第三方面，提供一种如上所述的磁-机械力响应性组织工程气管在制备用于气道缺损重建与再生的产品中的应用。

13、本发明的磁-机械力响应性组织工程气管包埋至兔体内后，对实验兔施加磁场进行处理(所述磁感应强度为260mt，频率为1hz，处理时间为20min/d，磁场类型为旋转磁场)。胞吞了磁性纳米颗粒的软骨细胞与体外旋转磁场响应并激活细胞内机械力学信号通路，增强软骨细胞成软骨过程。

14、本发明使用时，将其包埋至气管旁颈部肌肉间进行为期6周的预血管化。在此期间，体外给予旋转磁场(磁感应强度为260mt，频率为1hz，处理时间为20min/d)以实现对胞吞了磁性纳米颗粒的软骨细胞进行磁-机械力刺激，进而促进组织工程气管软骨发育。6周结束后，带血管蒂的组织工程气管可通过与自体气管行端端吻合术实现气管替换。

15、本发明的组织工程气管中，磁性纳米颗粒浓度与使用时外加磁场磁感应强度、频率是影响成软骨过程的关键因素。通过改变不同的磁性纳米颗粒浓度和外加磁场参数，会影响软骨细胞的成软骨过程。为了使组织工程气管的软骨环在结构与功能上更接近天然气管软骨，探索出了上述最佳的磁性纳米颗粒浓度，以及与其配合使用的外界磁场参数。

16、本发明优点在于：

17、本发明将磁性纳米颗粒与软骨细胞相结合，通过3d打印技术，构建一种磁-机械力响应性组织工程气管。磁性纳米材料在与细胞共孵育下，可通过细胞胞吞作用进入胞内，并在外部动态磁场作用下产生机械运动，进而对细胞内结构产生机械力。随后，细胞在遭受皮牛顿级别的外力时，机械敏感通道被激活，调节其相关生理过程。通过对软骨细胞的远程无接触机械刺激，形成了高强度软骨作为组织工程气管的力学骨架。本发明的组织工程气管在磁-机械力学刺激下，软骨的力学性能优于无磁-机械力学刺激的单纯软骨细胞组。

技术特征：

1.一种磁-机械力响应性组织工程气管的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的磁-机械力响应性组织工程气管的制备方法，其特征在于，所述的磁性纳米材料为fe3o4纳米颗粒，平均流体动力学直径为200nm左右；所述的磁性纳米颗粒使用前直接置于75％乙醇中浸泡30分钟；使用紫外光照射30分钟以充分灭菌。

3.根据权利要求1所述的磁-机械力响应性组织工程气管的制备方法，其特征在于，所述的软骨细胞悬液的制备方法包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的磁-机械力响应性组织工程气管的制备方法，其特征在于，所述的软骨为兔耳软骨。

5.一种磁-机械力响应性组织工程气管，其特征在于，采用如权利要求1-4任一所述的制备方法制备得到。

6.一种如权利要求5所述的磁-机械力响应性组织工程气管在制备用于气道缺损重建与再生的产品中的应用。

技术总结
本发明涉及组织工程领域，具体是提供一种磁‑机械力响应性组织工程气管及其制备方法和应用。本发明将磁性纳米颗粒与软骨细胞相结合，通过3D打印技术，构建一种磁‑机械力响应性组织工程气管，通过对软骨细胞的远程无接触机械刺激，形成了高强度软骨作为组织工程气管的力学骨架。本发明的组织工程气管在磁‑机械力学刺激下，软骨的力学性能优于无磁‑机械力学刺激的单纯软骨细胞组。

技术研发人员：陈昶,胡玉龙,汤海,孙维言,李瑛泽,任怡久
受保护的技术使用者：上海市肺科医院（上海市职业病防治院）
技术研发日：
技术公布日：2025/2/13