专利名称:稳定的r-干扰素的配制方法
本发明是关于稳定的冷冻干燥的γ-干扰素的配制方法。依此法配制的γ-干扰素，在水中恢复后，室温下，至少可在24小时内保持清亮及生物活性。
“γ-干扰素”(GIF)一词是指天然干扰素或重组体干扰素，它与人的免疫干扰素具有相类似的生物特性。在本专利公开时，术语γ-干扰素-A或GIF-A代表含有以半胱氨酸-酪氨酸-半胱氨酸开头，以谷氨酰胺结尾的146个氨基酸。另外，已知几种截断的γ-干扰素产物，在下文中对其中每一个都用类似的方法来标明，即，在γ-干扰素(GIF)一词之后加英文大写字母。如GIF-D，代表消除半胱氨酸-酪氨酸-半胱氨酸片段后的产物，它仅含143个氨基酸;又如GIF-B，是指GIF-A在羧基位置被截断后，含有131个氨基酸的片段。所有这些截断产物均可用于本专利。而GIF-A则是在本项发明中优先选用的一种GIF。
据报道，γ-干扰素为一种抗增殖剂，并能增强α-和β-干扰素(即白细胞和成纤维细胞干扰素)的抗病毒及抗增殖效力。还有人提出，γ-干扰素可作为免疫调节剂。
一种已有的干扰素剂量形式的配制方法，是将与其它组分和在一起的干扰素冷冻干燥，以便在使用时用水恢复。由于从文献上得知，γ-干扰素在酸中不稳定(不象α-和β-干扰素那样，在酸性PH条件下是稳定的)，因而通常在中性或微碱性条件下对其进行处理。例如，英国专利申请GB2119313A公开，在PH7.5时，冷冻干燥的配方为每毫升恢复溶液中含7至23毫克毫升γ-干扰素。然而，当γ-干扰素浓度较高时(每毫升中含量高于0.2毫克)，因为立即生成可见的沉淀，这种中性或微碱溶液是不能作为注射用配方的。由于几方面的原因，这些沉淀是不合乎要求的，例如，有使病人患血栓症的潜在危险，有使γ-干扰素的效力丧失的迹象，及堵塞注射器针头的可能性。
而本发明提供了一个生物稳定的冷冻干燥γ-干扰素的配方，包括γ-干扰素和-相应的缓冲剂，其中缓冲剂可维持水恢复液的PH值在4.0到6.0的范围内，最佳为PH4.5-5.0，该溶液的浓度为每毫升含0.001，最好是0.05，到10毫克γ-干扰素。
这种配方令人吃惊地形成了生物及化学稳定的冷冻干燥粉末，该粉末用水恢复时形成清亮的溶液。
因γ-干扰素最好是非肠道施用，故本发明的配方主要供注射用，即，肌肉、静脉及皮下注射。当然，本配方也将适用γ-干扰素的其它方法，其中γ-干扰素需要采取一种更为合适的剂量形式(例如，鼻腔喷雾剂，及象眼药水那样的局部剂量形式)。
有关γ-干扰素的酸不稳定性已有大量文献记载。例如，J.Vilcek等，Journal of Immunological Methods，第69卷(1984年)，61-70页，报道了γ-干扰素在低PH时的不稳定性，他们发现在PH3.5时，分离柱中洗提出了大部分γ-干扰素，但提出组分必须是立即直接收集到中性缓冲介质中。
在低PH条件下，含有或不含如人血清白蛋白那样的酸性蛋白质增溶剂的γ-干扰素溶液，在初期是清亮的，这与中性或微碱性溶液不同，它们是混浊液。在酸性PH下，最终总是要生成沉淀，但增溶剂的加入可大大延缓沉淀的生成。
本发明中的冷冻干燥粉，可在PH4.5时，经长期冷藏后(如一年)仍保持其稳定性，恢复液保持清亮，也就是无沉淀和/或混浊，并在室温或冷藏下至少24小时内具有生物稳定性。由于药粉是在临使用前恢复，因而要使溶液保持清亮以便注射，24小时是足够长的。此外，恢复液在冷冻贮存2星期后，仍可保持清亮及生物稳定性。
在本发明的文字叙述中，“生物稳定”一词是指当用标准方法通过病毒的细胞病变效应(CPE)的延缓来度量时，干扰素配方的生物活性在上述的贮藏期内基本保持不变。另一些不太定量的生物功能，如抗增殖及免疫调节活性，也都显示了同样的稳定性。
本发明的一个突出的优点是，在较低PH下，γ-干扰素更易溶解，因而与以前公布的中性或碱性配方相比，本配方可使γ-干扰素的浓度提高。中性PH下，含量大于0.2毫克γ-干扰素/毫升的溶液将产生沉淀，而在本发明的配方中，清亮的恢复溶液中所含γ-干扰素可高达10毫克/毫升。
本发明的另一个优点是，由于α-和β-干扰素均为酸稳定的酸性蛋白质，酸性PH的配方，就使α-和β-干扰素在同一溶液中与γ-干扰素结合成为可能。
还有一个优点就是可以大大地减少或消除常常做为稳定剂而加到γ-干扰素溶液中的高浓度的盐(如氯化钠)。在本发明的剂量形式的制备中，低盐γ-干扰素溶液的冷冻干燥，可得到较含盐溶液好得多的冷冻干燥粉。并且，这种低盐配方用水再生时，即可得到适用于肌肉注射的等渗溶液。
本发明的冷冻干燥配方中，缓冲剂的加入量，是要能使恢复溶液的PH值保持在4.0-6.0范围内，最佳为4.5-5.0。优先选用的缓冲体系是柠檬酸和磷酸二钠盐，但也可用其它的有机酸缓冲剂，如琥珀酸或酒石酸和/或无机酸缓冲剂，如硼酸或磷酸-钠或多钠盐。
配方中最好含有一个增溶剂，例如人血清白蛋白(HSA)，明胶或酪蛋白。每毫升恢复液中HSA的含量可多至30毫克，以1毫克/毫升为最佳。
如果要加抗氧剂的话，可选用硫氢类的还原剂，如谷胱甘肽，亚硫基二乙酸，二硫苏糖醇和2-巯基乙醇，或抗坏血酸与半胱氨酸或其药用盐的混合物。优选用的抗氧剂是将抗坏血酸与-水合半胱氨酸盐酸结合使用。对于不含可氧化的半胱氨酸的干扰素的同类物(如GIF-D)，则不需用抗氧剂。每毫升恢复液中，抗氧剂的含量最好在0.1到5毫克范围内。
为了制出令人满意的冷冻干燥片，并优化其再溶解过程，可加入一种或多种填充剂，象中性氨基酸(如甘氨酸，丙氨酸)，单糖(如葡萄糖)，二糖(如乳糖)，及多糖醇(如甘露糖醇)，其含量可为0-100毫克/毫升恢复液，而以10-30毫克/毫升为宜。优选用的填充剂是甘氨酸。
另一些赋形剂也可加到配方中，例如螯合剂，象乙二胺四乙酸(EDTA)二钠盐，浓度为0-0.5毫克/毫升恢复液。这完全由技术上熟练的人自行掌握。
上述的增溶，抗氧及填充剂，仅用作本发明的γ-干扰素配方所优选用的添加剂。单独或结合使用这些添加剂中的一种或全部，并不是获得本发明的优越性的必要条件。
本发明的冷冻干燥粉的恢复媒介物包括水，等渗水，葡萄糖溶液，丙烯甘醇和/或聚乙烯甘醇。当恢复液不用作注射液时(例如用作局部或口服液)，则可用其它的药用媒介，如酒精。本发明优选的冷冻干燥粉的恢复媒介物是水。
再一方面，本发明的γ-干扰素酸性本体溶液，具有冷冻-融化稳定性。“本体溶液”一词是指水溶液，其中含1-15，最好是1-10毫克γ-干扰素/毫升和0-5毫克/毫升的一种抗氧剂，如半胱氨酸，该溶液以前未曾用冷冻干燥的γ-干扰素配制过。当最大含量为1毫克GIF/毫升的中性本体溶液经冷冻-融化时，产生大量的沉淀。然而我们惊讶地发现，在溶液的冰点或更低的温度下贮藏(譬如-10℃或更低，通常于-20℃进行稳定性测试)，PH为4.5-5.5最好是PH5时，γ-干扰素的8毫克/毫升本体溶液经融化不产生沉淀。
用于本体溶液的缓冲剂，与上文所述的用于冷冻干燥配方的相同。
例如，这样一种本体溶液(PH5)可有如下组成
成份 浓度毫克/毫升
γ-干扰素 2.0
无水柠檬酸 1.5
无水磷酸二钠盐 1.8
-水合半胱氨酸盐酸 1.0
氢氧化钠0.1N 适量至PH5
用冷冻的酸性本体溶液贮存γ-干扰素有几个优越性。例如，在酸性PH条件下，有可能提高γ-干扰素的浓度，使贮存时溶液的体积减小，因而节省空间;且冷冻是一种较好的液体贮存方法，因为这样可以减少微生物的生长机会。再有，因为丙三醇在运输途中的贮藏温度下可以冻结，所以传统的运输中贮藏γ-干扰素的方法是用中性的50%丙三醇溶液，但这种方法不完全令人满意。因为酸性γ-干扰素的本体溶液可被冻结，就无需在使用前进行耗时费资的分离以除去丙三醇并浓缩溶液，从而简化了后处理。同样，使用酸性本体溶液，就允许去掉曾作为γ-干扰素溶液稳定剂的高浓度的盐，如氯化钠，从而再次简化了配方中使用前的处理过程。
下面的非限制实施例，说明了无菌粉剂的制备，该粉剂用于配制γ-干扰素的可注射溶液。
实施例
成份 浓度(毫升/瓶) 浓度(毫升/瓶)
γ-干扰素＊0.5 1.0
氨基乙酸 20 20
无水柠檬酸 1.5 1.5
无水磷酸二钠盐 1.8 1.8
乙二胺四乙酸二钠盐 0.1 0.1
抗坏血酸 2 2
-水合半胱氨酸盐酸 0.75 0.5
人血清白蛋白 1 1
氢氧化钠0.1N 适量至PH4.5 适量至PH4.5
注射水适量至 1.0毫升 1.0毫升
用标准工艺方法将这些成份混合并冷冻干燥。
＊γ-干扰素多以如前所述的本体溶液的形式提供，上例即如此。
故每份制剂中半胱氨酸盐酸的最终含量为1.0毫克/瓶。
权利要求
1、稳定的冷冻干燥的γ-干扰素配方的配制方法，该γ-干扰素是可恢复的，特征在于，使含有γ-干扰素和相容的缓冲剂的溶液冷冻干燥，该缓冲剂维持恢复液的pH值在4.0至6.0范围内。
2、稳定的冷冻干燥的γ-干扰素配方的配制方法，特征在于，包括下述步骤
1)将γ-干扰素溶解在相容的缓冲溶液中，恢复后缓冲剂维持恢复液的pH值在4.0至6.0范围内，
2)冷冻干燥上述制得的溶液。
3、稳定γ-干扰素的方法，特征在于，包括下述步骤
1)将γ-干扰素溶解在相容的缓冲溶液中，恢复后缓冲剂维持恢复液的pH值在4.0至6.0范围内，
2)冷冻干燥上述制得的溶液。
4、权利要求
1至3中任一权利要求
的方法，其中另外含有一种增溶剂。
5、权利要求
4的方法，其中每毫升恢复液中增溶剂含量可高至30毫克人血清白蛋白。
6、权利要求
1至3中任一权利要求
的方法，其中另外含有一种从硫氢类还原剂，及抗坏血酸与半胱氨酸或其药用盐的混合物中选出的抗氧化剂。
7、权利要求
6的方法，其中抗氧化剂为抗坏血酸与半胱氨酸的混合物。
8、权利要求
1至3中任一权利要求
的方法，其中含有0至100毫克从中性氨基酸、单糖、二糖及多元糖醇中选出的一种或多种填充剂。
9、权利要求
8的方法，其中所述的填充剂为甘氨酸。
10、权利要求
1至3中任一权利要求
的方法，其中另外还含有一种螯合剂。
11、权利要求
10的方法，其中所述的螯合剂为乙二胺四乙酸二钠盐。
12、权利要求
1至3中任一权利要求
的方法，其中缓冲剂包括柠檬酸和磷酸二钠盐。
13、权利要求
12的方法，其中缓冲剂维持恢复液的pH值在4.5至5.0范围内。
14、权利要求
1至3中任一权利要求
的方法，其中γ-干扰素的含量为0.1～2毫克/毫升恢复液。
15、权利要求
14的方法，其中γ-干扰素为γ-干扰素A。
16、权利要求
1至3中任一权利要求
的方法，其中另外含有α-或β-干扰素。
17、权利要求
1至3中任一权利要求
的方法，其中配方包含0.05至10毫克γ-干扰素/毫升恢复液，用以维持pH值在4.0至6.0范围的由柠檬酸和磷酸二钠盐组成的缓冲体系，0至30毫克人血清白蛋白/毫升恢复液，0.1至5毫克抗坏血酸和0.1至5毫克半胱氨酸/毫升恢复液，0至100毫克甘氨酸/毫升恢复液，及0至0.5毫克乙二胺四乙酸二钠盐/毫升恢复液。
18、权利要求
17的方法，其中包含0.1至2毫克γ-干扰素/毫升恢复液，用以维持pH值为4.5的由柠檬酸和磷酸二钠盐组成的缓冲体系，1毫克人血清白蛋白/毫升恢复液，2毫克抗坏血酸和1毫克半胱氨酸/毫升恢复液，20毫克甘氨酸/毫升恢复液，及0.1毫克乙二胺四乙酸二钠盐/毫升恢复液。
19、权利要求
18的方法，其中含1毫克γ-干扰素/毫升恢复液。
20、权利要求
18的方法，其中γ-干扰素是γ-干扰素-A。
21、贮存γ-干扰素的方法，特征在于，在其冰点或更低的温度下贮存溶液，该溶液包含0.001(最好是0.05)至10毫克γ-干扰素，和一种相容的缓冲剂，该缓冲剂可维持溶液的pH值在4.0至6.0范围内。
22、贮存γ-干扰素的方法，特征在于，在其冰点或更低的温度下贮存溶液，该溶液包含1至10毫克γ-干扰素和0至5毫克抗氧化剂1毫升溶液，和一种相容的缓冲剂，该缓冲剂可维持溶液的pH值在4.5至5.5范围内，最佳约为5.0。
23、权利要求
21的方法，其中缓冲剂包含柠檬酸和磷酸二钠盐。
24、权利要求
21至23中任一权利要求
的方法，其中溶液的pH值为5.0。
25、权利要求
21至23中任一权利要求
的方法，其中抗氧化剂是半胱氨酸。
专利摘要
一种稳定的酸性r-干扰素的配方和一种稳定的r-干扰素的冷冻本体溶液。
文档编号A61K38/21GK86101878SQ86101878
公开日1986年10月29日 申请日期1986年3月24日
发明者扎卡里·严, 伊姆蒂亚兹·阿马德·乔德里 申请人:先灵公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan