专利名称：马传染性贫血病琼脂扩散反应冻干抗原的制备方法
技术领域：
本发明系一种用于诊断马传染性贫血病的琼脂扩散反应冻干抗原的制备方法。
目前世界上制备马传染性贫血病琼脂扩散反应抗原的方法有三种第一种方法以美国、日本为代表的细胞培养抗原(日本学者H·Nakajima，T·Sugiura及C·Ushimi)。该法是以组织培养马的胚胎皮肤、肺及肾细胞增殖病毒为原材料，需经多次超速离心(4万rpm2-4小时)及滤过等工艺制备成无色、透明抗原液体。由于没有解决抗原冻干时的保护剂，因此只能制备液体制剂抗原。此法工艺复杂，需用超速离心机，故产品成本较高不适宜我国兽药厂批量生产。另外在抗原液体滤过除色等技术关键，在文献中无详细报道。
第二种方法以古巴为代表的脏器抗原。此法系一种30年代古老传统制备抗原方法，以人工发病马的脾脏作为原材料，经离心、滤过等工艺制备出棕色、粘稠的液体抗原。该法需捕杀病马取脾脏，因此产品成本较高，同时造成环境污染易扩散该病。
第三种方法此法为农牧渔业部发布(兽医生物药品制备规程405页，1984·08·31发布1985·01·01执行)的马传染性贫血病琼脂扩散反应抗原制备方法。该法属于细胞培养抗原，以组织培养驴的胚胎皮肤、肺及肾脏等细胞增殖病毒为原材料，经普通离心机3000-6000rpm离心0.5-1.0小时等工艺制备出黄色或红色粘稠并含有大量细胞碎片的液体抗原，也无冻干产品制剂。
本发明的目的在于提出一种适宜我国兽药厂现有设备，无需超速离心机及特殊滤器，工艺简便、成本较低能够批量生产无色、透明马传染性贫血病琼脂扩散反应冻干抗原的方法。
本发明的特征在于1.消除接毒细胞培养物中的细胞、牛血清及色素是制备无色、透明抗原的技术关键。本法将收获的接毒细胞培养物分为细胞相病毒(在贴瓶壁细胞中而没有释放到培养液中的病毒)和液相病毒(在脱落瓶壁的细胞中或释放到培养液中的病毒)并分别进行处理。细胞相病毒可用3000-6000rpm离心30-60分钟，而液相病毒先进行3000-6000rpm离心30-60分钟，然后将离心沉淀物用同第一次离心量相同经2%醋酸将PH调到5.0的PBS冲洗，冲洗后用离心达到除去牛血清及色素作用。用上述方法可以取代接毒细胞培养物需多次超速离心及滤过制备无色、透明液体抗原的效果。
2.在液体抗原中加1%量的牛血清白蛋白作为冻干保护剂，则可以防止因不加冻干保护剂抗原冻干后引起的抗原效价丧失，从而解决了冻干技术关键。
目前我国兽医研究单位和兽药厂用组织培养方法增殖病毒制备的畜禽琼脂扩散反应抗原，在物理性状上不理想，均呈有色、混浊粘稠的液体。马传染性贫血病琼脂扩散反应抗原也不例外，与国外(美国、日本)制备的同类抗原相比，存在如下缺点抗原液体中含有大量细胞碎片，影响抗原的滴加量及抗原在琼脂中的扩散;抗原液体粘稠，易于粘附在器皿上造成一定量的损失;抗原液体混浊带色，因此在使用时易在抗原孔周围形成一个浊环，从而影响被检血清的判定。
国外(美、日)同类抗原虽无上述缺点，但在制备该抗原或其它畜禽琼脂扩散反应抗原时，均需采用多次超离心(4万rpm、2-4小时)及滤过方法，使抗原呈无色、透明液体。因此，制备抗原时需超速离心机和特殊滤器，工艺复杂不易批量生产。
无论在美国、日本或是按我国现有规程制备的马传染性贫血病琼脂扩散反应抗原均为液体制剂，无冻干产品。因此给该抗原的保存、长途运输和边远地区的使用带来许多困难，同时也易损失效价。
我们研究出制备马传染性贫血病琼脂扩散反应抗原的方法与国外方法相比，在如下两个方面有新的发展1.突破了国内外长期认为用细胞培养增殖病毒作为原材料，只有用超速离心和滤过的方法才能制备出物理性状良好的琼脂扩散反应抗原。用超速离心机离心，每次最大离心量为500ml，每次需离心2-4小时，因此不易进行批量生产。
我们的方法是将接毒的细胞培养物分为细胞相病毒及液相病毒分别进行处理，这样可用一般离心机代替超速离心机，每次离心只需30-60分钟，最大离心量为3000ml，是国外离心量的六倍，另外不用滤过，故易进行批量生产。
2.研究出马传染性贫血病琼脂扩散反应抗原冻干时添加的保护剂及其用量，从而解决了物理性状良好的琼脂扩散反应抗原冻干后效价丧失而只能制备液体抗原的技术关键。用我们方法制备的抗原有如下优点1.我们方法制备的抗原与美国、日本同类抗原在物理性状上一样，均呈无色、透明液体并优于法国(略带粉红色)。
2.我们制备的液体抗原经加保护剂冻干后，在37℃至少可以保存二个月，在20-25℃至少可以保存半年，在0-4℃至少可以保存两年。抗原效价不降低，故可以解决抗原长途运输或边远地区使用的困难。该冻干抗原经稀释后仍呈无色、透明液体。而美国、日本两国抗原是液体制剂，不易长途运输或长期保存。
此外，我国用组织培养方法增殖病毒作为原材料制备的畜禽琼脂扩散反应抗原，如牛白血病琼扩抗原、羊梅地-维士那琼扩抗原、羊兰舌病琼扩抗原以及鸡马立克氏琼扩抗原等均呈有色、混浊粘稠液体抗原。若借鉴我们制备抗原的方法也可能制备出无色、透明琼脂扩散反应抗原。
马传染性贫血病琼脂扩散反应冻干抗原生产流程接毒细胞培养物(100ml培养物)
细胞相病毒液相病毒↓↓加pH7.40.05MPBS30ml用2%醋酸将pH调到5.0↓↓冻融离心3000-6000rpM30-60分钟↓↓用2%醋酸将pH调到5.0沉淀物(最大离心量为3000ml)↓↓离心3000-6000rpM离心3000-6000rpM30-60分钟(最大离心量为3000ml)30-60分钟↓↓沉淀物沉淀物↓适量加pH7.40.05MPBS↓乙醚处理乙醚处理↓除醚↓适量加pH7.40.05MPBS适量加pH7.40.05MPBS↓↓离心3000rpM20-30分钟离心3000rpM20-30分钟
↓按1%量加牛血清白蛋白↓冻干↓冻干抗原国外制备马传染性贫血病琼脂扩散反应抗原工艺流程接毒细胞培养物↓冻融↓用2%醋酸将pH调到5.0↓离心4万rpM2-4小时，最大离心量500ml↓沉淀物↓加适量PBS乙醚处理↓除醚加适量PBS↓离心3000rpM20分钟↓上清↓离心4万rpM2-4小时↓沉淀物↓加适量PBS↓滤过↓无色、透明抗原液体
权利要求
1.一种用于诊断马传染性贫血病的琼脂扩散反应冻干抗原的制备方法，其特征是将接毒细胞培养物分为细胞相病毒及液相病毒并分别进行处理。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是用牛血清白蛋白作为抗原冻干时的保护剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是细胞相病毒直接用3000-6000rpm离心30-60分钟，液相病毒进行上述离心后，将离心沉淀物用同第一次离心量相同经2%醋酸将pH调至5.0的PBS冲洗，冲洗后进行第二次离心，离心时间速度同上。
4.根据权利要求2所述的冻干保护剂，其特征是用量按100ml液体抗原加1g牛血清白蛋白。
全文摘要
本发明系一种用于诊断马传染性贫血病琼脂扩散反应冻干抗原的制备方法。本法将接毒细胞培养物分为细胞相病毒及液相病毒分别进行处理，用一般离心机3000-6000rpM离心30-60分钟，每次离心量最大可达3000ml，制备出无色、透明马传染性贫血病琼脂扩散反应抗原。
文档编号A61K35/76GK1033741SQ8710121
公开日1989年7月12日 申请日期1987年12月30日 优先权日1987年12月30日
发明者董君平, 彭达春, 王振漪, 沈荣显 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所