专利名称:浓缩和分离人尿中的胰蛋白酶抑制剂及胰激肽原酶的方法
本发明是关于以工业规模生产人尿胰蛋白酶抑制剂(此后简写为“HUTI”)和人尿胰激肽原酶(此后简写为“HUKN”)的方法，并通过把尿中所含的HUTI和HUKN同时浓缩来提高产量。
尿胰蛋白酶抑制剂是一种在哺乳动物尿中所含有的酶活性的抑制剂，已知它的特性的变化依赖于提取它时所用动物的品种。〔Carlson，Enzyme，18，176(1974)〕。HUTI是分子量为68000，等电点为pH2-3的一种糖蛋白，特异地抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、血纤维蛋白溶酶〔Sumi，et al.，Journal of Physiol·of Japau，39，53(1977)〕，人弹性蛋白酶〔Johnson et al.，Hoppe Seyler′s Z.Physiol.Chem.，363，1167(1982)〕等，并可被视为一种消炎药而应用。另一方面，胰激肽原酶是一种蛋白溶解酶，它产生于活的动物体的各部位，通过对血清中激肽原的分解，产生激肽素，而显示各种不同的活性，例如降血压和增加血流量的活性。迄今为止，这二种物质由除人以外的不同动物中分离出来，并试图把它们用作药物。特别是目前已经用猪胰和尿作为天然原料生产出胰激肽原酶。然而，对人来说这些是外源蛋白质，具有抗原性，当它们用于临床时，多次使用常发生过敏反应，因此从安全性观点来看已经遇到了问题。与此对比，HUTI和HUKN是人源的蛋白质，因此对人体完全不会产生上述的副作用。
作为HUTI的常规浓缩纯化方法，可能被提到过，例如联合使用三氯醋酸、硫酸铵和甲醇的沉淀方法〔N.R.ShulmanJ.B.C，213，655(1955)〕，采用斑脱土的方法〔T.A.StrupScan.J.Clin.Lab.Invest.，11，181(1959)〕和用DEAE一纤维素的方法〔G.J.ProkschJ.Lab & Clin.Med.，79，491(1972)〕。关于常规浓缩纯化HUKN的方法已知的如用硅胶的方法(已公布的日本专利申请第99151号/1980)和采用微孔型离子交换树脂，象WA-30的方法(已公布日本专利申请第5515号/1975)以及由本发明者建立的用聚氨基葡糖作为吸附剂所组成的浓缩纯化HUKNR的方法(已公布的日本专利申请第6883号/1984)。此外，同时浓缩HUTI和HUKN的方法是Sumi等所知道的用精氨酸-琼脂糖的方法〔Sumi，等Medicine and Biology(“Igaka to Seibutsugaku”)，Vol.100(1)(1980)〕。关于上面所提及的方法，这些方法试图用于HUTI或HUKN单个纯化和制备，但在成本化费和操作方面总不能满意，而同时浓缩两种物质的方法由于需要昂贵的吸附剂，操作过程太复杂以至在工业生产中不能实施。
本发明者根据这样的事实，即在尿中所含的作为有活性的组分的HUTI和HUKN是两性蛋白，想出一个产生气泡的主意，并使这些组分停留在气泡上而实现浓缩。该方法已被用来浓缩尿激酶，即一种尿酶(Celander，DR，Langlinais，R.P.and Guest，M.M;Areh.Biochem.Biophys.，55，286(1955)〕，但从来没有用作浓缩尿胰激肽原酶和尿胰蛋白酶抑制剂的方法。因此，在不同的PH值下产生连串气泡来浓缩尿，而浓缩后的尿对HUTI和HUKN的回收率作比较研究。
在检测尿PH时，下列两个因素需要考虑(1)当PH保持在5.0以下时，HUTI降解成低分子量组分;
(2)HUKN在PH4.0以下时，不稳定。
鉴于上述原因，一份60升尿分成10升一份，用6N-HCl或6N-NaoH调PH为5.0到10.0(不管沉淀在何时分出来，随时被移去)，然后分别装入直径为14厘米，高为100厘米的柱内(在每个柱的下凸缘装有一个孔径为5mm的多孔板);借助于压缩泵，把空气引进柱内，产生小气泡，收集溢流出柱子的气泡，回收浓缩尿约2升，计算HUTI和HUKN的回收率，所得结果见表1。
表1.产率与PH值的关系产率pHHUTI HUKN5 62% 58%6 74% 78%7 85% 88%8 69% 71%9 58% 53%10 40% 38%注PH在8.0以上时，尿产生粘多糖沉淀，沉淀移去后，气泡才有效。
计算回收率以未调PH以前原尿中的HUTI和HUKN的活性为100%。
以上结果表明，当PH值为6.0-8.0时，气泡最为有效，最好是在7.0附近，而完成浓缩的时刻是在浓缩物的体积相当于未处理的原尿液的1/5时，可以用有效方法回收HUTI和HUKN(在此情况下，尿胃蛋白酶不被浓缩，发现其浓度与未处理的尿中一样)。
本发明者进行进一步研究，用此浓缩的尿，通过下面的程序，在各种无机吸附剂、离子交换材料和蛋白凝结剂上通过对HUTI和HUKN的吸附进行纯化程度的比较研究。
用每种上述材料处理浓缩过的尿，(1)2%浓缩过的尿加到每种材料上，(2)PH维持在5.0以上，以防止存在于浓缩尿中的尿胃蛋白酶使HUTI降解成低分子量组分。
经过与上述类似的程序，75升尿被浓缩成15升浓缩尿(由此发现HUTI和HUKN的回收率分别为84%和89%)。浓缩尿分成一升一份，用20克每种材料进行吸附，然后洗脱。洗脱液用水充分透析，测定透析后的洗脱液中HUTI、HUKN和蛋白质的含量。计算它们在浓缩尿中的回收率以及比活性，结果见表2。
表2筛选用于HUTI和HUKN的吸附材料试验产率(%) 比活性＊号 吸附剂 洗脱液 提供者PH HUTI HUKN HUTI HUKN1 高岭土 5.0 2%氨水 4 32 128 6.5 WaKo1)2 斑脱土 5.0 2%氨水 63 3 150 2.3 ″3酸性粘土 ″ ″ 34 28 121 3.1 ″4 硅胶 ″ ″ 0 51 - 9.0 ″5活化氢氧 ″ ″ 5 10 102 3.2 ″化铝6聚氨基葡糖 ″ ″ 71 83 311 8.7 Kyowa2)7Amberlite 7.0 ″ 30 21 77 3.4 Rohm &
XAD-7 Haas8DEAE- ″ 0.1MH3PO451 55 146 4.8 Braun &
纤维素 -0.5MNaCl Co.(W.G.)pH7.59DEAE- ″ ″ 42 60 121 4.3Pharmacia葡聚糖 Japan10QAE- ″ ″ 62 41 159 3.3 ″葡聚糖11精氨酸- ″ 2%氨水 62 60 205 6.6 ″琼脂糖注＊)以单位/毫克(蛋白质)为单位1)日本Wako纯化学工业有限公司2)日本Kyowa油脂工业有限公司根据上述结果，发现能回收HUTI和HUKN同时产率达到60%的吸附剂包括6号的聚氨基葡糖和11号精氨酸-琼脂糖。关于聚氨基葡糖吸附剂，本发明人已经提出申请专利(已公布日本专利第6883/1984)包括它用于吸附HUKN。此外还发现，根据上述结果，把经由通入气泡的浓缩物PH调到5.0和加入聚氨基葡糖的量不低于2%(重量/体积)可以使HUTI和HUKN同时被抽提并提高产量。不过，结果使HUKN的比活性约降低到1/4，反过来这就意味着尿中含有的大量的HUTI同时被吸附到聚氨基葡糖上，然后被洗脱下来。
上述用聚氨基葡糖处理后所得的洗脱液在60℃10小时情况下测定其热稳定性。
图1分别代表HUTI和HUKN在PH2-10及在此PH下60℃加热10小时洗脱液保留的活性曲线。
如图1所示，通过气泡法所浓缩的尿用聚氨基葡糖处理得到的抽提液中HUTI和HUKN只有在PH值为6-8，最好在7.0附近，60℃加热10小时的情况下显示出最大的热稳定性。
在60℃和10小时条件下热处理已被常规地用于人尿激酶制剂的杀灭病毒。
把本发明抽提物进行这样的热处理意味着同时实现HUTI和HUKN的杀灭病毒，这为它们二者的制备过程提供了很大的优越性。
本发明根据上面的发现提出一个方法，它包括使人尿在中性附近PH下气泡化，收集形成的同时浓缩人尿中胰蛋白酶抑制剂和胰激肽原酶的气泡，把浓缩物调整为弱酸性，使弱酸性浓缩物与聚氨基葡糖接触，使二种成分同时吸附到聚氨基葡糖上，随后用氨水溶液从吸附剂上同时洗脱二种成分，中和洗脱液使中性洗脱液在60℃热处理约10小时，如果需要，就从热处理过的洗脱液中分离二种成分。
借助气泡法进行浓缩，需要调节人尿PH值为6.0到8.0，最好是7.0，同时人尿浓缩到浓缩体积为未处理的原尿体积的1/5是可取的。浓缩物与聚氨基葡糖接触前，需调节PH值为4.5到6.5，最合适的5.5。采用聚氨基葡糖的量为每升浓缩物加20-30克，即2-3%(重量/体积)为佳，最好为约25克，即约2.5%(重量/体积)。
浓缩物中的HUTI和HUKN通过与聚氨基葡糖接触，选择性地吸附到聚氨基葡糖上。如果必须，吸附材料可用过滤法收集并用水洗涤。HUTI和HUKN在用2-3N氨水调PH至10.5-12.0时洗脱。
如果需要，所得洗脱液用6NHCl调PH值为6到8，最好是PH7.0，再在60℃热处理10小时，并借助于如抑肽酶-亲和层析和胰蛋白酶-亲和层析这样的亲和层析，把二种成分彼此分离并收集。
根据本发明，HUTI和HUKN可以通过气泡法有效浓缩。聚氨基葡糖是一种能在特定的PH值下，用所得的浓缩尿进行选择性吸附二种成分的吸附剂，而2N到3N氨水用作同时对二种成分解除吸附的洗脱液。在中性附近PH值下60℃热处理。所得的洗脱液10小时起到在制备过程中杀灭病毒的有效作用。这些作用互相协同，使人尿中二种成分以简单的方式得到浓缩和分离。
依据本发明，提供了一个工业生产的方法，使人尿中具有生理活性的物质HUTI和HUKN同时并有效地被浓缩和纯化。在流程中进行60℃约10小时的热处理使浓缩的或纯化的物质除去病毒，这有利于随后制剂的加工。因此，这是一个直接处理大量尿的优良的、经济的方法。
下面叙述的例子为了说明本发明的细节。
实例1取健康的成年男子尿10升，调PH至7.0，加入一个柱，直径为14cm，高为100cm(柱下凸缘装有孔径为5mm的多孔板)，由一压缩泵从底部导入空气，实现气泡化。形成的气泡接收到另一容器内，当液体体积在气泡挤破后达到约2升时，气泡化完成了使尿浓缩。于浓缩物中加入2NHCl调PH至5.0，加入50克聚氨基葡糖，然后搅拌1小时以吸附HUTI和HUKN，过滤收集聚氨基葡糖，并用水洗，然后用2N氨水洗脱二种成分，得到洗脱液150ml。所得的洗脱液用6N-HCl调PH至6.5，然后60℃热处理10小时得148ml处理液。发现液体显示总的HUTI活性为47200抑制单位(回收率为61%)纯度为310抑制单位/mg(蛋白质)，同时总HUKN活性为1245单位(回收率为70%)，纯度为8.2单位/mg(蛋白质)。
实例2取20升健康成年男性的尿调PH为6.5，装入一个直径为20cm，高为100cm并带有类似实例1那样的多孔板，产生气泡。把所产生的气泡收入另一容器内，当收集液约为4升时，气泡法完成产生尿的浓缩物。加入2NHCl到浓缩尿中，调PH至5.5，加入100克聚氨基葡糖，然后搅拌1小时以吸附HUTI和HUKN。过滤收集聚氨基葡糖，用水洗涤。再用3N氨水洗脱吸附的物质。所得的300ml洗脱液用6NHCl调PH至7.0，60℃热处理10小时，得到297ml处理液。测定该液中HUTI活性时，发现总的HUTI活性为95200抑制单位(回收率为60%)，纯度为302抑制单位/mg(蛋白质)，而测定HUKN活性显示它具有总的HUKN活性为2789单位(回收率为72%)、纯度为8.9单位。甚至在5℃(冰箱)贮存一周后，没有观察到二种物质的活性有任何降低。
实例3实例2所得的热处理后的抽提液用0.5MNaCl-0.1MNaHCO3缓冲液PH8.0透析，再通过一个由抑肽酶-琼脂糖(参考注1)组成的柱，(直径为3.0cm，高为15cm)，用同样的缓冲液平衡，连结到胰蛋白酶-琼脂糖柱(注1)上(直径为3.0cm，高为15cm)。抑肽酶-琼脂糖柱用0.1M醋酸缓冲液(PH3.5)含0.5MNaCl洗脱，得41mlHUKN洗脱液。胰蛋白酶-琼脂糖柱用甘氨酸-HCl缓冲液(PH2.6)含0.5MNaCl洗脱，得到48mlHUTI洗脱液。洗脱液显示总HUTI活性为74580抑制单位(回收率为47%)，纯度为11320抑制单位/mg(蛋白质)，完全没有HUKN。HUKN洗脱液显示总HUKN活性为2130单位(回收率为55%)，纯度为825单位/mg(蛋白质)，完全没有HUTI。
实例4通过实施类似实例2所述的处理，得到309ml热处理抽提液，显示总HUTI活性为93100抑制单位(回收率63%)，纯度为311抑制单位/mg(蛋白质)，同时总HUKN活性为2698单位(回收率为73%)，纯度为9.0单位/mg(蛋白质)。抽提液对0.5MNaCl-0.05M磷酸缓冲液pH8.5透析，透析液通过一个抑肽酶-琼脂糖柱和胰蛋白酶-琼脂糖柱，如实例3所述，但是在上述缓冲液充分平衡后才采用提到过的次序。抑肽酶-琼脂糖柱用0.1M醋酸缓冲液(PH3.5)含0.5MNaCl洗脱，得到46mlHuKN洗脱液。胰蛋白酶-琼脂糖柱用甘氨酸-HCl缓冲液(pH2.3)含0.5MNaCl洗脱，得到52mlHUTI洗脱液。HUKN洗脱液显示总HUKN活性为2053单位(回收率为53%)，纯度为831单位/mg(蛋白质)，完全不存在HUTI。HUTI洗脱液显示总HUTI活性为66500抑制单位(回收率为45%)，纯度为1290抑制单位/mg(蛋白质)，完全不存在HUKN。这样得到的HUTI和HUKN洗脱液发现二者甚至在中和和灭菌过滤之后在4℃下再贮存2周，滴定度也没降低。
实例1到4中，HUTI抑制单位是借助于Tanaka等的方法测定的〔Biochimica et Biophysica Acta，705，192(1982)〕;所采用的胰蛋白酶是Sigma公司生产的Ⅰ型牛胰蛋白酶。至少HUKN抑制单位，由本发明者从人尿把纯化抽提到的HUKN，借助于Vasodilator测定法测定抑制单位的〔J.Bio-Chcmistiy，58，201(1965)〕，并用HUKN作标准，HUKN抑制单位用荧光合成底物法测定〔J.Biochemistry，82，1495(1977)〕。
蛋白质的量采用Lowry-Folin法，以牛血清蛋白作标准来测定。
〔注1〕胰蛋白酶-琼脂糖和抑肽酶-琼脂糖的制备胰蛋白酶-琼脂糖和抑肽酶-琼脂糖是由胰蛋白酶Ⅰ型〔Sigma公司，美〕，抑肽酶〔法Choay公司〕和CNBr(溴化氰)活化的琼脂糖4B〔日本Pharmacia〕借助P.Cuatrecasas′法制备的〔J.Biol.Chem.，245，3095(1970)〕。
权利要求
1.在浓缩和分离人尿胰蛋白酶抑制剂和人尿胰激肽原酶的方法中，方法由下列内容组成在中性附近pH中，使人尿气泡化，收集所得气泡同时浓缩人尿中胰蛋白酶抑制剂和胰激肽原酶，把浓缩物调整到弱酸性，使酸性浓缩物与聚氨基葡糖接触，使二种成分同时吸附到聚氨基葡糖上，然后用氨水溶液从吸附剂上同时洗脱二种成分，中和洗脱液，在60℃热处理中性洗脱液10小时，如果需要，从热处理洗脱液中继续分离二种成分。
2.根据权利要求
1中所述的方法，使人尿在PH6.0到8.0中气泡化，最好是PH7。
3.根据权利要求
1所述的方法，浓缩物调PH4.5-6.5，最好为PH5.5，与聚氨基葡糖接触。
4.根据权利要求
1所述的方法，氨水溶液PH为10.5-12.0。
5.根据权利要求
1所述的方法，浓缩物与不低于2%(重量/体积)的聚氨基葡糖接触，最好是2.5%(重量/体积);从吸附剂上进行洗脱所用氨水溶液PH为10.5到12.0。
6.根据权利要求
1所述的方法，洗脱液中和到PH6.0-7.5，最好PH为7，然后在60℃热处理10小时。
7.根据权利要求
1所述的方法，二种成分的分离借助于亲和层析来完成。
专利摘要
人尿中二种成分，胰蛋白酶抑制剂和胰激肽原酶采用使人尿呈中性pH并收集气泡来浓缩。这样得到二种成分的浓缩物，调节浓缩物呈弱酸性，使酸性浓缩物与聚氨基葡糖接触，使二种成分吸附到聚氨基葡糖上，用氨水溶液从吸附剂上洗脱，调成中性并在约60℃下加热10小时以使洗脱液无病毒，然后再从洗脱液中分离二种成分。
文档编号C12N9/88GK86104618SQ86104618
公开日1988年1月13日 申请日期1986年7月2日
发明者幸义和, 中西晃一郎, 平台一, 佐和桂代子 申请人:日本化学研究株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan