专利名称：新的胰岛素化合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及新的胰岛素化合物及其制备方法，还涉及具有长效并且至少含有一种本发明新的胰岛素化合物，需要时还可含有一种速效胰岛素的药物制剂。
自从1922年发现胰岛素以来，已有许多种胰岛素用于治疗糖尿病。在开始时，仅仅使用那种胰岛素活性迅速而又很快终止的胰岛素溶液，但在后来通过引入锌盐和/或鱼精蛋白，降低了胰岛素的溶解度，研制了一种活性很宽的胰岛素制剂。由于生物利用度的原因，所用胰岛素都按传统常规的方法，由家畜的胰腺提取，最常用的家畜是牛，猪和羊。然而近来所用的制剂，含有由生物技术制取的人胰岛素，并且已经见诸于市。
人胰岛素的结构示于式Ⅰ
B链(续)Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr252627282930从某些家畜中得到的胰岛素在结构上非常与人胰岛素相似。狗和猪的胰岛素与人胰岛素的区别仅在B链30位上是Ala，而不是Thr，兔胰岛素的区别则仅在同一位置上是Ser。这些胰岛素按Morihara等(Nature280，1979，412-13)和Marcussen(US-PatentNo.4343898)所述半合成方法，用Thr取代B30-氨基酸残基即可转化为人胰岛素。
含胰岛素的溶液制剂通常都是速效制剂，但在注射后几个小时胰岛素的活性即终止。因此需要频繁地进行注射，一般每天要注射若干次，使糖尿病患者得以维持正常的血糖水平。
为了克服这种缺陷，配制的长效胰岛素制剂应使胰岛素活性保持几个小时，以至24小时，甚至更长时间。使用这种长效制剂，一些糖尿病患者每天仅需要少量注射，例如24小时内注射1次或2次。
将胰岛素转化为略可溶解的盐，例如锌胰岛素或鱼精蛋白胰岛素，即可获得上述长效胰岛素。所用的这种略可溶解的胰岛素盐是一种悬浮液，经皮下或肌肉注射后，从中逐渐释放出胰岛素。
最近采用了其他一些方法获得了长效胰岛素，其中一例则是将胰岛素结晶包在聚合血清清蛋白中。另一个例子则是连续作用的胰岛素装置，即所谓的胰岛素泵，然而这可能会使患者感到不适和带来危险。
欧洲专利公报No.EP-132770，EP-132769和EP-135720的说明书公开了胰岛素衍生物的制备和用途，这种衍生物中，B链的C端由至少带1个正电荷(尤以Arg-OH或Arg-Arg-OH为佳)使有机基团延长。含有这种胰岛素衍生物悬浮液制剂具有长效作用。然而这种胰岛素化合物并不非常适用于配制新的有用的长效胰岛素制剂，因已发现，这种长效非常有限(J/Markussenetal.，ProteinEngineering，1，205-213，1987)。
B链的N端由二肽Arg-Arg延长的胰岛素衍生物的性质已由R.Geige&F.Enzmann作过介绍(ProceedingsoftheSymposiumonProinsulin，InsulinandC-peptide，Tokushima，1978;Excerpta，Medica，Amsterdam，1979，p.306-310)。已经发现，按等电点为基础的这种胰岛素化合物的溶解度高于一般的胰岛素。
为了改进胰岛素在治疗糖尿病中的活性构形，可以将取代基引入胰岛素分子。欧洲专利公报No.EP-194864公开了例如用Gln一次或多次取代Glu和/或用与以酯或酰胺形式的C端羧基的封阻相结合的Arg取代ThrB27，以注射后缓慢释放的方式，使胰岛素沉淀区移位。
使用这种含内氨基酸取代基的胰岛素化合物的制剂长期治疗糖尿病，意味着会给患者带来激活免疫系统的严重威胁，导致胰岛素抗体进入血液。
为了获得长效胰岛素，以便取代传统的胰岛素制剂，最近几年来人们已经尽了努力。其起因是由于糖尿病专家们发现，传统的长效胰岛素制剂作用时间太短，在使用人胰岛素时更是如此，而且使用所谓的胰岛素笔(insulinpen)，已被认为是一种溶解的长效胰岛素。
本发明的目在于提供一种新的具有长效和尽可能低抗原性的胰岛素类似物。
现已令人惊奇地发现。通式Ⅱ的胰岛素化合物具有理想的长期的胰岛素药效和/或抗原性，
B链(续)Phe-Tyr-T-Pro-Lys-X-Y252627282930式中E各表示Glu或能由核苷酸顺序编码的天然氨基酸残基，N表示能由核苷酸顺序编码的氨基酸残基，T表示Thr或Arg，X表示Thr，Ser，Ala或OH，Y表示OR或NR1R2，其中R，R1和R2各表示氢或低级烷基，但当X表示OH时Y不存在。
因此，本发明涉及具有通式Ⅱ的胰岛素化合物
B链(续)Phe-Tyr-T-Pro-Lys-X-Y252627282930式中E各表示Glu或能由核苷酸顺序编码的天然氨基酸残基，N表示能由核苷酸顺序编码的氨基酸残基，T表示Thr或Arg，X表示Thr，Ser，Ala或OH，Y表示OR或NR1R2，其中R，R1和R2各表示氢或低级烷基，但当X表示OH时Y不存在。
本文中所述“低级烷基”意指包括1-6个碳原子的直链或支链烷基。
本发明具体涉及式Ⅱ的胰岛素化合物，其中E各表示Glu或Gln，N表示Asn，Asp，Ser或Gly，T表示Thr或Arg，X表示Thr和Y表示NH2。
本发明更涉及式Ⅱ的胰岛素化合物，其中当Y表示OH时，E，N和T中至少有1个表示不同于人胰岛素相应残基的氨基酸残基。
本发明特别涉及式Ⅱ的胰岛素化合物，其中E均表示Glu，N表示Asn，T和X均表示Thr，Y表示NH2。
本发明特别涉及式Ⅱ的胰岛素化合物，其中E均表示Glu，N表示Ser，R和X均表示Thr，Y表示NH2。
本发明特别涉及式Ⅱ的胰岛素化合物，其中在B13位上的E表示Gln，其余的E均表示Glu，N表示Asn，T和X均表示Thr，Y表示NH2。
本发明特别涉及式Ⅱ的胰岛素化合物，其中A4位上的E表示Gln，其余的E均表示Glu，N表示Asp，T和X均表示Thr，Y表示NH2。
本发明特别涉及式Ⅱ的胰岛素化合物，其中E均表示Glu，N表示Asn，T表示Arg，X表示OH。
本发明还涉及制备式Ⅱ胰岛素化合物的方法，该方法是将通式Ⅲ的胰岛素前体通过转肽作用或由对赖氨酸残基的羧端裂解具有唯一特异性的肽链内切酶进行裂解。通式Ⅲ如下
式中E，N和T的含意如上所述，(AA)n表示具有C端残基为Lys和n氨基酸残基的肽链，或n＝0时表示肽键，Z表示氢或具有C端残基为Lys的任意长度的肽链。
本发明还涉及胰岛素制剂，其至少含有一种式Ⅱ胰岛素化合物，还可任意含有速效胰岛素，例如人胰岛素、家畜胰岛素，或其衍生物或类似物。这类制剂可以是一种待用溶液或可在使用前用无菌水配制的冷冻干燥制剂。
本发明胰岛素制剂的一个具有特殊优点的例子是一种肠胃施用的长效制剂，含有至少一种本发明的胰岛素化合物的水溶液，与血清等渗压，pH2-5.5，可任意含有缓冲液和/或防腐剂，如果需要，还可含速效胰岛素。
本发明胰岛素化合物由于对人胰岛素分子略为作了改变，且均为人体所常见，或已经过了几年的试验，都未发现引起免疫反应，因此可以满足糖尿病专家们的要求。本发明胰岛素化合物的主要特征在于它们能如人胰岛素那样描述，其中精氨酸残基与N端和A链连接，而其B链的C端羧基以酰胺形式封阻。人们总是把胰岛素化合物溶解于弱酸溶液中来使用，而在这些条件下，21位上的天冬酰胺残基能够在制剂贮存期内产生明显脱酰氨基作用，从而减弱长效作用。通过用谷氨酰胺取代1个或可能2个谷氨酸残基，则这种影响就能被控制。
在胰岛素依赖糖尿病的治疗中，常用治疗量为每天注射2次长效胰岛素制剂，即早餐和晚上睡前各1次，以保持基本的胰岛素水平。另外，在主餐前再注射3次速效胰岛素制剂。这种治疗的缺点在于第二次注射长效胰岛素制剂可导致夜间低血糖危险。这种危险通过饭前注射长效和速效胰岛素混合制剂可予以避免，即使在晚间会发生低血糖反应，则吃些小吃也就能克服。但是这种治疗方法往往会在早晨引起高血糖，如广泛使用的长效胰岛素制剂“迟缓胰岛素”(Insulatard )和“单缓胰岛素”(Monotard )没有足够长的作用时间。因此，需要为糖尿病患者提供作用时间长于目前一般所使用的制剂的胰岛素制剂，尤其是提供一种注射1次能够作用一天甚至几天的制剂。按本发明制备的胰岛素制剂，比一般所用的长效胰岛素制剂“单缓胰岛素”具有更长的胰岛素作用时间。
本发明较佳的胰岛素化合物用作溶液制剂时具有特殊的优点，因其在pH约5左右时(在此pH值时，脱酰氨显著较低)，溶解度较高，甚至在皮下注射后，仍具有长效作用。
本发明特别涉及下列具体的化合物〔ArgAO〕-人胰岛素(B30-酰胺)，〔ArgAO，GlnB13〕-人胰岛素-(B30-酰胺)，〔ArgAO，GlnA4，AspA21〕-人胰岛素-(B30-酰胺)，〔ArgAO，SerA21〕-人胰岛素-(B30-酰胺)，〔ArgAO，ArgB27〕-脱〔ThrB30〕-人胰岛素。
本发明的胰岛素化合物可采用化学合成方法，从在其他胰岛素分子A链的N端上引入另一个精氨酸残基进行制备，但困难很大。一个更吸引人的方法就是单链前体的酶催化转化，例如天然胰岛素原或前胰岛素原或生物合成制备的通式Ⅲ的前体
式中E，N和T的含意如式Ⅱ所述，(AA)n表示具有n氨基酸残基并且C端残基为Lys的肽链，但当n＝0时则表示肽键;
Z表示氢或C端残基为Lys的任意长度的肽链。
用于酶转化的酶应是能在赖氨酸残基羧端上裂解肽链的类似胰蛋白酶的肽链内切酶。胰蛋白酶本身经常可以使用，但是对赖氨酸具有专一性的肽链内切酶则特别有利，例如由溶菌酶原(Lysobucterenzymog-enes)(BoehringerMannheim)得到的蛋白内切酶Lys-C或由裂解无色杆菌(Achromobacterlyticus)(WakoPureChemicalIndustries，Ltd.)得到的赖氨酸肽链内切酶。
反应可以按类似于欧洲专利公报EP-163529所述条件，通过用苏氨酸酰胺的转肽作用完成，由此直接产生B30酰胺;但是也能采用两步反应完成，开始用酶解离，生成脱(ThrB30)化合物，再经Morihara等(同上)所述偶合反应，转化为B30-酰胺。
本发明胰岛素化合物的前体可通过生物合成方法，在表达编码前体的DNA顺序的酵母宿主产生。
为了分泌到生长培养基中，可将编码胰岛素前体的DNA顺序融合到另一个编码酵母中的信号肽功能的DNA顺序中。通过插入到酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)MFα1-前导顺序即可分泌(Kurjan&Herskowitz，Cell，30，933-943，1982)。在较佳的构建中，采用编码包括二基部位LysArg的整个MFα1-前导顺序的DNA顺序，但不包括用作酵母蛋白酶DPAP(二肽氨基肽酶)底物的肽顺序GluAlaGluAla。这样就能获得具有校正N端的胰岛素前体的有效分泌。
编码修饰胰岛素前体的DNA顺序是通过在表达盒上离体诱变进行构建的，该表达盒包含在表达质粒pYGABA的BamHI限制性片段中(如
图1所示)。质粒在酵母中含有选择标记物和复制信号功能和具有1103bp的长度。按Bitter和Egan所述，BamHI片段含有包括-389至-1位的启动子顺序的GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氨酶)下游区(Gene，32，1984，263-274)，并将其加到下游区BamHI连接子的5′端，将该启动子顺序直接融合到如Kurjan和Herskowitz所述的编码MFα1-前导顺序的85N-端氨基酸的顺序。MFα1-前导顺序直接与胰岛素前体单链脱〔ThrB30〕L胰岛素(SCT)的编码顺序融合，它是人工合成的构建基因，具有下列顺序TTCGTTAACCAACACTTGTGTGGTTCTCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGT-AAGCAATTGGTTGTGAACACACCAAGAGTGAACCAACTTCGAAACATGAACCAAACACCA-PheValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyrLeuValCysGly-GAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGGGTATTGTTGAACAATGTTGTACTTCTATTTGT-CTTTCTCCAAAGAAGATGTGAGGTTTCCCATAACAACTTGTTACAACATGAAGATAAACA-GluArgGlyPhePheTyrThrProLysGlyIleValGluGlnCysCysThrSerIleCys-SalITCTTTGTACCAATTGGAAAACTACTGTAACTAATAGCGTCGAGAAACATGGTTAACCTTTTGATGACATTGATTATCGCAGCAGCTSerLeuTyrGlnLeuGluAsnTyrCysAsn终点终点如上所述，胰岛素前体基因的转译末端具有2个终止密码子，其后紧接着SalI限制位点。如欧洲专利公报No.0116201Al所述，终此区与SalI-BamHI限制片段相同。顺序的构建完全采用常规技术。
所用诱变方法系Zoller和Smith所述的“寡核苷酸控制诱变”法(DNA，Vol.3，NO.6，479-488，1984)。该方法将在下面作扼要说明并在实施例1中给予更详尽地介绍。将由表达质粒中分离得到的胰岛素前体顺序插入到单链环状M13噬菌体载体中。将化学合成的互补DNA链与单链基团组对合。DNA链含有所需顺序，其外层是与环状DNA的胰岛素顺序完全相同的顺序。然后以生物化学上所用的克列诺夫聚合酶将引物加到全长的环状基团组上。这个双链就形成单链的噬菌体，当其在大肠杆菌中生长时，就有可能得到具有所需顺序的隔离双链DNA。由该双链DNA中可分离到限制片段，然后再将该片段插入到表达载体中。
下面参考附图将更详细地说明本发明。
图1表示表达质粒pYGABA14276，图2表示酵母载体pAB24，图3表示皮下贮存的胰岛素的吸收。
以下的实施例将进一步说明本发明。
实施例Ⅰ可用于表达前体B(1-29)-AKR-A(1-21)的表达质粒的构建表达质粒pYGABA(图1)的BamHI限制性片段上表达合的分离将表达质粒与核酸内切限制酶BamHI一起温育。条件20μg质粒，50单位BamHI，100mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2和1mM DTT，配制成100μl。温度37℃，反应时间2小时。在1%琼脂糖凝胶上将2个DNA片段进行分离，得到所需要的片段。
M13载体M13mp18的连接将分离得到的限制性片段连接噬菌体载体M13mp18，并在下列反应混合物中用核酸内切限制酶BamHI切断0.2μg片段，0.02μg载体，50mMTris-HCl，pH7.4，10mMMgCl，10mMDTT和1mMATP，配制成20μl。将5μl该混合物移到大肠杆菌JM101中。片段在载体中的存在及其取向借助由转化株分离得到双连M13-DNA的限制酶图予以测定。
单链(ss)DNA(模板)的分离按Messing所述方法(Gene，19，269-272，1982)，从上述转化株分离出ss-DNA。
诱变引物的5′磷酸化具有顺序5′-CAACAA TACCTCTCTTAGCCTTTGGAGTG-3′的诱变引物，其5′端的磷酸化是在含有70mM Tris-HCl，pH7.0，10mM MgCl2，5mM DTT，1mM ATP，100pmol寡核苷酸和3.6单位的T4多核苷酸激酶的30μl反应混合物中进行的。在37℃下反应30分钟，然后在65℃下将混合物温育10分钟使酶失活。
模板与磷酸化的诱变引物的对合模板和引物在10μl含有0.5pmol模板，5pmol引物，20mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，50mM NaCl和1mM DTT中，先在65℃下加温10分钟，然后冷却至0℃进行对合。
扩大/连接反应在所述制备的反应混合物中，加入10μl下述混合物0.3mM dATP，0.3mM dCTP，0.3mM dGTP，0.3mM TTP，1mM ATP，20mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，10mM DTT，3单位T4 DNA连接酶和2.5单位克列诺夫聚合酶。反应在16℃下进行16小时。
JM101的转化用常规技术将上述反应混合物以不同的稀释度移入经CaCl2处理过的大肠杆菌JM101细胞中，并以2×YT topagar涂在2×YT琼脂平板上(2×YT＝16克胰蛋白酶胨/升，酵母膏10g/l，NaCl5g/l。2×YT topagar＝2×YT和0.4%琼脂糖，并经高压灭菌。2×YT琼脂板＝2×YT和2%琼脂，并经高压灭菌)。琼脂板在37℃下温育过夜。
正克隆的鉴定采用空斑杂交的方法，即将硝化纤维素过滤器置于载有适当密度的噬菌体的平板上，使滤纸湿润。然后将滤纸放在下述溶液中浸润处理在1.5MNaCl，0.5MNaOH中30秒钟;在1.5MNaCl，0.5MTris-HCl，pH8.0中1分钟，在2×SSC(0.3MNaCl，0.03M柠檬酸钠)中浸至以后使用。过滤器在3MM滤纸上干燥，并在80℃真空炉中烘2小时。
具有顺序5′-CAACAATACCTCTCTTAGCCTTTGGAGTG-3′的诱变引物，其5′端用放射性标记，所用30μl放射性标记物中含有70mMTris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，5mM DTT，10pmol寡核苷酸，20pmolγ32-P-ATP和3.5单位的T4多核苷酸激酶。混合物在37℃下温育30分钟，然后在100℃下保持5分钟。
干燥滤纸在65℃下，于6×SSC，0.2%牛血清白蛋白，0.2%聚蔗糖，0.2%聚乙烯吡咯烷酮，0.2%十二烷基硫酸钠(SDS)和50μg/ml鲑鱼精子DNA预杂交2小时。然后将含有标记试样的反应混合物加到15ml新鲜的预杂交混合物，滤纸在40℃和缓和摇动下浸泡过夜。杂交后，滤纸在2×SSC+0.1%SDS中洗涤3次，每次15分钟，然后进行放射自显影。又在62℃相同溶液中洗涤后，再次进行放射自显影，证明含DNA顺序的空斑已经互补。
正克隆的再筛选由于所鉴定的克隆是异源双链的结果，所以再次将空斑涂在平板上，重复杂交和鉴定。
双链M13噬菌体DNA的纯化将经过重复筛选的克隆用于感染大肠杆菌JM101。含有大约108空斑和5个JM101菌落的培养物在37℃下于5ml 2×YT培养基中培养5小时，然后按Birnboim和Doly所述方法(Nucleic Acids Res.，2，1513，1979)由碎片中纯化得到双链环状DNA。
含修饰胰岛素前体的限制性片段的分离在37℃下将大约5μg上述分离到的DNA制剂用10单位核酸内切限制酶BamHI于60μl 100mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2和1mM DTT中消化2小时。在琼脂糖凝胶上分离DNA产物，从凝胶中纯化得到片段。
酵母载体pAB24的连接(图2)将分离到的限制性片段在含有片段0.2μg，载体0.02μg 50mM Tris-HCl，pH7.4，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP(总体积为20μl)的反应混合物中，连接到经核酸内切限制酶BamHI消化过的酵母载体pAB24上。将5μl该反应混合物用于转化大肠杆菌MC1061，鉴定其中修饰过的表达质粒。该质粒命名为pYGAB-AKR-A，除了所加密码子外，与pYGABA相同。
酵母的转化按Ito等所述方法(J.Bact.Vol.153，No.1，163-168，1983)，将表达质粒转移到酿酒酵母JC482∧pep∧Leu2cir°(α，his4，pep4，ura3，leu2，cir°)中。再将转化细胞置于SC-ura培养基(0.7%酵母氮碱，2.0%葡萄糖，0.5%酪蛋白氨基酸，2.0%琼脂)上，选择含质粒的细胞。
实施例Ⅱ可用于产生前体B(1-29)-Gly-Ser-Lys-Arg-A(1-21)的表达质粒的构建使用方法基本上与实施例1相同，不同之处在于诱变引物的顺序为5′CAACAATACCTCTCTTAGAACCCTTTGGAGTG-3′，杂交温度42℃，杂交后的洗涤温度64℃。修饰过的质粒的顺序除了加有密码子外，与pYGABA的顺序相同。
实施例Ⅲ可用于产生前体〔GlnB13〕-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21)的表达质粒的构建采用的方法基本上与实施例1相同，不同之处在于所用模板是克隆M13中pYGAB-AKR-A的BamHI合得到的，诱变引物的顺序为5′-GTACAAAGCTTGAACCAAGTG-3′，杂交温度31℃，杂交后的洗涤温度53℃。修饰质粒的顺序除了交替和所加的密码子外，与pYGABA的顺序相同。
实施例Ⅳ可用于产生前体〔GlnA4，ASPA21〕-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21)的表达质粒的构建采用的方法基本上与实施例1相同，不同之处在于所用模板是克隆M13中pYGAB-AKR-A的BamHI合得到的，而且用两步法诱变。第一步中的引物是5′-ACAACATTGTTGAACAATACC-3′，杂交温度27℃，杂交后的洗涤温度49℃;第二步中的引物是5′-CGCTATTAGTCAGTACTTT-3′，杂交温度29℃，杂交后的洗涤温度51℃。修饰质粒的顺序除了交替和所加密码子外，与pYGABA的顺序相同。
实施例Ⅴ可用于产生前体〔SerA21〕-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21)的表达质粒的构建采用的方法基本上与实施例1相同，不同之处在于所用模板是克隆M13中pYGAB-AKR-A的BamHI合得到的，诱变引物的顺序为5′-GACGCTATTAAGTACAGTAGT-3′，杂交温度29℃，杂交后的洗涤温度51℃。修饰质粒的顺序除了交替和所加密码子外，与pYGABA的顺序相同。
实施例Ⅵ可用于产生前体〔ArgB27〕-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A-(1-21)的表达质粒的构建采用的方法基本与实施例1相同，不同之处在于所用模板是克隆M13中pYGAB-AKR-A的BamHI合得到的，诱变引物的顺序为5′-CAACAATACCTCTCTTAGCCTTTGGTCTGTAGAAGA-3′，杂交温度43℃，杂交后的洗涤温度65℃。修饰质粒的顺序除了交替和所加密码了外，与pYGABA的顺序相同。
实施例Ⅶ前体的表达和由培养基中进行分离将如实施例Ⅰ-Ⅵ所述转化的酵母，在30℃下，在含基本培养基(无尿嘧啶)的陪替氏平板上繁殖48小时。从该陪替氏平板中取出单个菌落接种到含有基本培养基(无尿嘧啶)+酪蛋白氨基酸5g/l+琥珀酸10g/l+葡萄糖30g/l的100ml摇瓶中，pH5.0。将摇瓶在30℃下和培养箱中摇动培养72小时。
离心后，将1升沉淀过的上清液经过滤灭菌，加入5M HCl和水将pH调至4-4.5，导电率为＜10mS。先用50mM乙酸和用NaOH将pH调至4.0的50%(体积)乙醇平衡1.6×6cm的S-Sepharose FF层析柱，然后以120毫升/小时的流速流经该层析柱，用60ml缓冲液洗涤该柱，0-0.35M线性梯度的360ml NaCl缓冲溶液洗脱前体，流速为10毫升/小时。洗脱液分成4ml等份，进行紫外光吸收率测定。含有前体的馏份经RP-HPLC分析鉴定和沉淀，用1M乙酸在Sephadex G25柱上脱盐后，经冷冻干燥分离得到前体。
实施例Ⅷ由前体B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21)制备〔ArgAO〕-脱〔ThrB30〕-人胰岛素在4℃下，将按实施例Ⅰ和Ⅶ的方法制备的B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21)250mg溶解于25ml 50mM tris-(羟基甲基)氨基甲烷和用盐酸将pH调至10的20%(体积)乙醇中。含有0.8mg固相胰蛋白酶/ml的Sepharose
用相同的缓冲液在玻璃漏斗上洗涤和排液。将缓冲液加到40g排液的凝胶上，将体积调至75ml。将含有前体的溶液加到悬浮液中，混合物在4℃下，缓和搅拌1小时后过滤。
HPLC分析证明61%转化为〔ArgAO〕-脱-〔ThrB30〕-人胰岛素。
用50ml缓冲液(不含乙醇)洗涤凝胶并排液，将沉淀的过滤液的pH调至6后，使其中的蛋白质沉淀。通过离心和冷冻干燥分离沉淀物。
将4℃下，将沉淀物溶解于pH调至8.1的20ml 7M尿素中，并将溶液装在1.6×20cm的Q-Sepharose
FF层析柱上，层析柱事先在4℃下用20mM tris-(羟基甲基)氨基甲烷和用HCl将pH调至8.1的7M尿素进行平衡。以0mM至50mM线性梯度的NaCl缓冲液(缓冲液与上相同)和按40毫升/小时的流速，洗脱层析柱24小时。洗脱液用紫外光吸收进行检测，收集2个主峰的第一次洗脱液。沉淀物用1M乙酸在Sephadex
G25柱上脱盐后，冷冻干燥，得到75mg〔ArgAO〕-脱〔ThrB30〕-人胰岛素。
产物的鉴定经氨基酸分析，等离子体吸收质谱以及分开的乙烯吡啶基化的A链和B链的Edman顺序降解方法得到证实。
实施例Ⅸ由前体B(1-29)-Gly-Ser-Lys-Arg-A(1-21)制备〔ArgAO〕-脱〔ThrB30〕-人胰岛素将按实施例Ⅱ和Ⅶ的方法制备的B(1-29)-Gly-Ser-Lys-Arg-A(1-21)400mg溶解于50ml的50mM tris-(羟基甲基)-氨基甲烷和用HCl将pH调至10的20%(体积)乙醇中。含有0.8g固相胰蛋白酶/ml的Sepharose 用相同缓冲液在玻璃漏斗上洗涤并排液，将缓冲液加到排去液体的80g凝胶中，体积调至150ml。将含前体的溶液加到悬浮液上，混合物在20℃下缓和搅拌30分钟后过滤。
HPLC分析证明，50%转化为〔ArgAC〕-脱〔ThrB30〕-人胰岛素。
凝胶用100ml缓冲液(不含乙醇)洗涤并排液，将pH调至6沉淀出沉淀滤液中的蛋白质，经离心和冷冻干燥分离沉淀物。
在4℃下通过pH调至8.1，将沉淀物溶解在20ml 7M尿素中，再将该溶液装在1.6×20cm的Q-Sepharose FF层析柱上，层析柱事先在4℃下用20mM tris-(羟基甲基)氨基甲烷和经HCl将pH调至8.1的7M尿素平衡。用0mM至50mM线性梯度的NaCl缓冲液(用相同的缓冲液)以40毫升/小时流速洗脱层析柱24小时。洗脱液经紫外光吸收检测，收集两个主峰的第一洗脱液。沉淀物在Sephadex G25柱上用1M乙酸脱盐后冷冻干燥。得到145mg的〔ArgAO〕-脱〔ThrB30〕-人胰岛素。
产物的鉴定经用氨基酸分析，HPLC分析和Edman顺序降解等方法得到证实。
实施例Ⅹ由猪胰岛素原制备〔ArgAO〕-脱〔ThrB30〕-人胰岛素40mg猪胰岛素原溶解于800μl0.1MHCl中，加入8ml50mMtris-(羟基甲基)氨基甲烷。制备1单位由溶菌酶原(Lysobacterenzym-ogenes)(BoehringerMannheim)得到的蛋白内切酶Lys-C于用HCl将pH调至8.5的200μl0.1Mtris-(羟基甲基)氨基甲烷的溶液中。将2个溶液混合并在12℃下放置16小时。
通过加1.8ml96%乙醇后将pH调至6.2终止反应，生成的悬浮液在4℃下放置过夜。将离心分离到的沉淀物再在4℃下溶解于pH调至8.1的2ml 7M尿素中。将该溶液装在1.6×20cm Q-Sepharose
FF层析柱上，该层析柱事先用20mM tris-(羟基甲基)氨基甲烷和用HCl将pH调至8.1的7M尿素。用0mM至50mM线性梯度的NaCl缓冲溶液(相同的缓冲液)以40ml/小时的流速洗脱层析柱24小时。洗脱液经紫外光吸收检测，收集主峰洗脱液，沉淀物用1M乙酸在Sephadex
G25层析柱上脱盐，冷冻干燥后得到15mg的〔ArgAO〕-脱〔ThrB30〕-人胰岛素。
产物的鉴定经氨基酸分析，HPLC分析和Edman顺序降解等方法得到证实。
实施例Ⅺ〔ArgAO〕-人胰岛素-(B30-酰胺)的制备将按实施例Ⅷ至Ⅹ之一的方法制备的〔ArgAO〕-脱〔ThrB30〕-人胰岛素200mg溶解于400mg苏氨酰胺，2.0ml乙醇和0.8ml水的混合物中，用乙酸将pH调至6.3，加入含有3.2mg固相胰蛋白酶的4ml(沉降)体积的Sepharose
。在20℃下缓和搅拌2小时后，滤去凝胶，加入10体积2-丙醇沉淀出蛋白质。将风干的沉淀物在4℃下溶解于pH调至8.1的20ml 7M尿素中，然后将该溶液装在1.6×20cm的Q-Sepharose
FF层析柱上，该层析柱事先在4℃下用20mM tris-(羟基甲基)氨基甲烷和经HCl将pH调至8.1的7M尿素中平衡。用0mM至50mM线性梯度NaCl缓冲溶液(相同的缓冲液)和40ml/小时流速洗脱层析柱24小时。洗脱液经紫外光检测，收集主峰洗脱液。沉淀物用1M乙酸在Sephadex
G25柱上脱盐，冷冻干燥后得到80mg的〔ArgAO〕-人胰岛素-(B30-酰胺)。
产物的鉴定经氨基酸分析，等离子体吸收质谱和Edman顺序降解等方法得到证实。
实施例Ⅻ〔GlnB13，ArgAO〕-脱〔ThrB30〕-人胰岛素的制备将按实施例Ⅲ和Ⅶ方法制备的〔GlnB13〕-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21)250mg与固相胰蛋白酶反应，反应产物基本按实施例Ⅷ的方法纯化，得到60mg的〔GlnB13，ArgAO〕-脱〔ThrB30〕-人胰岛素。
产物的鉴定经氨基酸分析，等离子体吸收质谱和Edman顺序降解等方法得到证实。
实施例ⅩⅢ〔GlnA4，AspA21，ArgAO〕-人胰岛素-(B30-酰胺)的制备将按实施例Ⅳ和Ⅶ的方法制备的〔GlnA4，AspA21〕-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21)500mg与固相胰蛋白酶反应，生成的产物基本按实施例Ⅷ的方法纯化，得到175mg的〔GlnA4，AspA21，ArgAO〕-脱〔ThrB30〕-人胰岛素。
将上述产物按实施例Ⅺ方法，与苏氨酰胺偶合，转化为B30-酰胺。得到50mg的纯〔GlnA4，AspA21，ArgAO〕-人胰岛素-(B30-酰胺)。
产物的鉴定经氨基酸分析，等离子体吸收质谱和Edman顺序降解等方法得到证实。
实施例ⅩⅣ〔SerA21，ArgAO〕-人胰岛素-(B30-酰胺)的制备将按实施例Ⅴ和Ⅷ的方法制备的〔SerA21〕-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21)400mg与固相胰蛋白酶反应，生成的产物基本按实施例Ⅷ的方法纯化，得到125mg的〔SerA21，ArgAO〕-脱〔ThrB30〕-人胰岛素。
将上述产物按实施例Ⅺ的方法，与苏氨酰胺偶合，转化成B30-酰胺，得到40mg的纯〔SerA21，ArgAO〕-人胰岛素-(B30-酰胺)。
产物的鉴定经氨基酸分析，等离子体吸收质谱和Edman顺序降解等方法得到证实。
实施例ⅩⅤ〔ArgB27，ArgAO〕-脱〔ThrB30〕-人胰岛素的制备将按实施例Ⅵ和Ⅶ的方法制备的〔ArgB27〕-B-(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21)250mg与固相胰蛋白酶反应，生成的产物基本按实施例Ⅷ的方法纯化，得到50mg的〔ArgB27，ArgAO〕-脱〔ThrB30〕-人胰岛素。
产物的鉴定经氨基酸分析和Edman顺序降解等方法得到证实。
实施例ⅩⅥ含溶解的〔ArgAO〕-人胰岛素-(B30-酰胺)的长效注射剂的配制将60μmol的〔ArgAO〕-人胰岛素-(B30-酰胺)溶解于4ml 0.1M HCl中，加入20ml 1.5%m-甲酚。该溶液与70ml 1%NaCl和3.25ml 0.1M ZnCl2混合，pH调至40，用水将最终体积调至100ml，过滤灭菌。
实施例ⅩⅦ含〔ArgAO〕-人胰岛素-(B30-酰胺)结晶悬浮液的长效注射剂的配制将60μmol的〔ArgAO〕-人胰岛素-(B30-酰胺)溶解于含0.5%m-苯酚的70ml 1% NaCl溶液中，用1M NaOH将pH调至9.7，加入325μl 0.1M乙酸锌。再将pH调至9.7后用水将体积调至80ml，溶液经过滤灭菌。
含有0.3%m-苯酚的20ml 65mM NaH2PO4，用NaOH调pH至6.0，过滤灭菌。
在无菌条件下，将两种溶液混合，生成的悬浮液在20℃下非常缓和地搅拌1小时，最后用HCl将pH调至7.3。
实施例ⅩⅧ大鼠皮下注射后经外部γ计数测定长效作用采用体重约250g和90天令以上的Wistar雌鼠作为试验材料。试验前使大鼠适应环境约一周并且随意进食。试验前4天，用20mM碘化钾水溶液作为大鼠的饮用水。
所用的试验制剂如下1.含有〔ArgAO〕-人胰岛素-(B30-酰胺)并按实施例ⅩⅦ制备的悬浮剂。
2.含有〔ArgAO〕-人胰岛素-(B30-酰胺)并按实施例ⅩⅥ制备的溶液制剂。
3.含有半合成的人胰岛素(Velosulin
，100单位/ml)的速效溶液制剂。
另外，上述三种制剂还各含有50微居里/毫升的〔单-125Ⅰ〕胰岛素或〔单-125Ⅰ〕-胰岛素化合物示踪物，按常规放射性碘方法制备。
在大鼠腿的背部皮下注射50μl含有3.5nmol胰岛素化合物和2.5微居里〔125Ⅰ〕标记示踪物，试验期间，将大鼠固定在夹鼠器中。
注射部位是吸收皮下贮存的胰岛素的测量范围(C.BinderAbsorp-tionofInjectedInsulin.Munksgaard，Copenhagen1969)。测量注射部位示踪物的消失是用2个固定的MIP-10辐射强度测量仪和装有3mmNaI窗式闪烁晶体管的检测器E749和60°视角10mm视野的照准仪(Raytronic)。辐射强度测量仪与微型记录器121N(Raytronic)联结。检测器固定在注射部位皮肤上部2cm。在注射制剂后的0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，4.5，6，8，12和14小时，测量5分钟的放射性强度。扣除本底计数后，将计数值转换成起始计数值的百分比。
图3中，残余的放射性的平均值表示为各制剂的时间函数。取50%残余放射性(T50%)的时间为长效测量值，由曲线得到T50%制剂Ⅰ＞12小时制剂Ⅱ≈8小时制剂Ⅲ≈0.5小时上述结果说明与速效人胰岛素制剂相比，含有〔ArgAO〕-人胰岛素-(B30-酰胺)的两个制剂具有长效作用。
实施例ⅩⅨ含有〔ArgAO，ArgB27〕-脱〔ThrB30〕-人胰岛素溶液的长效注射剂的配制将12μmol〔ArgAO，ArgB27〕-脱〔ThrB30〕-人胰岛素溶解于含有0.5%m-苯酚经1M HCl将pH调至3.5的35ml 1% NaCl溶液，加入650μl 0.1M乙酸锌，再将pH调至3.5，用水将体积调至50ml，溶液经过滤灭菌。
实施例ⅩⅩ兔子皮下注射后测定长效作用按照British Pharmacopoeia(1980)所述方法，测定含有按实施例ⅩⅨ方法制备的〔ArgAO，ArgB27〕-脱〔ThrB30〕-人胰岛素0.24mM的溶液制剂在兔体内的长效量。将65μl制剂皮下注射到6个兔子中，在注射时和注射后的1，2，4和6小时，采集血样测定血糖水平。血糖值用注射前血糖值的百分率表示。
测定结果得到如下平均值注射后的时间0小时1小时2小时4小时6小时开始时的%血糖值100%68.2%65.0%80.1%79.4%按J.Markussen等所述方法(Protein Engineering，Vol.1，No.3，pp.205-213，1987)测定长效指数，计算得到的值为42，与表1(文献同上)结果相比，含有〔ArgAO，ArgB27〕-脱〔ThrB30〕-人胰岛素的溶液制剂具有与普遍在使用的长效锌胰岛素悬浮液制剂Actrapid Human同样的长效作用。
权利要求
1.制备胰岛素制剂的方法，包括将作为活性组份的通式Ⅱ的至少一种胰岛素化合物溶解在与血清相等渗压的水介质中，溶液的pH值为2至5.5，
B链(续)Phe-Tyr-T-Pro-Lys-X-Y252627282930式中E各表示Glu或能由核苷酸顺序编码的天然氨基酸残基，N表示能由核苷酸顺序编码的氨基酸残基，T表示Thr或Arg，X表示Thr，Ser，Ala或OH，Y表示OR或NR1R2，其中R，R1和R2各表示氢或低级烷基，但当X表示OH时Y不存在，其中通式Ⅱ的胰岛素化合物的制备方法包括将通式Ⅲ的胰岛素前体通过转肽作用或由对赖氨酸残基的羧端裂解具有唯一特异性的肽链内切酶进行裂解，
式中E，N和T的含意如上所述，(AA)n表示具有C端残基为Lys和n氨基酸残基的肽链，或n=0时表示肽键，Z表示氢或具有C端残基为Lys的任意长度的肽链。
2.按权利要求1的方法，在制剂中可任意含有缓冲液和/或防腐剂和速效胰岛素。
3.按权利要求2的方法，其中所述速效胰岛素系人胰岛素，家畜胰岛素或它们的衍生物或类似物。
4.按权利要求1的方法，其中式Ⅲ中的E各为Glu或Gln，N为Asn，Asp，Ser或Gly，T为Thr或Arg，制取X为Thr和Y为NH2的式Ⅱ胰岛素化合物。
5.按权利要求1的方法，其中式Ⅲ中的E均为Glu，N为Asn，T为Thr，制取X为Thr和Y为NH2的式Ⅱ胰岛素化合物。
6.按权利要求1的方法，其中式Ⅲ中的E均为Glu，N为Ser，T为Thr，制取X为Thr和Y为NH2的式Ⅱ胰岛素化合物。
7.按权利要求1的方法，其中式Ⅲ中的B13位上的E为Gln，其余E均为Glu，N为Asn，T为Thr，制取X为Thr和Y为NH2的式Ⅱ胰岛素化合物。
8.按权利要求1的方法，其中式Ⅲ中A4位上的E为Gln，其余E均为Glu，N为Asp，T为Thr，制取X为Thr和Y为NH2的式Ⅱ胰岛素化合物。
9.按权利要求1的方法，其中式Ⅲ中E均为Glu，N为Asn，T为Arg，制取X为OH的式Ⅱ胰岛素化合物。
全文摘要
本发明提供了新的具有理想的胰岛素作用和/或抗原性的胰岛素化合物。新的胰岛素化合物用式II表示，式中E，N，R，R
文档编号A61K38/00GK1045793SQ9010156
公开日1990年10月3日 申请日期1990年3月19日 优先权日1989年3月20日
发明者佩·巴尔·施米特, 芬恩·贝内德·汉森 申请人:洛沃工业公司