含水蛭素衍生物的分泌物的制作方法

文档序号:1038085阅读:387来源:国知局
专利名称:含水蛭素衍生物的分泌物的制作方法
技术领域
本发明涉及由大肠杆菌分泌型突变株获得水蛭素衍生物的方法,并涉及N-末端的氨基酸序列为Ala-Thr-Tyr-Thr-Asp的水蛭素衍生物。
水蛭素是一种多肽,具有65个氨基酸,原由药用水蛭滤液中分离得到,其功能是与凝血酶形成稳定的复合物从而对于凝血酶具有高度特异的抑制作用,因此有许多可能的治疗作用,特别是抗凝血治疗。(F.Markquardt,Biomed.Biochim.Acta 44(1985),1007-1013)。
已经发表的完整水蛭素氨基酸序列(J.Dodt et al.,FEBS LETTERS 165(2),(1984),180-184)是用重组DNA技术并在微生物中表达来制备水蛭素的必要条件。
EP-A-0 158 564(Transgene)揭示了在宿主细胞,特别是在细菌细胞中表达水蛭素或水蛭素类似物的克隆载体。在本案中,药用水蛭滤液中,以mRNA开始进行cRNA的合成来获得水蛭素的基因编码,特别强调地描述了具有N-末端序列为Ile-Thr-Tyr-Thr-Asp的水蛭素衍生物及其获得该衍生物的方法。
EP-A-0 168 342(Ciba Geigy)揭示了编码水蛭素自然氨基酸序列的DNA序列,其氨基酸N-末端序列是Val-Val-Tyr-Thr-Asp。水蛭素在大肠杆菌和啤酒酵母菌的细胞内表达。
EP-A-0 171 024(Hoechst AG)公开了制备有水蛭素活性的多肽基因工程的方法,特别是在大肠杆菌内制备,并裂解细胞,从细胞提取物中获得具有水蛭素活性的多肽。在适当位置由蛋白分解或化学分解而剪切融合蛋白,纯化剪切后的水蛭素分子。
DE-A 34 45 571(GEN-BIO-TEC)涉及一种具有水蛭素生物活性蛋白DNA序列编码,以及从大肠杆菌细胞获得该蛋白的方法,由适当重组载体转化大肠杆菌,并溶解该大肠杆菌细胞而获得水蛭素活性蛋白。
Bergmann等(Biol,Chem,Hoppe,Seyler 367(1986),731-740)描述了在大肠杆菌内合成水蛭素,水蛭素的释放是通过甲苯处理细胞,但产量低,大约500mg/l A578细胞单位。
EP-A-0 200 655(Transgene)、Ep-A-0 252 854(Transgene)和EP-A-0 225 633(Ciba Geigy)披露了由真核宿主生物分泌获得有水蛭素活性的蛋白,特别是酵母,在这里载体发生了表达,该载体含有一个DNA序列,该序列在结构基因的上游含有一个信号肽。具有N-末端序列为Val-Val-Tyr-Thr-Asp和Ile-Thr-Tyr-Thr-Asp的水蛭素衍生物能够由酵母中分泌,据报道在这种情况下,产量达到100mg/l。
DE-A 39 00 626(Hoechst AG)公开了一种具有N-末端Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp序列的水蛭素衍生物。该衍生物优选在酵母内得以表达利用酵母信息素基因MFα的启动子和信号序列表达和分泌水蛭素的衍生物。
然而上述制备水蛭素衍生物的方法均有其各自的缺点。当酵母作为宿主生物时,水蛭素被分泌到培养基中,能获得相对高的产量,但酵母培养时间和要求条件比细菌(如大肠杆菌)时间长和条件苛刻。而用大肠杆菌作为宿主生物时,其产量相对低并且需要复杂的纯化手段和裂解程序。
因此本发明的目的在于研制一种直接获得水蛭素衍生物的方法,并且该方法不必裂解细胞而能获得高产量的水蛭素衍生物。
本发明涉及一种由大肠杆菌分泌型突变株获得水蛭素衍生物的方法,包括(1)以编码水蛭素衍生物的基因定位于编码细菌信号肽的DNA片段下游的方式构建重组载体,(2)按步骤(1)构建的重组载体转化大肠杆菌分泌型突变株,(3)在培养基中培养转化后的细菌,并,(4)从培养基中获得水蛭素衍生物。
根据本发明,水蛭素衍生物就是源于水蛭素的一组蛋白,水蛭素衍生物功能是起凝血酶抑制剂的作用,其特异的活性至少是10,000AT-U/mg(抗凝血酶单位)(Dodt et al.,Biol.chem.Hoppe Seyler 366(1985),379-385)。水蛭素衍生物还包括具有N-末端融合部分的融合蛋白,该融合部分大约达50个氨基酸长,并可利用蛋白溶解或化学剪切方法部分或全部切开该融合部分,这种剪切产物即为水蛭素衍生物,其特异的活性单位至少为10,000AT-U/mg。
根据本发明的方法获得的水蛭素衍生物具有下列N-末端氨基酸序列(X)m-Z-Thr-Tyr-Thr-Asp其中m=0到50,X代表相同或不同的遗传上可编码的氨基酸,Z代表可基因编码的如下选出的一种氨基酸,它包括,Leu,Ile,Aal,Val,Gly,Ser,Asp,Glu,Asn,Gln,His,Met,Phe和Tyr。
在该序列中m大于零时,则序列X优选含有蛋白溶解或化学切割位置,特别是在其末端。例如,如果序列X中最后氨基酸是Arg残基,则融合序列X可被胰酶消化剪切(在Arg后面剪切),活性水蛭素衍生物才能被纯化。然而用其它已知的水解酶和化学剪切剂也同样可能切掉融合蛋白部分。例如X序列末端带有Met残基,则可被卤化氰所剪切(E.Gross and B.Wittkop,J.Am.Chem.Soc.82(1961)1510-1517)。如果X序列C-末端含有氨基酸序列Ile-Glu-Gly-Arg,则用Xa因子也可将其剪切(EP-A 0 025 190和EP-A 0 161 973)。
根据发明的方法,当m=0时,Z优选代表Gln,His,Phe,Tyr,Gly,Ser,Asp或Asn,特别优选的是Ala,Gly,Ser,Asp或Asn。最优选的是,水蛭素衍生物的m为0,其Z代表Ala。
因此,本发明涉及具有N-末端序列为A-Thr-Tyr-Thr-Asp的水蛭素衍生物,其中,A代表Gln,His,Phe,Tyr,Gly,Ser,Asp或Asn,优选为Ala,Gly,Ser,Asp或Asn,最优选的是该衍生物N-末端序列为Ala-Thr-Tyr-Thr-Asp,更令人惊奇的是已有可能由大肠杆菌分泌型突变株的上清培养液中得到每升培养基中含超过2克的活性水蛭素。
根据本发明的方法,其另一优点是由于水蛭素衍生物分泌到细菌培养基中,从而使水蛭素在培养基中氧化条件下形成二硫键。
根据本发明,大肠杆菌分泌型突变株是指在培养基中可分泌大量蛋白质的大肠杆菌株。这些分泌株的制备方法在EP-A-0 338 410中注明。特别是,该大肠杆菌突变株来源于DS410大肠杆菌(DSM 4513)或BW7261大肠杆菌(DSM 5231)。首先这种独特的大肠杆菌株由含有编码可分泌蛋白DNA序列的质粒所转化,转化的大肠杆菌株再经过致突变,例如用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍处理,然后选择合适的分泌型突变株。例如,如果所应用的分泌蛋白是α-环糊精糖基转移酶(α-Cyclodextrin glycosyltransferase CGTase)则可借助于对D-环丝氨酸底物的抵抗来识别分泌突变株,D-环丝氨酸对于细胞壁是具有活性。此外,CGTase的分泌能使周围培养基中淀粉水解,当使用支链淀粉天青色培养基时,这种水解提供了选择分泌型突变株的补充选择余地。
适合于本发明的重组载体为能够整合到大肠杆菌的基因组中(例如λ-噬菌体),或在转化的大肠杆菌的染色体外存在(例如质粒)的载体。质粒是优先选用的。
在重组载体上的基因构建以及编码由信号肽组成的蛋白和水蛭素衍生物组成的蛋白的基因构建,最好是在一种可诱导的启动子的控制下进行,特别是在trp-lac融合启动子控制之下,可添加乳糖或IPTG(异丙基β-D-半乳糖硫苷)诱导该启动子。此外,在载体适当的位置上应含有选择记号基因和乳糖抑制基因。
原则上可允许大肠杆菌膜渗透的多种已知信号肽均作为适宜的细菌信号序列,该信号序列使水蛭素衍生物分泌成为可能,因此,优先选用的是革兰氏阴性菌的信号肽。(例如,下列大肠杆菌的蛋白质可作为信号肽蛋白质外膜蛋白OmpA(DiRienzo et al.,1978 Ann.Rev.Biochem.47481-532)碱性磷酸酶PhoA(Inouye et al.,1982 J.Bacterlol.149434-439)LamB蛋白(Hedgpeth et al.,1980 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 772621-2625)麦芽糖结合蛋白MalE(Bedouelle H.et al.,1980 Nature 28578-81)。特别优选使用的是CGTase信号肽。
根据本发明的方法,适合本发明的载体是pCM705质粒(

图1),该质粒从pCM703质粒中获得,将一个约1kb长的Nru I片段从质粒pCM703中删除即可得到pCM705,EP-A-0 383 410中公开pCM703质粒。该载体含有一个抗青霉素基因,乳糖抑制基因和一个在5'末端编码信号肽的CGT酶基因。编码水蛭素衍生物的基因以下述方法整合到pCM705载体中即在细胞内产生一个N-末端含有α-CGT酶信号肽的前体分子,基因构建受tac启动子控制,大肠杆菌分泌型突变株由上述质粒转化。
阳性转化的克隆在摇瓶中培养或在发酵罐中培养,当光密度(OD600)达到约为1时,用异丙基β-D-半乳糖硫苷(isopropyl β-D-thiogalactoside IPTG)或半乳糖进行诱导。
水蛭素衍生物产生过程由凝血酶灭活试验所检测(Griesbach et al.,Thrombosis Research 37,(1985),347-350)。用HPLC柱层析分析(反相)融合蛋白的积聚。剪切融合蛋白的前部分,可纯化得到活性水蛭素衍生物。
下面将结合附图1-5解释本发明的细节。
图1表示pCM705质粒,(核对1至9000个核苷酸的该质粒图)
图2表示采自pK152含有合成水蛭素基因的DNA序列。
图3表示HIR1,HIR2和HIR3寡聚核苷酸的序列。
图4表示pCM7051质粒。(核对1至6500的6500个核苷酸的该质粒图)以及,图5表示pCM7053质粒(核对1至5180的5180个核苷酸的该质粒图)。
实施例1分泌载体的构建。
pK152质粒含有合成水蛭素基因,其序列在EP-A-0171 024中列出。从该质粒起始端开始,Hinf I-HindⅢDNA片段大小约为200bp,它包含编码水蛭素绝大部分的DNA序列,并被琼脂糖凝胶电泳分离(图2),缺失的5'-末端序列由新合成的寡聚核苷酸再生,寡聚核苷酸的编码序列如图3所示。Hinf I末端融合产生了带有N-末端序列Ala-Thr-Tyr-Thr-Asp水蛭素衍生物。
pCM705质粒(图1)由Pst I和Hind Ⅲ剪切,2个剪切点位于编码CGT酶基因区内,结果约1kb大小的DNA片段被切掉,Pst I正好在编码信号肽酶剪切部位的区域内剪切。
pCM705 Pst I-Hind Ⅲ 6.3 kb片段,pK152 Hinf I-Hind Ⅲ 0.2 kb和寡聚核苷酸HIR1被连在一起,形成pCM7051质粒(图4),用该联结物转化HB101大肠杆菌(DSM 1607),分离纯化在含天青支链淀粉的选择培养基中没有分解淀物带的同源克隆,该克隆不能表达α-CGT酶。从几个纯化克隆中分离质粒DNA,由限制性分析而定性,经融合区序列分析具有水蛭素插入的2个质粒。
用Nru I和Nde I剪切含有正确的水蛭素基因构建的质粒DNA,通过琼脂糖凝胶电泳分离得到大小为5.18 kb的片段。
由于Nde I剪切,序列突出由klenow酶再作用之后,片段经连接而环化,该质粒称为pCM7053(图5)。
pCM7053质粒用于转化分泌型突变的大肠杆菌株WCM100,该株由EP-A-0 338 410描述的方法而获得。
实施例2在摇动瓶试验中检测水蛭素分泌。
10ml含有100μg/ml氨苄青霉素的被接种上WCM100 pCM7053新鲜过夜培养物,使光密度达OD420=0.1,30℃振动培养,当光密度OD420=1.0时,加入诱导剂乳糖,最终浓度为1%,48小时后,取出培养物,离心去掉细菌,测定上清液中水蛭素的浓度,测定方法是凝血酶灭活试验,产量达到4000AT-U/ml(抗凝血酶单位)(≈250mg/l)。
实施例3在10升发酵罐中生产水蛭素7升含有100μg/ml氨苄青霉素基础培养基,被接种上新鲜过夜WCM100 pCM7053培养物,使其光密度达OD600=0.1,发酵条件为温度30℃振荡频率450-950rpm通气0.5-1.5VvmpH7.0±0.1当光密度OD600达到1.0时,加入0.5mM IPTG.(isopropyl β-D-thiogalactoside)。
加入IPTG40小时后,上清液中水蛭素为36,000AT-U/ml(≈2.25g/l)。
实施例4具有N-末端序列Ala-Thr-Arg-Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp水蛭素的分泌。
程序同例1,但用寡聚核苷酸HIR2(图3)代替寡聚核苷酸HIR1,结果切除带有N-末端序列Ala-Thr-Arg-Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp的信号肽后获得水蛭素融合蛋白,上清液中这种融合蛋白的积聚用反相HPIC测定分析(C18层析柱)。携带有构建基因的WCM 100株的发酵生产的产率为25mg/l融合蛋白。
用由胰酶剪切获得N-末端携带有Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp序列的活性水蛭素。
实施例5WCM88分泌型突变株水蛭素的分泌。
WCM88分泌型突变株获得方式同EP-A-0 338 410叙述的方法相同,是由pCM7053质粒转化而来(见例1)。生产的水蛭素分泌到培养基中可在摇动瓶或发酵罐中检测。
a)摇瓶实验同例2一样培养WCM 88 pCM7053株在48小时后测定培养基上清液中水蛭素的浓度,其产率达1800AT-U/ml(≈110mg/l)b)10升发酵罐中生产如例3培养菌株。加入IPTG45小时后,上清液中可能达到21,000AT-U/ml(≈1.3g/l)。
实施例6
带抗四环素基因分泌载体的构建。
分离的1.1kb的质粒pBR322的Nru I-片段与Nru-I剪切下来的pCM7051的线状片段连接,连接物用于转化HP101大肠杆菌。筛选具有抗四环素作用的转化物。从选择后的克隆中重新分离质粒-DNA并用Nde I和Ava I剪切,经琼脂糖凝胶电泳分离较大片段后,由klenew酶补齐粘性末端,然后连接。
上述产生的质粒称为pCMT203。
实施例7应用pCMT203分泌载体分泌水蛭素。
用pCMT203质粒转化WCM 100分泌型突变株转化后按例3描述的方法在10升发酵罐中培养加入IPTG45小时后产生42,000AT-U/ml的水蛭素。
权利要求
1.由大肠杆菌分泌型突变株获得水蛭素衍生物的方法,其特征是(1)以编码水蛭素衍生物的基因直接定位于编码细菌信号肽的DNA片段下游的方式构建重组载体,(2)按步骤(1)构建的重组载体转化大肠杆菌分泌型突变株,(3)在培养基中培养转化后的细菌,并(4)从培养基中获得水蛭素衍生物。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征质粒用作重组载体。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征是构建一种编码水蛭素和编码信号肽的DNA序列在可诱导的启动子控制之下被定位的重组载体。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征是可诱导的启动子是trp-lac融合启动子。
5.根据上述权利要求之一所述的方法,其特征是应用革兰氏阴性细菌的信号肽。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征是所使用的信号肽是α-环糊精糖基转移酶信号肽。
7.根据上述权利要求之一所述的方法,其特征是一种从大肠杆菌株DS410(DSM 4513)或BW 7261(DSM 5231)中经过致突变筛选其分泌特性而获得的细菌株,被用作大肠杆菌分泌型突变株。
8.根据上述权利要求之一所述的方法,其特征是所述的水蛭素衍生物具有下列N-末端氨基酸序列(X)m-Z-Thr-Tyr-Thr-Asp其中,m=0到50,X代表相同或不同基因编码的氨基酸,Z代表由下述的氨基酸中选出的可基因编码氨基酸,包括His,Leu,Ile,Ala,Val,Gly,Ser,Asp,Glu,Asn,Gln,Met,Phe和Tyr。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征是序列X含有蛋白水解或化学剪切部位。
10.根据权利要求8所述的方法,其特征是所述的m=0,Z代表Ala,Gln,His,Phe,Tyr,Gly,Ser,Asp或Asn。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征是Z代表Ala,Gly,Ser,Asp或Asn。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征是Z代表Ala。
13.一种水蛭素衍生物,其特征是其N-末端氨基酸序列为A-Thr-Tyr-Thr-Asp,其中A代表Ala,Gln,His,Phe,Tyr,Gly,Ser,Asp或Asn。
14.根据权利要求13所述的水蛭素衍生物,其特征是A代表Ala,Gly,Ser,Asp或Asn。
15.根据权利要求14所述的水蛭素衍生物,其特征是A代表Ala。
16.重组DNA,其特征是它编码按照权利要求13至15之一所述的水蛭素衍生物。
17.重组载体,其特征是含有1个或多个基因构建的拷贝,该构建的基因编码由细菌信号肽组成的蛋白和水蛭素衍生物组成的蛋白。
18.根据权利要求17所述重组载体,其特征是信号肽来源于革兰氏阴性菌。
19.根据权利要求16到18之一所述的重组载体,其特征是所述的信号肽来源于α-环糊精糖基转移酶基因(α-cyclodextrin glycosyltransferase gene)。
20.根据权利要求17至19之一所述的重组载体,其特征是水蛭素衍生物具有如下N-末端氨基酸序列(X)m-Z-Thr-Tyr-Thr-Asp其中,m=0到50,X代表相同或不同的可基因编码的氨基酸,Z代表由下述氨基酸中选出的可基因编码的氨基酸包括His,Leu,Ile,Ala,Val,Gly,Ser,Asp,Glu,Asn,Gln,Met,Phe和Tyr。
21.根据权利要求20所述的重组载体,其特征在于水蛭素衍生物的N-末端序列为Ala-Thr-Tyr-Thr-Asp。
全文摘要
由大肠杆菌分泌型突变株获得水蛭素衍生物的方法包括(1)以编码水蛭素衍生物的基因直接定位于编码细菌信号肽的DNA片段下游的方式构建重组载体,(2)用构建的重组载体转化大肠杆菌分泌型突变株,(3)在培养基中培养转化后的细菌,(4)由培养基中获得水蛭素衍生物,并获得含有一个或更多个基因构建的拷贝的重组载体,该构建基因编码由细菌信号肽组成的蛋白和水蛭素衍生物组成的蛋白,水蛭素衍生物N-末端氨基酸序列是A-Thr-Tyr-Thr-Asp.其中A为Ala,Gln,His,Phe,Tyr,Glu,Ser,Asp或Asn。
文档编号A61P7/02GK1055010SQ9110168
公开日1991年10月2日 申请日期1991年3月21日 优先权日1990年3月22日
发明者格哈德·施密德, 保罗·哈贝尔曼 申请人:联合电化学工业股份有限公司
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