专利名称：抗菌素ge2270因子的酰胺类化合物衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有如下通式Ⅰ的抗菌素GE2270的新的酰胺类衍生物及其药用的加成盐
其中R代表氢、羟甲基或甲氧基甲基;
R1代表氢或甲基;
Y代表下式基团，
其中R2代表氢、(C1-C4)烷基、氨基(C2-C4)烷基、(C1-C4)烷基氨基-(C1-C4)烷基或二-(C1-C4)烷基氨基-(C1-C4烷基);
R3代表氢;带有1-3个取代基的直链或支链(C1-C14)烷基，该取代基系选自羧基、磺基、膦酰基;可任意被低级烷氧羰基或苄氧羰基保护的氨基;(C1-C4)烷基氨基(其中烷基可任意被一羧基取代);二-(C1-C4)烷基氨基;羟基;卤素;(C1-C4)烷氧基(其中烷基部分可任意被一羧基取代);(C1-C4)烷氧羰基;巯基;(C1-C4)烷硫基(其中烷基部分可任意被一羧基取代);可被1-3个选自羧基、磺基、羟基、卤素和巯基取代基任意取代的苯基;氨基甲酰基;(C1-C6)烷基氨基甲酰基〔其中烷基部分可被选自羧基、氨基、(C1-C4)烷基氨基和二-(C1-C4)烷基氨基的1-2个取代基任意取代〕;二-(C1-C4)烷基氨基甲酰基(其中烷基部分与其相邻的氮原子一起也可代表一饱和的五～七元杂环，该杂环的一个环碳原子可被羧基或氨基甲酰基任意取代，而且该杂环还可另外含有任意选自O、S和N的杂原子);苯甲酰氨基(其中苯基可被1-3个羟基取代);不饱和、部分饱和或完全饱和的含氮五～六元杂环，并且该杂环还可含有1-3个选自N、S和O的另外的杂原子(其中环碳原子之一可任意地带有羧基、磺基、羧基(C1-C4)烷基和磺基(C1-C4)烷基，且该环氮原子可被(C1-C4)烷基、羧基(C1-C4)烷基、磺基(C1-C4)烷基和苄基任意取代〕;(C3-C6)链烯基(可被羧基或磺基任意取代);1-脱氧-1-山梨糖基;2-脱氧-2-葡糖基;全饱和的五～七元含氮杂环〔其中氮原子可被(C1-C4)烷基或苄基任意取代，且环骨架的1个或2个碳原子可带有选自(C1-C4)烷基、羧基和磺基的取代基〕;
或R2和R3与相邻的氮原子一起共同代表一完全饱和的五～七元杂环，该杂环可任意含有选自O、S和N的另外的杂原子，且在环碳原子上可任意地带有选自(C1-C4)烷基、苄基、羧基、磺基、羧基(C1-C4)烷基和磺基(C1-C4)烷基的1个或2个取代基;
R4代表氢、甲基或羟甲基;
条件是当R4为氢为羟甲基时，则R同时为甲氧基甲基，且R1为甲基。
本发明也包括由相应的式(Ⅱ)起始化合物制备本发明化合物的方法，
抗菌素GE2270是通过培养玫瑰游动双孢菌ATCC53773或其变异株或突变株，并从菌丝体和/或发酵液中分离所需的抗菌素物质而制得。玫瑰游动双孢菌ATCC53773由土壤样品分离得到，并且于1988年6月14日保藏在布达佩斯条约所规定的美国典型培养物收集中心(ATCC)(12301ParklawnDrive，Rockville，MD20852MarylandU.S.A.)。
记录该菌株的登记号为ATCC53773。
抗菌素GE2270因子A是抗菌素GE2270复合物中的主要成分。
欧洲专利申请公开号359062对抗菌素GE2270因子A以及玫瑰游动双孢菌ATCC53773已有叙述。
最近的研究表明，抗菌素GE2270因子A可用以下通式(Ⅲ)表示，
当在选择性水解条件下处理抗菌素GE2270因子A时，得到一些称作抗菌素GE2270因子A1、A2和A3的衍生物。所说的因子A1、A2和A3以及制备它们的水解方法已在欧洲专利申请公开号406745以及美国专利申请号547，647中公开。
以上所提到的水解条件通常包括使用缓冲的或未缓冲的酸性水介质和极性有机溶剂的混合液。反应温度随所使用的酸的强度和浓度等因素的变化而变化，且一般在-10℃至90℃之间。反应时间还显著地取决于温度、酸强度及其浓度等参数，一般为几分钟至几小时。
一般来说，当使用较温和的水解条件时(如较短的反应时间和较低的温度或较低的酸强度或浓度)，通常得到抗菌素GE2270因子A1，而使用较强的水解条件则得到抗菌素GE2270因子A2，为了获得抗菌素GE2270因子A3，则必需使用更剧烈的水解条件。
虽然抗菌素GE2270因子A2和A3可被直接用作生产本发明化合物的起始物质，而抗菌素GE2270因子A1不适于用作直接生产本发明化合物的起始物质，但抗菌素GE2270因子A1如同下面将要进一步解释的那样可被用作上述起始物质的前体。
抗菌素GE2270因子A2和A3的特征在于，在分子的上部分别具有酯基和羧基官能团。具体地说，已发现抗菌素GE2270因子A2和因子A3可由上面所定义的式Ⅱ表示，其中W代表COOH(抗菌素GE2270因子A3)或酯基(抗菌素GE2270因子A2)
R为甲氧基甲基，R1为甲基，R4为甲基。
抗菌素GE2270因子A2和因子A3(及其混合物)都可用作制备本发明化合物的合适起始物，但优选其中的因子A3。因子A2可以作为活性酯直接加以使用，或者通过上面所述的剧烈酸水解或用稀释的碱进行碱水解(见欧洲专利申请公开号406745和美国专利申请号547，647)而被转化为因子A3。
最近已发现(欧洲专利申请公开号451486和美国专利申请665，612)，可从玫瑰游动双孢菌ATCC53773或其产生抗菌素GE2270的变异株或突变株的菌种中分离出其它较少的成分。具体地说，这些成分已在菌丝体以及所培养的微生物发酵液中被发现。
从菌丝体中回收所说的抗菌素GE2270的较少的成分的优选方法包括用可与水溶混的有机溶剂萃取过滤或离心的菌丝体、浓缩萃取液并通过沉淀(有选择地加入沉淀剂)、用不可与水混溶的有机溶剂萃取水溶性残渣、或在吸附层析后从吸附基质中洗脱所需产物等方法回收粗的抗菌素物质。
最近发现(欧洲专利申请号91114667.8)，从上面所述的玫瑰游动双孢菌ATCC53773的相同培养物中可分离出其他较少的成分(因子C2a)。
抗菌素GE2270C2a的理化性质如下A)用PerkinElmer320型光谱仪所记录的紫外吸收光谱显示出如下的最大吸收溶剂UVmax(nm)0.1MHCl245-250(肩峰)300-3150.1MKOH245-250(肩峰)300-315
磷酸盐缓冲液(PH7.38)245-250(肩峰)300-315甲醇245-250(肩峰)300-315B)抗菌素GE2270因子C2a的1H-NMR光谱是用250MHIBruker光谱仪记录的。以TMS作为内标(0.00ppm)，在DMSO-d6中抗菌素的光谱显示出如下信号〔δ，ppm，m〕(s＝单峰，d＝双峰，t＝三峰，m＝多重峰，Py＝吡啶，TI＝噻唑)9.03，d，(NH);8.70，d，(2NH′s);8.60，s，8.54，s，8.29，s，和7.38，s，(TZCH′s);8.48，m，(甘氨酸NH);8.43，d，和8.27，d，(Py CH′s);7.35-7.20，m，(芳香族CH′s和伯酰胺NH);6.98，s(伯酰胺NH);6.04，d，(OH);5.80，t(OH);5.35-5.15，m，(αCH′s);5.04，m，(苯基丝氨酸βCH);4.98，s〔CH2(OCH3)〕;4.87，d，〔CH2(OH)〕;4.81，m和4.56，m，(噁唑啉CH2);4.35-3.75，m，(甘氨酸的CH2和脯氨酰胺CH′s);3.39，s，(OCH3);2.71，m，和1.30，m，(天冬酰胺的CH2);2.48，d，(N-甲基天冬酰胺的NCH3);2.22-1.80，m，(异丙基CH和脯氨酰胺CH′s);0.88和0.84，d，(缬氨酸CH3′s)
C)当用下列反相HPLC系统进行分析时，相对于抗菌素GE2270因子A(Rt16.6)的保留时间0.76min，抗菌素GE2270因子C2a的保留时间为12.6min柱子Bakerbond C8(5μm)4.6×250mm(Bakerbond 是反相辛基甲硅烷基硅胶HPLC柱的商品名，由J.T.Baker Research Product，Phillisburg，New Jersey 08865 USA提供)流速1.8ml/minA相CH3CN∶四氢呋喃∶40mM HCOONH4＝40∶40∶20B相CH3CN∶四氢呋喃∶40mM HCOONH4＝10∶10∶80洗脱在20min内用20%-30%A相进行线性梯度洗脱检测UV254nmD)抗菌素GE2270因子C2a的主要FAB-MS峰为1306道尔顿。它最可能对应于质子化了的分子离子的最低同位素。分析是在Kratos MS-50双聚集质谱仪上进行，使用了8kV的加速电压和具有Xe气体的鞍形场原子枪(在离子源压力计上显示的压力为2×10-5乇)，其电压为6kV，电流为1mA。用于FAB-MS分析的抗菌素是与含有0.1M乙酸的硫甘油基质混合在一起。
所说的抗菌素GE2270的某些较少的成分(即因子B1、B2、C1、C2、C2a、D1、D2和E)可用上面所提到的通式Ⅱ代表，其中W代表下列基团
R分别代表氢(GE2270因子C1和D1)、甲基(因子B2)、羟甲基(因子D2和E)和甲氧基甲基(因子B1、C2和C2a);
R1代表氢(GE2270因子B1、D1和E)和甲基(GE2270因子B2、C1、C2、C2a和D2);
R4代表氢(GE2270因子C2)、甲基(GE2270因子B1、B2、C1、D1、D2和E)或羟甲基(因子C2a)。
当按照上面由抗菌素GE2270因子A制备抗菌素GE227因子A2和A3所述相同的水解方法(及欧洲专利申请公布号406745和美国专利申请号547，647)处理抗菌素GE2270因子D1、D2和E或其混合物时，上述共同的基团W被水解成羧基，而取代基R、R1和R4则未变。
因此，其中W为羧基或活性酯官能团，R为氢、羟甲基或甲氧基甲基，R1为氢或甲基且R4为氢、甲基或羟甲基的式Ⅱ衍生物可用作本发明的起始物，条件是当R4为氢或羟甲基时R为甲氧基甲基且R1为甲基。应当清楚的是，如同其它微生物一样，产生GE2270菌株的特征在于需经变异。例如，通过用各种已知的诱变因子(如紫外线、X-射线、高频波、放射线、化学药品，如亚硝酸、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基-胍以及许多的其它因素)进行处理，可获得该菌株的人工变异株和突变体。在本发明中，所有属于游动双孢菌属且产生抗菌素GE2270的天然和人工变异株和突变体均被看作与菌株玫瑰游动双孢菌ATCC53773等同。
这里所用的术语“烷基”，不论是单独存在还是与其它取代基相结合，都包括直链和支链的烃基;更具体地说，“(C1-C14)烷基”代表具有1-14个碳原子的直链或支链的脂肪烃，如甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基、1-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、1-己基、2-己基、3-己基、3，3-二甲基-1-丁基、4-甲基-1-戊基和3-甲基-1-戊基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基和十四烷基。同样，“(C1-C4)烷基”代表具有1-4个碳原子的直链或支链的烃，如前面所列举的1-4个碳原子的烷基。
如前所述，“(C1-C14)烷基”可带有1-3个取代基。
术语“卤素”代表选自氟、氯、溴和碘的卤原子。
这里所用的术语“(C3-C6)链烯基”指具有3-6个碳原子和双键的链烯基;它包括丙烯基、3-丁烯基、2-丁烯基、2-甲基丙烯基、2-戊烯基、3-己烯基等，它们可被羧基或磺基任意取代。
本发明所表述的“可含有1-3个选自N、S和O的其它杂原子的含氮五～六元杂环”包括未饱和、部分饱和和完全饱和的环系统，如吡啶、嘧啶、吡嗪、吡咯烷、哌啶、哌嗪、噁唑、噁唑啉、噁唑烷、吡唑啉、吡唑烷、噻唑烷、吗啉、硫代吗啉、吡咯、吡咯啉、咪唑、咪唑烷、噻二唑、噁二唑和四唑等。
在所说的“含氮五～六元杂环”中1-3个环碳原子可任意地带有羧基、磺基、羧基(C1-C4)烷基和磺基(C1-C4)烷基，且环氮原子可任意地被(C1-C4)烷基、羧基(C1-C4)烷基、磺基(C1-C4)烷基和苄基取代。
“其中氮原子可被(C1-C4)烷基或苄基任意取代的全饱和的五～七元含氮杂环”这一表述是指含有1个可被(C1-C4)烷基或苄基任意取代的氮原子，并且碳骨架可任意地带有1或2个选自(C1～C4)烷基、羧基和磺基取代基的全饱和五～七元杂环。该杂环是通过下式的氮原子和杂环架的碳原子之间的键与该氮原子相连，
该基团的例子有1-甲基-4-吡咯烷基、3-哌啶基、1-乙基-4-哌啶基、1-苄基-2，6-二甲基-4-哌啶基和4-羧基-1-甲基-2-哌啶基。
当R2和R3与相邻的氮原子一起共同代表“可任意地含有选自O、S和N的其它杂原子的全饱和五～七元杂环”时，该表述包括例如下面的杂环基团吡咯烷子基、吗啉代、哌啶子基、哌嗪子基、硫代吗啉代、吡唑烷子基、1，3-噁唑烷子基、1，3-噻唑烷子基和六氢氮杂
子基。当其它杂原子为N时，它可任意地带有选自(C1-C4)烷基、苄基、羧基、羧基(C1-C4)烷基、磺基和磺基(C1-C4)烷基的取代基。
术语“1-脱氧-1-山梨糖基”指其中Y为来自葡糖胺的式(Ⅰ)化合物，即Y为1-氨基-1-脱氧-山梨糖醇。术语“2-脱氧-2-葡糖基”指其中Y为来自葡糖胺的式(Ⅰ)化合物，即Y为2-氨基-2-脱氧葡萄糖。
优选的一组本发明化合物为其中R代表甲氧基甲基、R1和R4代表甲基和其它取代基的定义同前的式Ⅰ化合物。
更优选的一组本发明化合物是其中R代表甲氧基甲基、R1和R4代表甲基以及Y代表下式基团的式Ⅰ化合物，
其中R2为氢，R3的定义同上。
另一组更优选的本发明化合物为下述式Ⅰ化合物，其中R为甲氧基甲基，R1和R4代表甲基，并且Y代表氨基，该氨基来源于例如甘氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苏氨酸、赖氨酸等天然氨基酸，或来源于例如甘氨酰赖氨酸、丝氨酰脯氨酸、甘氨酰脯氨酰胺、酪氨酰脯氨酰胺、氨酰脯氨酰胺、亮氨酰脯氨酰胺等合成的二肽。
另一组更优选的化合物包括如下式Ⅰ化合物，其中R为甲氧基甲基，R1和R4为甲基，Y为NR2R3基团(其中R2为氢，R3为被选自COOH、SO3H和PO3H2基团取代的具有3-12个碳原子，优选3-7个碳原子的线性烷基链。
最优选的化合物为其中R为甲氧基甲基、R1和R4为甲基和Y为NR2R3基团(其中R2为氢。R3为CH2CH2CH2CH2CH2-COOH)的式Ⅰ化合物。
另一组更优选的本发明化合物是如下式Ⅰ化合物，其中R代表氢、羟甲基和甲氧基甲基，R1代表氢或甲基，Y代表下式基团，
其中R2为氢，R3和R4的定义同上。
另一组更优选的本发明化合物是如下式Ⅰ化合物，其中R为氢、羟甲基或甲氧基甲基，R1代表氢或甲基，R4为氢、甲基或羟甲基(条件是当R4为氢或羟甲基时R为甲氧基甲基，R1为甲基)，且Y为氨基，该氨基来源于例如甘氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苏氨酸、赖氨酸等天然氨基酸，或来源于例如甘氨酰赖氨酸、丝氨酰脯氨酸、甘氨酰脯氨酰胺、酪氨酰脯氨酰胺、苏氨酰脯氨酰胺、亮氨酰脯氨酰胺等合成的二肽。
另一组优选的化合物包括如下式Ⅰ化合物，其中R为氢、羟甲基或甲氧基甲基，R1为氢或甲基，R4为氢、甲基或羟甲基(条件是当R4为氢或羟甲基时R为甲氧基甲基，R1为甲基)，且Y为NR2R3基团，其中R2为氢，R3为被COOH、SO3H和PO3H2基团取代的优选具有3-12个碳原子(更优选具有3-7个碳原子)的线性烷基链。
最后一组优选的化合物是如下式Ⅰ化合物，其中R为氢、羟甲基或甲氧基甲基，R1为氢或甲基，R4的定义同上，且Y为NR2R3基团(其中R2为氢，R3为CH2CH2CH2CH2CH2-COOH)。
本发明化合物的代表性实例包括其中R、R1、R4和Y的定义如上，
代表如下基团的式Ⅰ化合物
-NH2-NHC4H9-NH(CH2)4-PO3H2-NHCH2COOH-NH-CH2CONH2-NH-CH2-CON(C2H5)2
其中n为2，3或4-NH-(CH2)n-NH2-NH-(CH2)n-NHCH3-NH-(CH2)n-N(CH3)2-NH-(CH2)n-N(C2H5)2-NH-(CH2)n-N(CH3)(C2H5)其中n为2，3，4，5，6，7或8
-NH-(CH2)n-NH-(CH2)m-COOH-NH-(CH2)n-NH-(CH2)m-SO3H-NH-(CH2)n-O-(CH2)m-COOH-NH-(CH2)n-O-(CH2)m-SO3H-NH-(CH2)n-S-(CH2)m-COOH-NH-(CH2)n-S-(CH2)m-SO3H其中n为2，3，4或5，m为1，2，3或4
-NH-(CH2)n-CH＝CH-(CH2)m-COOH-NH-(CH2)n-CH＝CH-(CH2)m-SO3H其中n为1，2或3，m为0.1或2
本发明的化合物可按照常规方法形成盐。
具体地，其中-NR2R3基团含有另外的胺官能团的式Ⅰ化合物可以形成酸加成盐。
另外，在-NR2R3基团中含有酸官能团的本发明化合物还可以形成碱加成盐。
一般来说，含有酸和碱官能团的本发明化合物可形成内盐。在本发明的范围内，“内盐”包括在“非盐”形式的定义中。
优选的本发明化合物的加成盐是可药用的酸和/或碱加成盐。
术语“可药用的酸和/或碱加成盐”意指与酸和/或碱形成的盐，从生物学、制药和配方的角度看这些在制药实践以及用于促进动物生长方面均是适用的。
式Ⅰ化合物的代表性和适宜的酸加成盐包括通过常规反应与有机和无机酸形成的盐，这些有机和无机酸的例子有盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、琥珀酸、柠檬酸、抗坏血酸、乳酸、马来酸、富马酸、棕榈酸、胆酸、双羟萘酸、粘酸、谷氨酸、樟脑酸、戊二酸、羟基乙酸、邻苯二甲酸、酒石酸、月桂酸、硬脂酸、水杨酸、甲磺酸、十二烷基磺酸(estolicacid)、苯磺酸、山梨酸、苦味酸、苯甲酸、肉桂酸以及类似的酸。
上述碱的代表性实例有碱金属或碱土金属氢氧化物，如氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化钙;氨和有机脂族、脂环族或芳族胺，如甲胺、二甲胺、三甲胺、2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇(TRIS)、甲基吡啶;以及碱性氨基酸，如赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸和组氨酸。
将本发明的游离氨基或非盐化合物转化成相应的加成盐，以及反过来将本发明化合物的加成盐转化成非盐或游离氨基形式都属于常规技术并包括在本发明中。
例如，通过将非盐形式的化合物溶于水溶性溶剂中并加入稍微过量摩尔的选择的酸或碱，可将式Ⅰ化合物转化成相应的酸或碱加成盐。然后将产生的溶液或悬浮液冷冻干燥就可得到所需的盐。在某些情况下，不通过冷冻干燥而是用有机溶剂萃取、将分离出的有机相浓缩至小体积并加入非溶剂沉淀，也可能得到最终所需的盐。
在最终的盐不溶于有机溶剂而非盐形式可溶的情况下，可在加入化学计算量稍微过量摩尔的选择酸或碱之后，通过过滤非盐形式的有机溶液的方法可以得到最终的盐。
非盐形式可通过下面方法制备将相应的酸或碱盐溶于水溶性溶剂，然后进行中和，游离出非盐形式。再通过用有机溶剂萃取回收，或者通过加入选择酸或碱并按上述方法操作而转化成另一种碱或酸加成盐。
当需要进行下面的中和脱盐时，可使用普通的脱盐方法。
例如，可方便地使用在控制的微孔葡聚糖树脂(如SephadexLH20)或硅烷化的硅胶上进行柱层析。用水溶液洗去不需要的盐后，用水与极性或非极性有机溶剂的混合液(如从50∶50乙腈/水至100%乙腈)进行线性梯度或阶梯度洗脱，可洗脱出所需产物。
正如现有技术所已知的，与可药用的酸(碱)或非药用的酸(碱)成盐可以用作为常规纯化技术。在成盐和分离之后，可以将式Ⅰ化合物的盐形式转化为相应的非盐或转化为可药用的盐。
在某些情况下，式Ⅰ化合物的酸加成盐更易溶于水和亲水溶剂，且其化学稳定性得到提高。
但是，鉴于式Ⅰ化合物和它们的盐性质上的相似性，本申请中论及的式Ⅰ化合物的生物活性同样适用于其可药用的盐，反之亦然。
鉴于本发明化合物的特性，在制备用于治疗人体或动物的药品中本发明化合物可以用作为有效成分。
具体地说，式Ⅰ所示的抗菌素GE2270化合物的酰胺类衍生物主要可用作抗革兰氏阳性细菌以及抗革兰氏阳性和抗阴性厌氧菌的抗菌剂。
制备本发明化合物的一般方法是将合适的抗菌素GE2270化合物式(Ⅱ)与所选择的式HNR2R3的胺(其中R2和R3的定义同上)在惰性有机溶剂中反应(酰胺化)，
其中W代表羧基或活性酯官能团;
R代表氢、羟甲基或甲氧基甲基;
R1代表氢或甲基;
R4代表氢、甲基或羟甲基;
条件是当R4代表氢或羟甲基时，R同时为甲氧基甲基，R1为甲基;并且当W为羧基时，在缩合剂存在下进行反应。
在进行酰胺化制备本发明化合物时，有时需要将反应物上不参与酰胺化反应但对反应条件敏感或对反应进程产生不利影响(如产生不需要的副产物)的官能团进行保护。
此外，当氨基酸含有其它可能影响酰胺化反应进程的活性官能团(如氨基、羧基或巯基)时，可用本身已知方法将它们保护起来，这些方法在E.GrossandJ.Meienholer“ThePeptides”Vol.3，AcademicPress，NewYork，1981和M.BodanszkyandA.Bodanszky“ThePracticeofPeptideSynthesis”，Springer-Verlag，BerlinHeidelberg，1984等参考书中已有叙述。这些保护基在进行酰胺反应的条件下必须是很稳定的，并且能够在反应结束时很容易地脱去而不影响新形成的酰胺键或分子的任何其它部分。
能够较好地用在本发明的方法中保护氨基官能团的N-保护基的代表性实例有形成氨基甲酸酯的试剂，其特征在于具有以下的氧羰基1，1-二甲基丙炔基-氧羰基、叔丁基氧羰基、乙烯基氧羰基、芳基氧羰基、肉桂酰氧基羰基、苄基氧羰基、对-硝基苄基氧羰基-3，4-二甲氧基-6-硝基苄基氧羰基、2，4-二氯苄基氧羰基、5-苯并异噁唑基甲氧羰基、9-蒽基甲氧羰基、二苯基甲氧羰基、异烟酰氧羰基、S-苄基氧羰基等。
对活性羧酸官能团的适当保护方法是通过例如形成酯官能团。
根据本申请的公开内容，熟悉本领域的技术人员能够决定哪些胺HNR2R3官能团需要保护、怎样保护以及为了得到所需最终化合物如何适当的去保护反应。
熟悉本领域的技术人员均知道，根据所需要的具体酰胺衍生物的特性，最终选择具体的保护基。事实上，终产物的酰胺官能团在脱去保护基的条件下必须是稳定的。
由于除去不同保护基的条件是已知的，因此熟练的技术人员能够选择出适当的保护基。
用于缩合反应的惰性有机溶剂是那些不会对反应进程产生不利影响并且能够至少部分溶解抗菌素起始物的溶剂。
所述惰性溶剂的例子有有机酰胺、二元醇和多元醇的醚、磷酰胺、亚砜。优选的惰性溶剂的例子有二甲基甲酰胺、二甲氧基乙烷、六甲基磷酰胺、二甲基亚砜、二噁烷及其混合液。
对反应条件，有时水是合适的。
当W为羧基时本发明方法中所使用的缩合剂是那些适于在有机化合物尤其是在肽合成中形成酰胺键的试剂。
代表性的和优选的缩合剂的例子有(C1-C4)烷基、苯基或杂环基磷酰叠氮酯，如磷酰叠氮二苯酯(DPPA)、磷酰叠氮二乙酯、磷酰叠氮二(4-硝基苯基)酯、磷酰叠氮二吗啉基酯和磷酰氯二苯酯或苯并三唑-1-基-氧代-三吡咯烷并磷鎓六氟磷酸酯(PyBOP)。优选的缩合剂是磷酰叠氮二苯酯(DPPA)。
在本发明方法中，通常应用稍微过量摩尔的胺反应物HNR2R3。
一般应用1-2倍摩尔过量，优选1.2-1.5倍摩尔过量。
为了进行酰胺化反应，胺HNR2R3必须能够与抗菌素起始物的羧基官能团形成盐。当在所选定的反应介质中胺HNR2R3不足以成盐时，必须向反应混合物中按与抗菌素起始物等摩尔的量加入形成盐的碱。
这类形成盐的碱其例子有有机脂族或脂环族叔胺(如三甲胺、三乙胺、N-甲基吡咯烷)和杂环碱(如甲基吡啶)等。
通常应用稍微过量摩尔(如1.1-1.5)，优选为抗菌素GE2270起始物1.2倍的缩合剂。
另外，也可将胺HNR2R3以其相应的酸加成盐如盐酸盐的形式很便利地加至反应介质中在此情况下，必须使用能够从其盐中游离出HNR2R3胺的至少2倍(优选2-3倍)。同样，在这种情况下，合适的碱是如同上面所列举的有机脂族或脂环族叔胺。事实上，至少在某些情况下，最好使用胺HNR2R3的盐，然后用上述碱将其游离出来，特别是当该盐比相应的游离胺更稳定时尤其如此。
反应温度将明显地取决于特定的起始物和反应条件。一般来说，在0-20℃之间进行该反应较好。
同样，反应时间也明显地取决于其它反应参数。一般来说，缩合反应在约5-24h内完成。
在任何情况下，均按照现有技术中的已知方法通过TCC(优选HPLC)监测反应进程。
根据测定的结果，熟悉本领域的技术人员能够对反应进程进行评估以及决定何时终止反应，并使用已知方法处理反应物质。这些方法包括用溶剂萃取、加入非溶剂沉淀以及通过柱层析进一步分离和纯化。
如前所述，当需要对反应物HNR2R3进行保护时，被保护的最终产物可通过已知方法脱去保护，所用的具体方法主要取决于所用的保护基。
当活性酯用作为GE2270起始物时，该酯是其中酯化的醇具有一离去基团的酯，而该离去基团在对分子的其它部分不发生改变的反应条件下能够很容易地被HNR2R3胺所置换或取代。在上面所提到的溶剂中，应用的胺反应物其摩尔数通常超过活性酯和低级烷醇的量。反应温度一般为0℃-100℃。活性酯的例子包括其中低级烷基部分被氰基和硝基任意取代的低级烷基酯、被卤素和硝基取代的苯基酯以及GE2270因子A2中含有的酯基部分。
很显然，在很多情况下可以多种方式制备本发明化合物，并且可以利用本身已知反应将本发明的一种化合物转化成另一种化合物。
例如，当HNR2R3胺含有可被进一步转化成相应的酰胺衍生物的羧基或酯官能团时，可通过如下方法制备所需的式Ⅰ化合物首先将上述的胺与所选择的GE2270起始物缩合，然后通过与合适的胺反应将羧基或酯基转化成酰胺。
以下各表列出了本发明某些代表性化合物的结构式(表Ⅰ)及其制备方法(在实验部分有详细叙述)、起始物和反应产率(表Ⅱ)。
HPLC分析下表(表Ⅲ)报道了具有代表性的本发明化合物的Rt值。
分析是在装有10μl小孔注射器的Varian5000LC型泵和Varian2050可变滤长检测器上于254nm处进行的。
柱子在LiChroCart-LiChrosorbRP-8(5μm)前置柱后面接着一个LiChroCart125-4LiChrospher100RP-8(5μm)柱。
洗脱剂A 0.05M HCOONH4水溶液B CH3CNCTHF方法A成分恒定的洗脱剂，44%B在A中的溶液流速0.7ml/min方法B成分恒定的洗脱剂，40%B在A中的溶液流速0.7ml/min方法C成分恒定的洗脱剂，38%B在A中的溶液流速0.5ml/min方法D成分恒定的洗脱剂，30%B在A中的溶液流速0.7ml/min方法E成分恒定的洗脱剂，38%B在A中的溶液流速0.7ml/min方法F按照以下方案在11min内用38%-55%B在A中的溶液进行梯度洗脱时间(min)A中B的百分数03863874510451155流速0.7ml/min方法G按照以下方案在25min内用38%～55%B在A中的溶液进行梯度洗脱时间(min)A中B的百分数038638104415452555流速0.7ml/min方法H成分恒定的洗脱剂，55%B在A中的溶液流速0.7ml/min方法Ⅰ成分恒定的洗脱剂，60%B在A中的溶液流速0.7ml/min方法L成分恒定的洗脱剂，48%B在A中的溶液流速0.7ml/min方法M按照以下方案进行梯度洗脱时间(min)%A%B%C074101620621919流速0.7ml/min
表Ⅲ(续)
K＝相对保留时间K＝相对保留时间＝Rt酰胺/RtGE2270合适起始物(即其中W为COOH的式Ⅱ化合物)
实验部分表Ⅳ-N.M.R1H-NMR谱是用TMS作为内标(0.00ppm)，用DMSO-d6为溶剂，在250MHz和/或500MHz的Bruker谱分析仪上进行记录的(s＝单峰，br s＝宽单峰，d＝双峰，dd＝双双峰，t＝三重峰，m＝多重峰)。
表Ⅴ-I.R.
红外光谱(IR)是在石蜡糊中用PerkinElmer580型分光光度计记录的。
表Ⅵ-U.V.
紫外吸收光谱是用PerkinElmer320型分光计记录的。
熟练的技术人员都知道，下面的表Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ中的数据并不代表所获得的所有峰值，而仅代表单个物质特征的峰值。
本发明化合物的抗菌活性可通过一系列的体外标准试验加以证实。
通过琼脂稀释法测定对疮疱丙酸杆菌和对脆弱拟杆菌的MIC(接种物104/105CFU/斑)。对其它细菌的MIC是用微量肉汤稀释法测定(接种物104-105CFU/ml)。除流感嗜血菌、疮疱丙酸杆菌和脆弱拟杆菌的培养时间为48h外，其它细菌的培养时间均为18-24h。所有细菌均于37℃培养。流感嗜血菌于5%CO2环境中培养，厌氧菌于厌氧气体混合物中培养。所用的培养基为Iso-Sensitest肉汤(Oxoid)(葡萄球菌、粪链球菌、大肠杆菌、普通变形菌);脑心浸出肉汤(Difco)+1%补体C(Difco)(流感嗜血菌)。
下面表Ⅶ中报道了对一些细菌的最小抑制浓度(MIC，μg/ml)。
鉴于其性质，本发明化合物可用作制备治疗人体或动物的药品的有效成分。
具体地说，抗菌素GE2270化合物的酰胺衍生物(式Ⅰ)主要对革兰氏阳性细菌以及革兰氏阳性和阴性厌氧菌具有抗菌作用。
本发明抗菌物质主要的治疗作用表现在可用它们处理对其敏感的细菌所引起的感染。
术语“处理”意指预防、治疗和治愈。
接受治疗的患者可以是任何动物，包括灵长类动物(尤其是人)和其它哺乳动物(如马、牛、猪和羊);以及普通的家畜和家养动物。
本发明的化合物可以单独服用，或者与可药用的载体混合后服用，也可与其它的抗菌剂联合服用。联合疗法包括依次、同时和单独服用各有效成分，其方式是在第一次服用的治疗作用还未完全消失时服用下一成分。
一种优选的药用制剂是适于在无损伤或损伤的皮肤或粘膜上进行局部给药的制剂。这类制剂的例子有粉剂、软膏、乳膏和洗液。这类制剂中赋形剂是普通的可药用载体，如油脂性软膏基质(如十六烷基酯蜡、油酸、橄榄油、石蜡、鲸蜡、甘油淀粉);吸收性软膏基质(如无水羊毛脂、亲水性矿脂);乳化软膏基质(如十六烷醇、单硬脂酸甘油酯、羊毛蜡、硬脂酸);水溶性软膏基质〔如乙二醇醚及其衍生物，包括聚乙二醇、聚(氧-1，2-乙烷二基)-α-氢-ω-羟基-十八酸酯、聚山梨酸酯和聚乙二醇单硬酸酯〕。
这些制剂中可含有其它已知赋形剂，如防腐剂，并且可以按照现有技术中已知方法和Remington′sPharmaceuticalSciences，Seventeenthedition，1985，MackPublishingCo.等参考书中所报道的方法进行制备。
也可按照现有技术中所已知的方法将本发明的化合物配制成适用于非经胃肠道给药的制剂。例如，可以将本发明化合物与用聚丙二醇或二甲基乙酰胺以及聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯或聚乙氧化的蓖麻油等表面活性剂一起配制。
优选的非经胃肠道给药制剂包括以下赋形剂Cremophor
EL(聚烃氧基35蓖麻油USP/NF)20%，丙二醇5-10%。
在治疗对本发明抗菌素敏感的细菌引起的任何感染时，优选上述用于静脉给药的制剂。
适用于静脉给药的配方其一个例子是化合物19100mg丙二醇1ml注射用水(足量)5ml磷酸盐缓冲液(PH8-8.5)在治疗由于胃肠道中存在厌氧菌而引起的假膜结肠炎或其它疾病时，可将本发明化合物的有效剂量以合适的药用形式(如胶囊或水悬浮液)口服给药。
有效成分的剂量取决于许多因素，其中包括患者的类型、年龄和状况、特定的有效成分、所选择的给药制剂以及给药方式等。
一般来说，是按每单个单位剂量形式使用抗菌有效的剂量。一般用这些剂量形式进行重复给药(如每天2-6次)较好。有效剂量一般为0.5-50mg/kg体重/天。
一优选的局部制剂是含有1-10%本发明化合物的软膏。
无论如何，有处方权的医师能够为具体情况下的某一患者确定最佳剂量。
本发明化合物除了可用作人和兽医治疗的药物外，还可被用作动物生长促进剂。
为此，可将本发明的化合物加到合适的饲料中进行口服给药。所使用的具体浓度是当正常量的饲料被消耗时产生促进生长作用所需有效成分的浓度。
向动物饲料中加入本发明的有效化合物，最好是制备含有有效量本发明的化合物的合适饲料预混合物，并将该预混合物加至全部的定量物中。
或者可将含有有效成分的中间物精饲料或饲料添加剂与饲料混和。上述饲料预混合物和全部定量物的制备和服用的方式在参考书中有所记载(如“AppliedAnimalNutrition”，W.H.FreedmanandCO.，S.Francisco，USA，1969或“LivestockFeedsandFeeding”OandBbooks，Corvallis，Oregon，USA，1977)。
以下的实施例进一步说明了本发明，但无论如何不应将其理解为是对本发明的限定。
方法A-起始物GE2270因子A3与所选择的胺的反应。
实施例1制备化合物15、29、30、32、33于0℃，在搅拌下向1mmol GE 2270因子A3(按欧洲专利申请公开号406745中所述的方法制备)的10ml二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入1.2mmol所选择的胺、1.4mmol三乙胺(TEA)和1.2mmol磷酰叠氮二苯酯(DPPA)(如果使用所选择胺的盐(盐酸盐、对-甲苯磺酸盐等)，则必须使用两倍数量的TEA)。让温度升至室温，并继续搅拌约4h。然后用1N盐酸水溶液将反应混合物酸化至约pH3，并用水稀释至产物完全析出。湿固体风干后经硅胶60(230-400目 ASTM-Merck)快速层析纯化，用3-5%甲醇的氯仿溶液洗脱。将含有标题化合物的部分合并，并蒸发溶剂。该固体与乙醚一起研磨后得到细粉状的标题化合物。
方法A1-起始物GE 2270因子A3与所选择的含有其它活性官能团(均被保护)的胺反应，随后脱去保护基。
实施例2制备化合物34、36基本按照实施例1所述的方法进行反应。当反应产物通过快速层析纯化后，用7ml冷的三氟乙酸(TFA)处理1mmol所得的固体。将悬浮液搅拌几分钟，直至得到一种溶液，并且在冷却下“真空”蒸发TFA。仍含有微量TFA的胶状产物用乙醚处理，得到三氟乙酸盐形式的标题化合物，为细粉状物。
实施例3制备化合物1，3-10，18-21，39基本按照实施例1所述的方法进行反应。当反应产物通过快速层析纯化后，将1mmol所得固体溶于20ml二噁烷，并于室温和搅拌下加入1.2ml1NNaOH水溶液。5h后用1N盐酸水溶液酸化该溶液至pH2，并用水稀释至标题化合物完全析出。再经过滤和风干，得到细粉状的标题化合物。
实施例4制备化合物2按照实施例3所述的方法进行反应。当完成酯官能团的水解以及产物风干后，将1mmol所得固体溶于20mlTFA，并按照Y.Kiso等(Chem.Pharm.Bull.28，673，1980)所述的方法，于室温和搅拌下加入50mmol苯硫基甲烷。3.5h后，在冷却下“真空”蒸发TFA，并将残余物溶于最小量的1%甲醇的氯仿溶液中。加入乙醚使标题化合物沉淀，再经过滤、用较多的乙醚洗涤和“真空”干燥得到标题化合物的三氟乙酸盐，为细粉状物。
实施例4-2制备化合物37基本按照实施例1所述的方法进行反应。当起始物从反应混合物中消失后，加水并过滤出所得的沉淀物，再用水洗涤并风干。然后将粗品溶于3mlTHF，在10%盐酸水溶液存在下于室温搅拌过夜用水稀释，使产物完全沉淀，并且过滤和风干。然后固体经硅胶60(230-400目ASTM-Merck)快速层析，用2-4%甲醇的氯仿溶液洗脱。将含有标题化合物的部分合并，并蒸发溶剂，得到浅黄色粉末。
方法B一起始物GE2270因子A3与所选择的含有未被保护的酸残基的胺反应。
实施例5制备化合物19，22-28，40，41于0℃在搅拌下将1.1mmolDPPA加至1mmolGE2270因子和1.5mmolTEA的10mlDMF溶液中。让温度升至室温，并继续搅拌4.5小时。然后于室温下向溶液中加入1.5mmol所选择的胺和2mmolTEA，并在同一温度下继续搅拌5h(如果选择的胺含有一个以上的酸性官能团，则调整TEA的量以便游离出氨基)。然后用1N盐酸水溶液将反应混合物酸化至约pH2，用水稀释至产物完全析出。将湿固体风干，并通过硅胶60(230-400目ASTM-Merck)进行快速层析纯化，用5-10%甲醇的氯仿溶液洗脱。合并含有标题化合物的部分，并且蒸发溶剂。固体与乙醚一起研磨后得到细粉状标题化合物。
方法B1-起始物GE2270因子A3与所选择的含有活性官能团(除了未被保护的酸性基团外，其它所有官能团均通过各种方式加以保护)的胺反应，随后脱去保护基。
实施例6制备化合物11，12基本上按照实施例5所述的方法进行反应。当反应产物通过快速层析纯化后，将1mmol所得的固体溶于20mlTEA，并于室温和搅拌下加入50mmol苯硫基甲烷。3.5小时后，在冷却下“真空”蒸发TFA，并将残余物溶于最小量的1%甲醇的氯仿溶液中。加入乙醚以使标题化合物沉淀，再经过滤、用较多的乙醚洗涤和“真空”干燥，得到标题化合物的三氟乙酸盐，为细粉状物。
方法C-选择作为起始物的GE2270因子A3的酰胺衍生物与所选择的试剂反应实施例7由化合物1、5、10、6分别制备化合物14、15、16、17
于0℃和搅拌下将1.2mmol所选择的胺、1.4mmol TEA和1.2mmol DPPA加至1mmol GE2270因子A3的合适酰胺衍生物(按前面实施例中所述的方法制备)的10ml DMF溶液中〔如果使用所选择的胺的盐(盐酸盐、对-甲苯磺酸盐等)，则必须用两倍数量的TEA〕。让温度升至室温，并继续搅拌约4h。然后用1N盐酸水溶液将反应混合物酸化至约pH3，并用水稀释至产物完全析出。湿固体风干后经硅胶60(230-400目ASTM-Merk)快速层析纯化，用3-5%甲醇的氯仿溶液洗脱。合并含有标题化合物的部分并蒸发溶剂。固体与乙醚一起研磨后得到细粉状标题化合物。
方法C1-选择作为起始物的GE2270因子A3的酰胺衍生物与所选择的含有其它活性官能团(均被保护)的试剂反应，随后脱去保护基。
实施例8由化合物3制备化合物13按照实施例7所述的方法进行反应。当反应产物经快速层析纯化后，将1mmol所得固体溶于20ml二噁烷，并于室温和搅拌下加入1.2ml1NNaOH水溶液。5h后用1N盐酸水溶液将溶液酸化至pH2，并用水稀释至标题化合物完全析出。再经过滤和风干后得到细粉状标题化合物。
实施例9-1由化合物36制备化合物31于室温和搅拌下将1.2mmol TEA和1.1mmol所选择的试剂(见表)加至1mmol GE2270因子A3的合适酰胺衍生物(按照前面实施例所述的方法制备)的10ml 10%甲醇的氯仿溶液中。20min后“真空”蒸发溶剂，并用5%Na2CO3水溶液处理残余物。所得固体经过滤、再用5%Na2CO3和水洗涤，再溶于10ml甲醇中。向该溶液中加入0.5ml水和0.1mmol对-甲苯磺酸，并将反应混合物于室温下搅拌过夜。真空浓缩溶液至少体积(约2ml)并加水沉淀标题化合物，风干后得到细粉状标题化合物。
实施例9-2由化合物37制备化合物38于室温和搅拌下，将9.2mmol乙酸、9.2mmol乙酸钠和0.506mmol所选择的试剂(见表Ⅱ)加至0.23mmol GE2270因子A3的合适酰胺衍生物(按前面实施例所述方法制备)的40ml乙醇溶液中。2h后加入0.46mmol NaBH4(Fluka)并于同一温度下搅拌过夜。蒸发溶剂，得到粗产物，并用10ml 1N Hcl洗涤，过滤和风干。然后固体经硅胶60(230-400目ASTM-Merck)快速层析纯化，用0-10%甲醇的二氯甲烷溶液洗脱。合并含有标题化合物的甲基酯(中间产物)的部分。蒸发溶剂，将产生的固体再溶于2ml二噁烷中，并于室温下用1.2mol过量的1N NaOH处理过夜。蒸发溶剂，将得到的固体与1∶1的乙酸乙酯和甲醇的混合液一起研磨而进一步纯化，得到细粉状的标题化合物。
方法D一起始物GE2270因子A2与所选择的胺反应实施例10制备化合物35
将1mmol GE2270因子A2(按照欧洲专利申请公开号406745所述的方法制备)溶于10ml氨饱和的甲醇溶液中。该溶液于室温下放置3天后，“真空”蒸发溶剂。残余物溶于2ml甲醇中，并用水沉淀标题化合物。过滤并风干。与乙醚一起研磨后得到细粉状标题化合物。
方法E-制备本发明化合物的盐实施例11制备化合物19的精氨酸盐在搅拌下将423mgL-精氨酸(2.42mmol)的120ml水溶液加至3g化合物19(2.42mmol)的180ml二噁烷的悬浮液中，并冷冻干燥浑浊溶液以得到所需的盐。
方法F-起始物GE2270成分C2a(即其中R为甲氧基甲基、R1为甲基、R4为羟甲基并且W为COOH的式Ⅱ化合物)与所选择的含有其它活性官能团(均被保护)的胺反应，随后脱去保护基团。
实施例12制备化合物42按照实施例3所述的方法并且用起始物GE2270成分C2a代替因子A3进行反应。
方法G-方法F中所述的起始物GE2270成分C2a与所选择的含有未被保护的酸残基的胺反应实施例13制备化合物42按照实施例5所述方法用起始物GE2270成分C2a代替因子A3进行反应。
方法H-起始物GE2270成分D1(即其中R和R1为氢、R4为甲基并且W为COOH的式Ⅱ化合物)与所选择的含有其它活性官能团(均被保护)的胺反应，随后脱去保护基团。
实施例14制备化合物43按照实施例3所述方法并且用起始物GE2270成分D1代替因子A3进行反应。
方法Ⅰ-方法H中所述的起始物GE2270成分D1与所选择的含有未被保护的酸残基的胺反应实施例15制备化合物43按照实施例5所述的方法并且用起始物GE2270成分D1代替因子A3进行反应。
方法J-起始物GE2270成分D2(即其中R为羟甲基、R1和R4为甲基、W为COOH的式Ⅱ化合物)与所选择的含有其它活性官能团(均被保护)的胺反应，随后脱去保护基团。
实施例16制备化合物44按照实施例3所述的方法并且用起始物GE2270成分D2代替因子A3进行反应。
方法K-方法J中所述的起始物GE2270成分D2与所选择的含有未被保护的酸残基的胺反应。
实施例17制备化合物44按照实施例5所述的方法并且用起始物GE2270成分D2代替因子A3进行反应。
方法L-抗菌素GE2270的较少成分(C2a、D1、D2和E)的混合物(起始物)与所选择的含有其它活性官能团(均被保护)的胺反应，随后脱去保护基团。
实施例18按照实施例3所述的方法并且用抗菌素GE2270的较少成分(C2a、D、D2和E)的混合物(起始物)代替因子A3和6-氨基己酸甲酯盐酸盐(Fluka)进行反应。Rt(min)参见HPLC分析部分所述的HPLC方法M。
当Y＝-NHCH2CH2CH2CH2CH2COOCH3时，GE2270因子C2a、D1、D2和E的Rt(min)分别为43.43、39.42、42.29和37.41。
当Y＝-NHCH2CH2CH2CH2CH2COOH时，GE2270因子C2a、D1、D2和E的Rt(min)分别为17.23、15.76、16.64和15.13。
方法M-所选择的抗菌素GE2270的较少成分(C2a、D1、D2和E)的混合物(起始物)与所选择的含有未被保护的胺反应实施例19按照实施例5所述的方法，并且用所选择的抗菌素GE2270的较少成分(C2a、D1、D2和E)的混合物(起始物)代替因子A3和6-氨基己酸(Fluka)进行反应Rt(min)参见HPLC分析部分所述的方法M.GE2270因子C2a、D1、D2和E的Rt(分)分别为17.23、15.76、16.64和15.13。
制备起始物1.以下起始物购自Fluka(Fluka，Chemika-Biochemika，Buchs，Switzerland)甘氨酸乙酯盐酸盐，L-苏氨酸甲酯盐酸盐，L-酪氨酸甲酯盐酸盐，L-亮氨酸甲酯盐酸盐，L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐，L-甲硫氨酸甲酯盐酸盐，L-脯氨酸甲酯盐酸盐，Na-Cbz-L-赖氨酸，4-氨基丁酸甲酯盐酸盐，6-氨基己酸甲酯盐酸盐，6-氨基己酸，4-(甲基氨基)苯甲酸，哌啶-4-羧酸，N-甲基-D-葡糖胺，D(+)-葡糖胺盐酸盐，2-二甲基氨基乙胺，氨基乙醛缩二甲醇，
β-丙氨酸乙酯盐酸盐。
2.以下起始物购自Sigma(Sigma，BiochemicalsOrganicCompounds，St.LouisU.S.A.)Nδ-Cbz-L-鸟氨酸，L-天冬氨酸二甲酯盐酸盐。
3.以下起始物购自Aldrich(Aldrich，CatalogoProdottidiChimicaFine，Milano，Itanly)L-脯氨酰胺，牛磺酸，3-氨基-1-丙烷磺酸，3-氨基丙基膦酸，4-氨基-1-苄基哌啶。
4.为制备抗菌素GE2270因子A、B1、B2、C1、C2、C2a、D1、D2和E而生产抗菌素GE2270。
将玫瑰游动双孢菌ATCC53773的培养物在燕麦粉琼脂斜面上于28-30℃培养两周。然后用于接种500ml烧瓶内含100ml具有如下组成的种子培养基淀粉20g/l聚胨5g/l酵母浸膏3g/l牛浸膏2g/l大豆粉2g/l碳酸钙1g/l蒸馏水(定容)100ml
(灭菌前调节pH至7.0)将烧瓶在旋转振荡器(200rpm)上于28-30℃培养92h。然后用所得的培养物接种4l发酵罐内含有的培养基，并于搅拌(约900rpm)和通气(约1标准升/容积/分的空气)下将培养物于28-30℃培养48h。
将所得的培养液转移至含有50l下列培养基的发酵罐中淀粉20g/l胨2.5g/l水解的酪蛋白2.5g/l酵母浸膏3g/l牛浸膏2g/l大豆粉2g/l碳酸钙1g/l蒸馏水适量(灭菌前将pH调至7.0)并于28-30℃培养约72h。
利用生长于Davis基本培养基上的枯草芽孢杆菌ATCC6633。通过纸盘琼脂检测法监测产生的抗菌素。于35℃培养过夜后对抑制区进行评估。
4a)制备抗菌素GE2270粗品收集上面所获得的发酵物质(50l)并用过滤器(Clarcell)过滤。
尽管也可从滤液中得到一定数量的抗菌素GE2270，但它主要存在于菌丝体中。
调节滤液的pH至约7.0，并用乙酸乙酯(50l)萃取。离心分离出有机相，并将其减压浓缩至小体积。然后用石油醚处理所得的油状残余物以析出抗菌素GE2270粗品。再经过滤收集和干燥后得到415mg抗菌素GE2270粗品。
用20l甲醇萃取菌丝体两次，所收集的萃取液经减压浓缩后得到水溶性残余物，用乙酸乙酯将其萃取两次。加入石油醚，从浓缩的有机相中析出抗菌素GE2270粗品(6.06g)。
4b-1分离抗菌素GE2270因子A将按照上面所述的方法从菌丝体获得的粗品(3g)溶于四氢呋喃，并在硅胶(230-400目)存在下减压浓缩。收集所得的固体残余物，并加到由300g硅胶(230-400目)和二氯甲烷(CH2Cl2)装填的层柱上。该柱子首先用二氯甲烷(2l)展层，接着用1.5l具有如下比例的二氯甲烷与甲醇的混合液展层98/2;96/4，94/6，92/8，90/10和88/12(V/V)。
收集各个部分，通过TLC、HPLC或对枯草芽孢杆菌的抗菌作用等进行分析，并按其抗菌素含量进行收集。
减压浓缩所收集的含有抗菌素GE2270因子A的部分，得到油状残渣，然后用四氢呋喃将其溶解。
向该溶液中加入石油醚以析出抗菌素GE2270因子A(600mg)。
4b-2分离抗菌素GE2270较少成分的混合物通过与每种单个成分的分析样品进行HPLC比较，确定一个尤其富含C2a、D1D2和E成分的代表性混合物。
Rt(min)参见HPLC分析部分所述的HPLC方法M，且GE2270因子C2a、D1、D2和E的Rt(min)分别为20.55、17.43、18.17和16.61。
该部分减压浓缩物为一油状残余物，将其重新溶于四氢呋喃并用石油醚沉淀后得到白色粉末。
4c)分离和纯化抗菌素GE2270因子B1、B2、C1、C2、D1、D2和E。
利用装有Nucleosil C18(用十八烷基硅烷使硅胶活化)(5μm)的250×20mm柱进行制备性HPLC，并用A相(CH2CN∶四氢呋喃∶40mMHCOONH4＝10∶40∶20)和B相(CH2CN∶四氢呋喃∶40mM HCOONH4＝10∶10∶80)的混合液进行洗脱，从上面所得的粗混合物中分离和纯化抗菌素GE2270因子D1、D2和E。将抗菌素混合物(6mg)溶于3mlB相和1mlA相，并注入HPLC柱中，用26∶74的A相与B相的混合液按14ml/min的流速洗脱。根据254nm处的UV吸收图谱收集洗脱成分。合并在随后层析时具有同一含量的部分，并减压浓缩以除去CH3CN。纸盘检测法表明残余溶液具有抗金黄色葡萄糖球菌的作用。将这些溶液至少冻干三次，从HPLC相中完全除去HCOONH4缓冲液残余物。
产量如下抗菌素GE2270因子E，11mg;抗菌素GE2270因子D1，12mg;抗菌素GE2270因子D2，10mg。
4d)含有抗菌素GE2270因子C2a与其它GE2270因子纯化混合物的分离合并6次重复发酵制得的粗GE2270因子并溶于12l CH2Cl2∶甲醇(93∶7)。过滤除去不溶物，并将含有抗菌素复合物的溶液加至用CH2Cl2∶甲醇(93∶7)平衡过的13mg(230-400目)硅胶柱上。用CH2Cl2∶甲醇(93∶7)从柱子上洗脱出抗菌素GE2270因子C2a。合并含有本发明抗菌素的部分(HPLC分析)，减压浓缩并干燥，得到23.5g抗菌素GE2270因子C2a及其它较少因子的混合物。
在用二氯甲烷(CH2Cl2)平衡过的含有400g硅胶(230-400目)的柱子上，将部分上述制品(5.5g)通过快速层析再次纯化。首先用二氯甲烷(1l)展层，然后用以下比例的二氯甲烷/甲醇系统混合液展层96/4(3l);94/6(1l);92/8(2l);90/10(6l)和88/12(4l)。
收集并浓缩主要含GE2270因子C2a(HPLC分析)的部分。加入石油醚后沉淀出抗菌素制品(646mg)。
4e)分离纯的抗菌素GE2270因子C2a从上述制品中通过制备性HPLC使主要含抗菌素GE2270因子C2a的纯化混合物进一步纯化。
将部分上述抗菌素制品(10mg)溶于1mlA相(CH3CN∶四氢呋喃∶40mM HCOONH4-40∶40∶20)和1mlB相(CH3CN∶四氢呋喃∶40mM HCOONH4-10∶10∶80)并注入HPLC250×20mm Hibar柱(E.Merck;Darmstadt F.R.Germany)，该柱子中填有用40%A相和60%B相的混合液平衡过的7μm Nucleosil C18(用十八烷基硅烷使硅胶活化)。按15ml/min的流速在22min内用40-50%A相进行线性梯度洗脱。于254nm处进行UV检测。随后将经过10次层析的含有本发明纯抗菌素的部分合并，并通过减压浓缩除去CH3CN。用水沉淀出抗菌素GE2270因子C2a。离心收集沉淀物，再经蒸馏水洗涤两次和真空干燥后得到66mg纯抗菌素。
5.制备抗菌素GE2270因子A2将抗菌素GE2270因子A(按上述方法制备)(86mg)溶于17ml95%乙醇和1.7ml乙酸。于60℃保温24小时后，所产生的溶液用0.1M磷酸钠调节至pH7.5。通过减压蒸发除去乙醇，水溶性残余物用乙酸乙酯(100ml)萃取两次。减压浓缩有机相，得到一固体残余物，将其用四氢呋喃溶解后，再加入石油醚使其沉淀。得到含有少量抗菌素GE2270因子A和A1的抗菌素GE2270因子A2(62mg)。通过下面的HPLC可获得纯的抗菌素GE2270因子A2。
将10mg上述粗产物溶于四氢呋喃中，用水稀释至溶解度的限度后注入HPLC系统，该系统含有填充了NucleosilRC18(5μm)逆相硅胶(Stacroma
)的柱子，以约15ml/min的流速用64%-93%B相在A相中的溶液进行线性梯度洗脱(20min)。该系统中，A相为18mM磷酸钠(pH7.2)和乙腈的混合液(90∶10(V/V))，B相为18mM磷酸钠(pH7.2)和乙腈的混合液(40∶60(V/V))。收集5次连续层析的部分，于330nm处进行UV监测。合并含有大量抗菌素GE2270因子A2的部分(对应于洗脱液UV图谱中的主峰)，减压浓缩得到水相，并用乙酸乙酯萃取两次。然后用蒸馏水洗涤该有机相以除去残余的无机盐，浓缩后以便析出固体残余物，再将其溶于四氢呋喃并用石油醚再次沉淀，得到纯的抗菌素GE2270因子A2(45mg)。
欧洲专利申请公开号406745叙述了制备抗菌素GE2270因子A主要反应产物的抗菌素GE2270因子A2的其它替代方法。
6.制备抗菌素GE2270因子A3于室温下将抗菌素GE2270因子A2在0.5M碳酸钠中保温1小时。然后用冷水稀释反应混合物，并用盐酸调至pH6.5。中和溶液含有作为主要反应产物的抗菌素GE2270因子A3。用乙酸乙酯从水相中萃取该抗菌素，然后通过加入石油醚从浓缩的有机相中沉淀出该抗菌素。
通过如下所述的柱层析得到纯的抗菌素GE2270因子A3。
将1.5g粗品GE2270A3溶于60ml甲醇与二氯甲烷混合液(1/1(V/V))中，并减压蒸发溶剂使粗品GE2270A吸附在硅胶(75-230目)上。然后将固体残余物加到经二氯甲烷平衡过的硅胶(75-230目)柱(柱高40cm)的顶端。按照如下顺序用甲醇在二氯甲烷中的混合液洗柱1)2%甲醇(450ml);2)5%甲醇(500ml);3)10%甲醇(600ml);4)15%甲醇(500ml);5)20%甲醇(500ml);6)30%甲醇(250ml)。
收集各部分并通过TLC和对枯草芽孢杆菌ATCC6633的细菌学检测法进行监测。抗菌素GE2270因子A3通常存在于含有约15-20%甲醇的洗脱液中。
合并含有所需产物的部分并减压浓缩。向残余物中加入石油醚后沉淀出抗菌素GE2270因子A3(854mg纯产物)。
7.由抗菌素因子D1、D2和C2a制备合适的起始物基本按照上面5和6中所述的方法，但用抗菌素GE2270的单个因子(C2a、D1、D2和E)为起始物代替因子A，可获得合适的式Ⅲ起始物，其中W为COOH或活性酯，R为氢或CH2OH，R1为CH3或氢，R4为羟甲基或甲基。
7a)由抗菌素GE2270的较少成分(C2a、D1、D2和E)的混合物制备合适的起始物基本按照上面5和6所述的方法，但用较少成分(C2a，D1、D2和E)的混合物为起始物代替单个因子A，可获得合适的式Ⅲ起始物，其中W为COOH或活性剂，R、R1和R4对于C2a分别为甲氧基甲基、甲基和羟甲基，对于D1分别为氢、氢和甲基，对于D2分别为羟甲基、甲基和甲基，对于E分别为羟甲基、氢和甲基。
Rt(min)参见HPLC分析部分中所述的HPLC方法M。
当W为活性酯时，GE2270因子C2a、D1、D2和E的Rt(min)分别为22.51、19.80、20.41、20.41和18.9。
当W为COOH时，GE2270因子C2a、D1、D2和E的Rt(min)分别为12.99、10.38、11.08和9.03。
8.制备甘氨酰-Nε-Cbz-L-赖氨酸三氟乙酸酯于0℃将4.8mlDPPA(22mmol)加至充分搅拌的3.5gBOC-甘氨酸(Fluka)(20mmol)和7.28gNε-Cbz-L-赖氨酸甲酯盐酸盐(Fluka)(22mmol)的50ml无水DMF溶液中。于0℃在10-15min内将5.8ml TEA(42mmol)的50ml无水DMF溶液加至上述溶液中。于0℃继续搅拌2h，然后于室温搅拌过夜。用250ml甲苯和500ml乙酸乙酯稀释反应混合物，并用1N盐酸(x3)、水、NaHCO3饱和溶液和盐水洗涤。经Na2SO4干燥蒸发溶剂后得到9.7g稠油状物，用任何方法都不能使其结晶。该油状物的NMR与BOC-甘氨酸-Nε-Cbz-L-赖氨酸甲酯的结构非常一致。
将该油状物溶于200ml丙酮/二噁烷(1∶1)，并于0℃在30min内于搅拌下将22ml 1N NaOH加至其中。该反应物于室温下搅拌45分钟，用300ml冷水稀释，用25ml 1N盐酸酸化并用氯仿(x3)和乙酸乙酯(x3)萃取。经Na2SO4干燥和蒸发溶剂后得到9.4g树胶状物，用任何方法均不能使其结晶。该树胶状物的NMR与BOC-甘氨酰-Nε-Cbz-L-赖氨酸的结构完全一致。
用20ml冷三氟乙酸(TFA)处理该树胶状化合物。于室温下该反应混合物，直至所有成分均成为溶液。冷却和真空下使溶液减至小体积，然后加入乙醚以使标题化合物沉淀。得到9.6g甘氨酸-Nε-Cbz-L-赖氨酸三氟乙酸酯，为白色粉末。NMR与其结构完全一致。
9.制备L-酪氨酰-L-脯氨酰胺于0℃将0.48mlDPPA(2mmol)加至充分搅拌的538mgBOC-L-酪氨酸(Fluka)(2mmol)，228.3mgL-脯氨酰胺(Aldrich)(2mmol)和168mgNaHCO3的5ml无水DMF溶液中。于室温下搅拌反应24h，然后用50ml水稀释并用氯仿(x3)萃取。用水洗涤有机相，经Na2SO4干燥，蒸发溶剂后得到-油状物。通过硅胶60(230-400目ASTM-Merck)快速层析进行纯化，并用己烷/丙酮(2∶3)洗脱。得到420mgBOC-L-酪氨酰-L-脯氨酰胺，为白色固体。NMR与其结构一致。
将所得固体溶于6ml乙酸乙酯，并在4ml3N盐酸存在下于室温搅拌48h。然后将反应混合物真空蒸发干燥，并将残余物再溶于乙醇中，用乙醚沉淀，得到302mgL-酪氨酰-L-脯氨酰胺的白色粉末。NMR与结构完全一致。
10.制备8-氨基辛酸甲酯和11-氨基十一烷酸甲酯对-甲苯磺酸盐将40mmol所选择的氨基酸(Fluka)和15.2g对-甲苯磺酸-水合物(Fluka)(80mmol)的200ml甲醇溶液回流过夜。然后真空蒸发溶剂并将残余物再溶于乙醚。一段时间之后标题化合物定量地结晶出来。这两个化合物的NMR与其结构一致。
11.制备5-氨基戊基膦酸将3.48g5-氨基-1-戊醇(Fluka)(33.7mmol)和5.0g邻苯二酐(Fluka)(33.7mmol)一起于180℃熔融。一直维持该温度90min，直至无水产生为止。然后将反应冷却至室温，油状混合物在硅胶60(230-400目ASTM-Merck)上层析，用2%甲醇的氯仿溶液洗脱，得到5.9g纯油状物。NMR与其结构一致。
向5.9g油状中间产物(25mmol)中分批加进1.6mlpBr3(17mmol)，以控制放热反应。将反应混合物于100℃加热1.5h后倒入碎冰块中，过滤所分离的固体物质并让其风干过夜。得到6.6g纯的溴代中间物。其质谱数据与计算的分子量一致。
将500mg纯的溴代中间物(1.69mmol)和140mg亚磷酸三乙酯(Fluka)(0.84mmol)一起于150℃加热约1h，然后在同样温度下按照30min的间隔将另外三份140mg的亚磷酸三乙酯分批加入。当所有起始物消失后，蒸馏掉过量的亚磷酸三乙酯。将粗产物在硅胶60(230-400目ASTM-Merch)上快速层析纯化，并用2%甲醇的二氯甲烷溶液洗脱。得到468mg所需亚磷酸二乙酯，为粘稠状物。NMR确证其结构。
于室温下将3ml 0.2M肼的甲醇溶液与468mg亚磷酸二乙酯中间物反应过夜。过滤除去析出的邻苯二甲酰肼，并将残余的溶液真空蒸发干燥。残余物溶于1N盐酸中，溶液用乙酸乙酯洗涤、NaOH碱化并用正丁醇萃取数次。再经Na2SO4干燥丁醇相并蒸发干燥后，得到175mg粘稠的油状物，其NMR与所需产物的结构一致。
将175mg5-氨基戊基膦酸二乙酯在0.6ml浓盐酸中回流20h。然后在正丁醇存在下通过共沸蒸馏将酸性溶液蒸发至干燥。经NMR确证，玻璃状油为5-氨基戊基膦酸。
12.制备5-(5-氨基戊基)四唑于0℃及搅拌条件下，将12.48ml氯甲酸苄酯(Fluka)(88mmol)滴加至10ml6-氨基己腈(Fluka)(80mmol)和13.3mlTEA(96mmol)的80ml四氢呋喃溶液中。继续于室温下搅拌2h，并真空蒸发溶剂。残余物溶于乙酸乙酯中，并用1N盐酸和水洗涤，再经Na2SO4干燥和蒸发溶剂后得到19.6g浆状物，其NMR与结构一致。
在793mg叠氮化钠(12.2mmol)和834mg三乙胺盐酸盐(6.1mmol)存在下，将1g被保护的6-氨基己腈(4.06mmol)的40ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液在氩气中于150℃加热。4h后，用120ml水稀释反应混合物。并用10%盐酸小心酸化至pH1(注意形成azotidricacid)。用乙酸乙酯萃取溶液，再用10%NaOH水溶液(x2)萃取有机相，所得的碱性溶液用乙醚洗涤、用浓盐酸酸化并用乙酸乙酯萃取(x3)。干燥并蒸发有机相后得到一浆状物。用甲醇/水结晶后得到260mg细粉。NMR和质谱确证了其结构。
于室温下将250mgN-保护的氨基四唑(0.86mmol)用5ml苯硫基甲烷(43.25mmol)和17.5ml三氟乙酸处理3小时。在冷却下真空浓缩三氟乙酸，并加入乙醚以析出标题化合物，它为三氟乙酸盐。NMR和质谱确证了它的结构。
13.制图N-〔3，4-二-(O-四氢吡喃)苯甲酰〕-噻唑烷-2-硫酮在0.325ml浓H2SO4存在下，将4.62g，3，4-二羟基苯甲酸(Fluka)(30mmol)的40ml甲醇溶液回流24小时。冷却溶液至室温后，加入一定量的固体NaHCO3，并真空蒸发溶剂。残余物溶于乙酸乙酯中，用水洗涤，再经Na2SO4干燥蒸发溶剂后得到浆状物，用乙酸乙酯/己烷将其结晶，得到3.53g白色结晶。
于室温和搅拌下，将9.1ml二氢吡喃(Fluka)(0.1mol)和250mg对-甲苯磺酸吡啶鎓(1mmol)加至1.68g3，4-二羟基苯甲酸甲酯(10mmol)的4ml乙酸乙酯和25ml二氯甲烷溶液中。4天后，反应混合物用NaHCO3饱和溶液洗涤，用Na2SO4干燥，再经蒸发干燥后得到3.36g油状物，未经进一步纯化它可直接用于下一步骤中。
将上面反应中所得的粗产物溶于40ml丙酮，并向该搅拌溶液中加入20ml水、2.76gK2CO3(20mmol)和10ml 1N NaOH水溶液(10mmol)，于室温下继续搅拌7天。真空蒸发丙酮并用乙酸乙酯洗涤残余的水相。然后将水相转移至含有等体积氯仿的锥形瓶中，冷却至0℃，并在激烈搅拌下用50ml 1N盐酸小心酸化。然后再用氯仿萃取水相三次，合并后的有机层经0.2%甲酸铵洗涤、Na2SO4干燥和蒸发干后得到浆状物，加入己烷结晶后，得到2.34g白色固体，NMR与其结构相符。
于0℃向644mg苯甲酸中间产物(2mmol)的14ml乙酸乙酯/二氯甲烷(5∶2)搅拌溶液中依次加入333mg2-噻唑啉-2-硫醇(Fluka)(2.8mmol)、577mgN，N′-二环己基碳二亚胺(Fluka)(2.8mmol)和35mg4-二甲基氨基吡啶。继续于室温下搅拌过夜，过滤除去析出的二环己基脲并真空蒸发黄色溶液后得到一黄色油状物，在硅胶60(230-400目ASTM-Merck)快速层析(用25%丙酮的己烷溶液洗脱)纯化该油状物。用丙酮/己烷结晶得到700mg黄色结晶。NMR和IR确证该化合物就是标题化合物。
14.制备N1-N8-二-叔-丁氧羰基亚精胺在搅拌下将5.8g亚精胺(Aldrich)(40mmol)和40ml脱气THF溶液冷却至0℃，然后在氩气下将19.72gBOC-ON(Aldrich)(80mmol)的60ml脱气THF溶液在1h内滴加至其中。然后将反应于室温下搅拌过夜，接着蒸发至干燥。残余物溶于乙醚中，用1N NaOH(×4)和水(×4)洗涤，Na2SO4干燥，并将溶剂真空浓缩至小体积。加入乙醚后，析出11g白色粉末，通过NMR确证它就是标题化合物。
15.制备N-叔-丁氧羰基亚丙基二胺于室温和搅拌下，向溶于10ml二噁烷、10ml水和3.3ml三乙胺混合液的2g3-氨基丙腈富马酸盐(Aldrich)(15.6mmol)溶液中加入4.2gBOC-ON(Aldrich)(17.2mmol)，3小时后，再用水稀释反应混合物，并用二氯甲烷(×3)萃取。合并有机层，用1N NaOH水溶液(×3)和水(×3)洗涤，Na2SO4干燥并蒸干。残余的油状物溶于乙醚中并用己烷沉淀后得到2.2g白色粉末。
将1gN-BOC-保护的中间产物(5.9mmol)的7ml 1N乙醇NaOH溶液在130mg阮内镍(50%的水浆，pH＞9)(Aldrich)于40psi氢化40h。过滤除去阮内镍，并蒸发溶剂至干燥。残余物溶于乙酸乙酯中，再经1N NaOH水溶液洗涤、Na2SO4干燥和真空除去溶剂，得到950mg无色油状物，它在放置后固化。经NMR确证它就是标题化合物。
16.制备3-(2-氨基乙硫基)丙酸甲酯三氟乙酸盐于室温及搅拌条件下，将1.4g二-叔丁基二碳酸酯
(Aldrich)(6.48mmol)的5ml CH2Cl2溶液加至0.5g半胱胺(Fluka)(6.48mmol)的5ml CH2Cl2溶液中。30min后，蒸发有机溶剂，并将粗品溶于5ml无水乙醇中。然后依次向该乙醇溶液中加入2.7ml TEA(19.1mmol)和1.07ml3-溴丙酸甲酯(Fluka)(9.57mmol)。反应在约30min内完成。真空除去乙醇，并用15ml氯仿代替。再经水洗涤有机相、Na2SO4干燥和蒸发溶剂后，得到一油状物。最后于0℃将其用1ml三氟乙酸处理5min。蒸干后得到270mg浅黄色油状物。NMR和IR确证它就是标题化合物。
17.制备6-氨基-2(E)-己烯酸于室温和搅拌下，将1.5ml苯甲酰氯(Fluka)(12.9mmol)的5mlCH2Cl2溶液在30min内加至2ml4-氨基-丁醛缩二乙醇(Fluka)(11.6mmol)和3.6ml TEA(25.6mmol)的5mlCH2Cl2溶液中。1h后，用10ml以上的CH2Cl2稀释反应物，用水洗涤，用Na2SO4干燥有机相，并将体调至20ml。然后在1.6ml TEA(11.5mmol)、10.2g二-叔丁基二碳酸酯(Aldrich)(46.8mmol)和1.4g4-二甲基氨基吡啶(Fluka)(11.5mmol)存在下，于室温和氩气中将所得溶液反应3天。除去溶剂后得到棕色油状物，在硅胶60(230-400目ASTM-Merck)上快速层析纯化(用20%乙酸乙酯的正己烷溶液洗脱)，得到1.6gN，N-去保护的4-氨基丁醛缩二乙醇，为无色油状物。NMR确证了它的结构。
然后将所得的油状物溶于5mlTHF中，并在室温下用5ml 1N HCl处理3h。真空除去THF，残余溶液用氯仿洗涤(2ml×3)，然后用NaHCO3溶液和水洗涤有机相，经Na2SO4干燥，蒸干后得到一油状物，未经进一步纯化将其直接用于下一步骤。
于0℃和氩气条件下向160mg60%NaH(4mmol)的5ml无水THF悬浮液中加入0.837ml三乙基膦酰基乙酸酯(Fluka)(4.3mmol)。30min后，加入上面所得的醛(1.17g)(4.02mmol)的无水THF(2ml)溶液，并将温度升至室温。将反应搅拌过夜，然后于0℃加入50mg以上的60%NaH。在室温下再经过2h后，用稀盐酸(10ml)处理反应混合物，并用乙酸乙酯(5ml×3)萃取。合并有机相，用水洗涤，经Na2SO4干燥，并蒸干。粗品经硅胶60(230-400目ASTM-Merck)快速层析并用15%乙酸乙酯的正己烷溶液洗脱，得到765mg浆状物。NMR确证它就是所需的产物，其E构型中具有双键(J＝16Hz)。
在室温及搅拌条件下，将6.15ml 1N LiOH(6.15mmol)加至739mg前面所获得的不饱和酯(2.05mmol)的10mlTHF溶液中。当起始物消失后，将反应混合物于30℃(浴温)下真空浓缩。用1NHCl酸化水溶液至pH2，然后用乙酸乙酯萃取。合并后的有机相用Na2SO4干燥，再经过滤和蒸发溶剂后得到一油状物，它在真空下静置后固化。NMR和MS确证它就是6-N-BOC-氨基-2(E)-己烯酸。
于0℃在纯三氟乙酸中脱去N-BOC保护得到标题化合物，接着与合适的GE2270起始物偶联。
18.制备3-(2-氨基乙氧基)丙酸三氟乙酸盐在-18℃、搅拌和氩气下，将3.88ml1.6M丁基锂(Fluka)(6.22mmol)溶液加至1gN-BOC-乙醇胺(6.22mmol)〔按照标准方法由乙醇胺(Fluka)制备〕的10ml无水THF溶液中。30min后，加入1.3g3-溴丙酸叔丁酯〔按照标准方法由B-溴丙酸(Fluka)制得〕(6.22mmol)，将温度升至室温，并在该温度下搅拌所产生的混合物20h。用水稀释后，用正己烷(5ml×2)萃取反应混合物，除去溶剂后得到粗品。再经硅胶60(230-400目ASTM-Merch)快速层析纯化(用20%乙酸乙酯的正己烷溶液洗脱)，得到1.43g油状物。NMR确证它就是偶联化合物。
将偶联化合物完全去保护后，紧接着在搅拌和室温下将其加至合适的GE2270起始物的三氟乙酸中，并搅拌约5min，真空除去三氟乙酸后得到标题化合物。
权利要求
1.具有如下通式Ⅰ的抗菌素GE2270的酰胺衍生物以及药用的加成盐
其中R代表氢、羟甲基或甲氧基甲基；R1代表氢或甲基；Y代表下式基团，
其中R2代表氢、(C1-C4)烷基、氨基(C2-C4)烷基、(C1-C4)烷基氨基-(C1-C4)烷基或二-(C1-C4)烷基；R3代表氢；带有1～3个以下取代基的线性或带支链的(C1-C4)烷基；羧基；磺基；膦酰基；可被低级烷氧羰基或苄氧羰基任意保护的氨基；(C1-C4)烷氧氨基(其中烷氧基部分可被羧基任意取代)；二-(C1-C4)烷基氨基、羟基、卤素、(C1-C4)烷氧基(其中烷基部分可被羧基任意取代)；(C1-C4)烷氧羰基、巯基、(C1-C4)烷硫基(其中烷基部分可被羧基任意取代)；可被1-3个选自羧基、磺基、羟基卤素和巯基的取代基任意取代的苯基、氨基甲酰基、(C1-C6)烷基氨基甲酰基(其中烷基部分可被1-2个选自羧基、氨基、(C1-C4)烷基氨基和二-(C1-C4)烷基氨基的取代基任意取代)；二-(C1-C4)烷基氨基甲酰基(其中烷基可与相邻的氮原子一起代表-五-七元杂环，在该杂环的一个环碳原子上可被羧基或氨基甲酰基任意取代，而且该杂环还可任意含有选自O、S和N的另外的杂原子)；苯甲酰氨基(其中苯基可被1-3个羟基取代)；不饱和、部分饱和或完全饱和的含氮五-六元杂环，并且该杂环还可含有1-3个选自N、S和O的杂原子(其中环碳原子之一可任意地带有羧基、磺基、羧基(C1-C4)烷基和磺基(C1-C4)烷基，且该环氮原子可被(C1-C4)烷基、羧基(C1-C4)烷基、磺基(C1-C4)烷基和苄基任意取代]；C3-C6)链烯基(可被羧基或磺基任意取代)；1-脱氧-1-山梨糖基；2-脱氧-2-葡糖基；完全饱和的五～七元含氮杂环[其中氮原子可被(C1-C4)烷基或苄基任意取代，且环骨架的1个或2个碳原子可带有选自(C1-C4)烷基，羧基和磺基的取代基]；或R2和R3与相邻的氮原子一起共同代表一完全饱和的五～七元杂环，该杂环可任意含有选自O、S和N的另外的杂原子，且在环碳原子上可任意地带有选自(C1-C4)烷基、苄基、羧基、磺基、羧基(C1-C4)烷基和磺基(C1-C4)烷基的1个或2个取代基；R4代表氢、甲基或羟甲基；条件是，当R4为氢或羟甲基时，则R同时为甲氧基甲基，且R1为甲基。
2.按照权利要求1所述的化合物，其中R代表甲氧基甲基，且其它取代基的定义同权利要求1。
3.按照权利要求1所述的化合物，其中R代表甲氧基甲基，R1和R4代表甲基，Y代表下式基团，
其中R2为氢，R3的定义同权利要求1。
4.按照权利要求1的所述的化合物，其中R为甲氧基甲基，R1和R4代表甲基，Y为氨基，该氨基来自例如甘氨酸、鸟氨基、丝氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、赖氨酸等天然氨基酸，或来自例如甘氨酰赖氨酸、丝氨酰脯氨酸、甘氨酰脯氨酰胺、酪氨酰脯氨酰胺、苏氨酰脯氨酰胺或亮氨酰脯氨酰胺等合成的二肽。
5.按照权利要求1所述的化合物，其中R为甲氧基甲基，R1和R4为甲基，Y为NR2R3〔其中R2为氢，R3为被选自COOH、SO3H和PO3H2的基团所取代的直链烷基，其碳原子数为3-12个较好，为3-7个更好〕。
6.按照权利要求1所述的化合物，其中R为甲氧基甲基，R1和R4为甲基，Y为NR2R3基团(其中R2为氢，R3为CH2CH2CH2CH2CH2-COOH)。
7.按照权利要求1所述的化合物，其中R代表氢、羟甲基或甲氧基甲基，R1代表氢或甲基，R4代表氢、甲基或羟甲基，Y代表下式基团，
(其中R2为氢，R3的定义同权利要求1)。
8.按照权利要求7所述的化合物，其中Y为氨基，该氨基来自例如甘氨酸、乌氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苏氨酸、赖氨酸等天然氨基酸或来自例如甘氨酰赖氨酸、丝氨酰脯氨酸、甘氨酰脯氨酰胺、酪氨酰脯氨酰胺、苏氨酰脯氨酰胺、亮氨酰脯氨酰胺等合成的二肽。
9.按照权利要求1所述的化合物，其中R为氢、羟甲基或甲氧基甲基，R1为氢或甲基，R4为氢、甲基或羟甲基，Y为NR2R3基团(其中R2为氢，R3为被选自COOH、SO3H和PO3H2的基团取代的直链烷基，其碳原子数为3-12个较好，为3-7个更好)。
10.按照权利要求1所述的化合物，其中R为氢、羟甲基或甲氧基甲基，R1为氢或甲基，R4为氢、甲基或羟甲基，Y为NR2R3基团(其中R2为氢，R3为CH2CH2CH2CH2CH2-COOH)。
11.一种制备权利要求1所述化合物的方法，它包括在惰性有机溶剂中将抗菌素GE2270化合物(式Ⅱ)与所选择的式HNR2R3胺(其中R2和R3的定义同权利要求1)反应，
其中W代表羧基或活性酯官能团;R代表氢、羟甲基或甲氧基甲基;R1代表氢或甲基;R4代表氢、甲基或羟甲基;条件是当R4为氢或羟甲基时，R同时为甲氧基甲基，R1为甲基，并且当W为羧基时在缩合剂存在下进行。
12.按照权利要求11所述的方法，其中缩合剂系选自(C1-C4)烷基、苯基或杂环基磷酰叠氮酯，如磷酰叠氮二苯酯(DPPA)、磷酰叠氮二乙酯、磷酰叠氮二(4-硝基苯基)酯，磷酰叠氮二吗啉基酯和磷酰氯二苯酯。
13.按照权利要求11和12所述的方法，其中相对于抗菌素起始物胺反应物HNR2R3应用1-2倍过量的摩尔，且反应温度为0-20℃。
14.应用权利要求1-10中任一项所述的化合物作为药物。
15.含有权利要求1-10中任一项化合物作为有效成分以及可药用载体组成的混合物的药用组合物。
16.应用权利要求1-10中任一项的化合物制备用作为抗菌素药物。
全文摘要
本发明涉及抗菌素GE2270化合物的新的酰胺类衍生物及其制备方法。该酰胺类衍生物是作用于革兰氏阳性和阴性细菌有效的抗菌剂。
文档编号A61P31/04GK1063110SQ92100038
公开日1992年7月29日 申请日期1992年1月3日 优先权日1991年1月3日
发明者P·塔韦恰瓦, S·洛西尔, R·查泊蒂, E·塞尔瓦 申请人:格鲁波莱佩蒂特公司